牦牛瘤胃厌氧真菌和甲烷菌自然混合培养物发酵液在改善西门塔尔牛肉品质中的应用

技术领域

本发明涉及饲料添加剂技术领域，具体涉及牦牛瘤胃厌氧真菌和甲烷菌自然混合培养物作为粗饲料添加剂在改善牛肉品质中的应用。

背景技术

随着人们生活水平的提高，对肉品质的要求不断增加，低脂肪高蛋白牛肉受消费者青睐。影响反刍动物胴体和肉品质的因素有很多，归结起来可以分为两部分，即直接与动物本身相关的内部因素(如品种，年龄，性别等)和外部环境因素(如日粮，屠宰程序等)；其中，日粮是主要的因素之一，我们可以通过日粮调控来优化动物生产性能，提高牛肉品质。肉牛生长期间用高蛋白、低能量饲料，肥育期间用低蛋白、高能量饲料能满足脂肪沉积，利于形成大理石状花纹。精、粗饲料的比例对脂肪沉积也有一定的影响。一般认为，粗饲料喂养的动物肉质不如精料喂养的动物。牛肉品质的改善已越来越多被消费者和养牛生产者所重视，在肉品质控制上饲料营养起着重要的作用，因此在确定饲养方案时除满足牛的营养需求外，还必须考虑影响肉质的营养因素，进行适当的调控来改善牛肉品质，以满足消费者的需求。

我国是一个农业大国，主要农产品包括稻谷、小麦和玉米。根据中国年鉴统计2019年稻谷、小麦和玉米的产量分别为20961.4万t、13359.6万t和26077.9万t，因此会产生大量的秸秆废弃物。秸秆废弃物以玉米秸秆为主，其产量达到33092.9万t，占秸秆总产量的39.5％。玉米秸秆的主要成分包括木质素，纤维素和半纤维素。玉米秸秆作为动物饲料已有很长的历史，但粗纤维含量高，体积大，质地粗糙，营养成分少，可口性差。全株玉米青贮饲料已成为全世界范围内用于反刍动物日粮的主要饲料。但因其季节性收获的特点，加之农耕条件或习惯等原因，导致玉米秸秆通常在萎蔫或者干黄后才收获，水分和糖分流失严重。干黄的玉米秸秆的木质化严重，适口性差，不适宜直接饲喂反刍动物。但在偏远地区仍有很多农户将揉碎的干黄玉米秸秆作为黄牛日粮饲喂，导致家畜营养供给不够引起的生长发育迟缓与当地繁重的耕作作业不匹配，还会间接影响其繁殖性能和产肉产奶性能，导致经济效益发展缓慢。

饲料添加剂已经是改善饲料营养价值的有效途径，且育肥效果较好，例如刘翠娥研究发现，饲喂酒糟生物料，肉牛日增重和干物质饲料回报率显著高于饲喂鲜酒糟，经济效益比较显著。童丹等研究发现，使用5％发酵豆渣代替饲粮中的豆粕饲喂肉牛，不影响适口性，可显著提高肉牛料重比，有很好的推广价值。冶兆平研究发现，将紫花苜蓿添加到肉牛日粮中，比对照组增重率提高35.19％、饲料转化率提高36.14％，经济效益显著。但是，用啤酒糟等饲料饲喂肉牛，对牛肉品质影响不大。本领域技术人员对于改善牛肉品质也做了诸多研究，例如发明专利CN108576420A公开了一种提高牛肉品质的盐碱地植物饲料添加剂的制备方法，但其适用于盐碱地植物盐地碱蓬和盐角草，并不适用于玉米秸秆。

