一种具有抗氧化活性的发酵荔枝汁及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及饮料技术领域，尤其涉及一种具有抗氧化活性的发酵荔枝汁及其制备方法和应用。

背景技术

荔枝由于其味道甜美且营养而深受人们的喜爱；荔枝果肉中含有多种营养成分和活性物质，如多糖、维生素、矿物质等，对肝脏、大脑、心脏都有益处。但荔枝是一种季节性水果，新鲜采摘的荔枝由于水分多，新鲜果实的保质期极短，容易变质，因此进一步加工如生产酒液、发酵果汁以延长货架期和满足市场需求是非常有效的方法。

γ-氨基丁酸(GABA)是一种重要的四碳游离非蛋白质氨基酸，在自然界微生物、植物、动物中分布广泛，具有多种生理功能。在哺乳动物体内，GABA是成熟中枢神经系统中主要的抑制性神经递质，在大脑的不同区域中都有高浓度的存在。GABA对多种疾病的预防和治疗中具有有益作用，如糖尿病、抑郁、焦虑、慢性失眠、阿尔茨海默症等，它还对大脑早期神经元的发育至关重要。特别的，GABA能信号是脑-肠轴的关键组成部分，肠道菌群可以通过产生活性化合物如GABA调节宿主应答，影响宿主行为。

目前化学合成的GABA被禁止用于食品，而微生物发酵产生的GABA被认为是相对安全的，具有抗氧化功能。因此，急需针对荔枝发酵食品开展抗氧化等功能研究。

发明内容

本发明提供了一种具有抗氧化活性的发酵荔枝汁及其制备方法和应用，以获得含大量GABA、乙酸、总多酚等有益物质的抗氧化发酵食品，对多种疾病的预防和治疗以及人体肠道健康有有益功能；同时提高DPPH自由基清除能力和FRAP铁离子还原能力，清除机体内的自由基，缓解机体衰老，增强机体免疫力。

为了解决上述技术问题，本发明目的之一提供了一种发酵荔枝汁，包括以下原料组分：5-50wt％荔枝汁、0.1-5wt％酵母提取物、0.1-5wt％谷氨酸钠和余量的水；所述发酵荔枝汁还包括有初始浓度为10

作为优选方案，所述荔枝汁为荔枝果经清洗、去皮去核、榨汁、过滤、离心后获得。

作为优选方案，包括以下原料组分：20wt％荔枝汁、0.5wt％酵母提取物、0.5wt％谷氨酸钠和余量的水，所述发酵荔枝汁还包括有初始浓度为10

为了解决上述技术问题，本发明目的之二提供了一种发酵荔枝汁的制备方法，包括以下步骤：

S1、将新鲜成熟的荔枝果用水洗净、去皮去核，荔枝果肉榨汁后过滤，再离心取上清液得到荔枝汁；

S2、将荔枝汁、酵母提取物、谷氨酸钠和水混合为混合荔枝汁，进行巴氏杀菌，然后冷却至35-40℃；

S3、将活化的短乳杆菌菌株HB-01使用无菌生理盐水洗涤后，再重悬至无菌水中，将短乳杆菌HB-01菌液接种到混合荔枝汁中，混合荔枝汁在36-38℃发酵40-50h。

作为优选方案，在S1中，荔枝果肉榨汁后使用5-10层洁净纱布和70-100目不锈钢筛过滤。

作为优选方案，在S2中，巴氏杀菌为在90-95℃下杀菌10-20mi n。

作为优选方案，在S3中，所述无菌生理盐水为8-10g/L的NaC l。

作为优选方案，在S3中，所述短乳杆菌HB-01菌液的浓度为10

为了解决上述技术问题，本发明目的之三提供了一种发酵荔枝汁在益生菌饮料中的应用。

相比于现有技术，本发明实施例具有如下有益效果：

1、本申请利用短乳杆菌HB-01发酵混合荔枝汁，经过对发酵过程中短乳杆菌HB-01活菌数目的测定，确定该种基质是短乳杆菌HB-01良好的发酵基质，该短乳杆菌HB-01发酵荔枝汁过程可以产生大量的GABA、乙酸、总多酚。其中GABA对多种疾病的预防和治疗中具有有益作用；乙酸作为短链脂肪酸，对人体肠道健康有好处，具有提升机体健康、改善肠道环境、维持肠胃稳态等有益功能；多酚类化合物具有良好的抗氧化效果，可以促进血液循环，对预防心脑血管疾病具有益处。

2.通过对短乳杆菌HB-01发酵荔枝汁过程中DPPH自由基清除率、铁离子还原能力(FRAP)变化的测定，明确该短乳杆菌HB-01发酵荔枝汁可以提高DPPH自由基清除能力和FRAP铁离子还原能力，获得的抗氧化发酵食品可以清除机体内的自由基，缓解机体衰老，增强机体免疫力，对疾病预防具有有益效果。

附图说明

图1：为本发明效果例一中实施例1发酵荔枝汁的pH随时间变化的统计图表；

图2：为本发明效果例一中实施例1发酵荔枝汁的总酸随时间变化的统计图表；

图3：为本发明效果例二中实施例1发酵荔枝汁的菌落数随时间变化的统计图表；

图4：为本发明效果例二中实施例1和对比例1发酵荔枝汁的GABA含量随时间变化的统计图表；

图5：为本发明效果例三中实施例1发酵荔枝汁的乙酸含量随时间变化的统计图表；

图6：为本发明效果例四中实施例1发酵荔枝汁的总多酚随时间变化的统计图表；

图7：为本发明效果例五中实施例1发酵荔枝汁的DPPH随时间变化的统计图表；

图8：为本发明效果例五中实施例1发酵荔枝汁的FRAP随时间变化的统计图表。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本申请中短乳杆菌菌株HB-01的CCTCC NO：M2022686；保藏时间为2022年5月20日；保藏单位为中国典型培养物保藏中心CCTCC；地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号；分类命名：Lactobacillus brevis HB-01；拉丁文学名：Lactobacillus brevis。

实施例一

一种具有抗氧化活性的发酵荔枝汁，包括以下制备步骤：

S1、将新鲜成熟的荔枝果用水洗净，去皮去核，荔枝果肉使用榨汁机搅拌。使用8层洁净纱布和80目不锈钢筛过滤，再使用离心机10000rpm、4℃离心10mi n，取上清液得到澄清荔枝汁水，使用前于-20℃保存；

S2、将20％(m/m)上述荔枝汁、0.5％(m/m)酵母提取物(安琪酵母牌),0.5％(m/m)谷氨酸钠和余量超纯水混合，在95℃下杀菌15mi n，然后冷却至35-40℃；

S3、将活化的短乳杆菌菌株HB-01使用无菌生理盐水(9g/L NaC l)洗涤3次，再重悬至无菌水中,根据比浊法调整菌株终浓度至10

S4、将活化的短乳杆菌HB-01按照1％(v/v)接种菌悬液到混合荔枝汁中，使得初始细胞密度为10

对比例一

一种发酵荔枝汁，其制备步骤中各试剂、工艺参数均与实施例一相同，不同的地方在于，在S3中，采用短乳杆菌C I CC 23474替代短乳杆菌HB-01，短乳杆菌C I CC 23474来源于上海鲁微科技有限公司。

对比例二

一种发酵荔枝汁，其制备步骤中各试剂、工艺参数均与实施例一相同，不同的地方在于，在S2中，谷氨酸钠含量为0。

对比例三

一种发酵荔枝汁，其制备步骤中各试剂、工艺参数均与实施例一相同，不同的地方在于，在S2中，谷氨酸钠采用

效果例一

研究实施例1发酵荔枝汁过程中pH和总酸的变化：

1.pH值使用数显式FE28 pH测量仪测定，结果如图1所示。

2.使用移液管吸取5m l样液加入10m l纯水中，再加入50μL酚酞指示剂(5g/L)，然后用0.1M的氢氧化钠标准溶液滴定混合液至微红色并在30s内不褪色，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积，根据如下公式计算总酸含量，结果如图2所示：

总酸(％)＝V

其中，V

如图1-2和表1所示，结果表明发酵48h后，实施例一样品总体pH值显著下降，可滴定酸度整体上升，pH值在0-16h内下降，发酵16h后达到最低值4.34，随后16h-48h的PH值逐渐上升，可滴定酸度在0-16h内上升到最高0.41％，16-24h维持稳定，24h-48h逐渐下降。

效果例二

研究实施例1发酵荔枝汁过程中活菌数的变化：

使用稀释涂布平板法确定样品中的活菌数目，将发酵果汁均匀混合后取0.6m l加入5.4m l纯水，随后进行多次连续十倍稀释，每个稀释度吸取50μL涂布于MRS固体培养基并在37℃培养48h，活菌计数按照l og

如图3和表1所示，结果表明活菌计数呈现先上升后稳定在同一数量级的现象，活菌数在0-16h内均显著上升，在16-48h内保持稳定，数量级稳定在8l og

表1-实施例1发酵荔枝汁的pH、总酸、菌落数随时间变化的统计结果

效果例三

研究实施例1和对比例1-3发酵荔枝汁过程中GABA(γ-氨基丁酸)含量的变化：

1.样品衍生处理：取发酵荔枝汁样品6000rpm/10mi n/18℃离心后取上清，将100μL样品上清液、100μL 0.5M NaHCO

2.HPLC定量测定GABA浓度：

色谱条件：WondaSi l C18-WR(4.6×250mm,5μm)；流动相:A相为100％甲醇，B相为50mm醋酸钠溶液(pH 6.2)、甲醇、四氢呋喃的混合物，混合比为840:150:10(v/v)；紫外检测器(254nm)；进样量20μl；流速1.0ml/mi n；柱温25℃；洗脱方式为梯度洗脱：0mi n,20％ A；3mi n,20％ A；18mi n,50％ A；22mi n,100％ A；24mi n,100％ A；25mi n,20％ A；30min,20％ A。

分别配置0、0.2g/L、0.4g/L、0.6g/L、0.8g/L、1.0g/L的GABA标准溶液，按照样品衍生方法进行衍生后按照上述色谱条件进行HPLC测定，根据峰面积与标准溶液的浓度得到线性回归方程(R

如图4和表2所示，结果表明对比例1的发酵荔枝汁基本不产生GABA，实施例1的发酵荔枝汁0-16h内基本不产生GABA，在16h-48h大量合成，48h达到GABA浓度最大值3.07±0.10g/L。

表2-实施例1和对比例1-3发酵荔枝汁的GABA含量随时间变化统计结果

效果例四

研究实施例1发酵荔枝汁过程中乙酸含量的变化：

1.样品处理：取发酵荔枝汁样品6000rpm/10mi n/18℃离心后取上清，进行HPLC测定。

2.HPLC定量测定乙酸浓度：

HPX-87H Co l umn(300*7.8mm)；流动相0.05％H2SO4(w/v)；示差检测器；进样量10μl；流速0.5m l/mi n；柱温60℃；洗脱方式为等度洗脱。

分别配置0.50g/L、0.75g/L、1.00g/L、1.25g/L、1.50g/L的乙酸溶液，按照上述色谱条件进行HPLC测定，根据峰面积与标准溶液的浓度得到线性回归方程(R

如图5和表3所示，结果表明发酵0-16h内乙酸含量增加0.38g/L左右，这是乙酸大量合成的阶段，而在发酵16-48h内乙酸增加的含量≤0.08g/L，乙酸是一种重要的短链脂肪酸，它作为胆固醇和脂质代谢的底物发挥重要作用，并参与饮食、肠道菌群和宿主能量代谢，与人体肠道稳态密切相关。

效果例五

研究实施例1发酵荔枝汁过程中总多酚含量的变化：

1.样品处理：取发酵荔枝汁样品6000rpm/10mi n/18℃离心后取上清，进行总多酚含量的测定。

3.紫外分光光度法定量测定总多酚含量：

将发酵果汁上清在纯水中稀释至终浓度为25％(v/v)，然后将稀释后的样品(0.6mL)与1.5mL150 g/L Na

如图6和表3所示，结果表明发酵48h混合荔枝汁的总多酚含量总体略有上升，增长率为6.20％；发酵0-16h内总多酚含量下降了7.18％，在16-32h内显著增加，32-48h内保持平稳。

效果例六

研究实施例1发酵荔枝汁过程中DPPH自由基清除率的变化：

1.样品处理：取发酵荔枝汁直接进行DPPH自由基清除率的测定。

2.紫外分光光度法测定DPPH自由基清除率：纯水中稀释至终浓度为20％(v/v)，然后将稀释后的样品(2.0mL)与0.2mM DPPH乙醇溶液混合，以纯净水替代样品为对照。混合物在25℃避光孵育30mi n后立即10000rpm,4℃离心10mi n，使用紫外分光光度计在517nm处测定上清吸光值。

根据如下公式计算DPPH自由基清除率：DPPH自由基清除率(％)＝(A0–At)/A0×100％；A

如图7和表3所示，结果表明短乳杆菌HB-01发酵荔枝汁显著增强了DPPH自由基清除能力，DPPH自由基清除率由最初的43.46％增长至发酵后的69.13％，在发酵0-32h内DPPH自由基清除率显著提高，在32-48h内保持稳定，结果证明短乳杆菌菌株HB-01对混合荔枝汁的DPPH自由基清除能力具有积极的影响。

效果例七

研究实施例1发酵荔枝汁过程中FRAP铁离子还原能力的变化：

1.样品处理：取发酵荔枝汁6000rpm/10mi n/18℃离心后取上清，进行FRAP的测定。

2.紫外分光光度法定量测定FRAP：将100mL NaAc(0.3M；pH3.6),10mL2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ；10mM；40mM HC l溶解)，10mL FeC l

如图8和表3所示，结果表明FRAP在发酵混合荔枝汁过程中总体升高，增长了67.48％，在发酵0-8h内，发酵混合荔枝汁的FRAP保持稳定；在8-32h内持续升高，在32-40h内保持平稳，在40-48h内略有下降。

表3-实施例1发酵荔枝汁的乙酸、总多酚、DPPH、FRAP随发酵时间变化的统计结果

通过对发酵过程中短乳杆菌HB-01活菌数目的测定，确定混合荔枝汁是短乳杆菌HB-01的良好发酵基质，可以确保发酵果汁中有足够的活菌数目(≥10

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步的详细说明，应当理解，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限定本发明的保护范围。特别指出，对于本领域技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。