本发明提供了一种混合培养物，所述的混合培养物降解秸秆所产的高活性木质纤维素降解酶发酵液作为饲料添加剂加入玉米秸秆粗饲料后饲喂西门塔尔牛，能够显著提高其平均日增重量、平均日采食量，提高了西门塔尔牛的玉米秸秆粗饲料的中性洗涤纤维素消化率10.2％；平均日增重量增加695.0g；平均日采食量增加2.83kg；血液中葡萄糖(GLU)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)的含量显著高于对照组和空白组，增强了西门塔尔牛机体代谢能力；还提高了西门塔尔牛肉中甘氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸的含量和总氨基酸的含量2.50％，及单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸的总不饱和脂肪酸的含量7.01％，改善了西门塔尔牛肉品质。我们的研究首次证明：牦牛瘤胃厌氧真菌和甲烷菌混合培养物能够应用于西门塔尔牛的秸秆粗饲料中并发挥独特优势，具有广阔应用前景。

发明内容

针对上述技术问题，本发明的首要目的是提供牦牛瘤胃厌氧真菌和甲烷菌自然混合培养物作为饲料添加剂的应用，所述的牦牛瘤胃厌氧真菌和甲烷菌混合培养物为厌氧真菌(Neocallimastixfrontalis)和甲烷菌(Methanobrevibactergottschalkii)的共培养物YakQH5，所述的自然混合培养物YakQH5于2020年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19299，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，电话：010-64807355。

优选的，所述的混合培养物YakQH5在反刍动物瘤胃温度39℃的条件下，木聚糖酶活性为8235mU/mL，羧甲基纤维素酶活性为929mU/mL，阿魏酸酯酶活性是11.3mU/mL，乙酰酯酶活性是175mU/mL，香豆酸酯酶活性是2.8mU/mL，漆酶活性是67.5mU/mL，滤纸酶活1187mU/mL。

本发明的第二目的是提供牦牛瘤胃厌氧真菌和甲烷菌混合培养物以玉米秸秆为底物厌氧培养所产高活性发酵液在增强动物代谢能力中的应用，所述的混合培养物为厌氧真菌(Neocallimastixfrontalis)和甲烷菌(Methanobrevibactergottschalkii)的混合培养物YakQH5，所述的混合培养物YakQH5于2020年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19299，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，电话：010-64807355。

本发明的第三目的是提供牦牛瘤胃厌氧真菌和甲烷菌混合培养物以玉米秸秆为底物厌氧培养所产的高活性发酵液在促进动物生长中的应用，所述的混合培养物为厌氧真菌(Neocallimastixfrontalis)和甲烷菌(Methanobrevibactergottschalkii)的混合培养物YakQH5，所述的混合培养物YakQH5于2020年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19299，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，电话：010-64807355。

本发明的第四目的是提供一种牛饲料添加剂，包含所述的混合培养物YakQH5。

本发明的第五目的是提供一种牛饲料，用所述的混合培养物YakQH5发酵粗饲料。

优选的，所述的粗饲料为秸秆。

优选的，所述的秸秆为玉米秸秆。

本发明的第六目的是提供一种改善牛肉品质的方法，利用所述的牛秸秆粗饲料喂养牛。

优选的，所述的牛品种为西门塔尔牛。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：本发明首先提供了厌氧真菌(Neocallimastix frontalis)和甲烷菌(Methanobrevibactergottschalkii)的自然混合培养物YakQH5作为饲料添加剂的新用途，所述的厌氧真菌(Neocallimastixfrontalis)和甲烷菌(Methanobrevibactergottschalkii)的混合培养物YakQH5添加在饲料中，饲喂西门塔尔牛，能够显著提高其平均日增重量、平均日采食量，提高了西门塔尔牛的秸秆粗饲料的中性洗涤纤维素消化率10.2％；平均日增重量增加695.0g；平均日采食量增加2.83kg；血液中葡萄糖(GLU)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)的含量显著高于对照组和空白组，增强了西门塔尔牛机体代谢能力；还提高了西门塔尔牛肉中甘氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸的含量和总氨基酸的含量2.50％，及单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸的总不饱和脂肪酸的含量7.01％，改善了西门塔尔牛肉品质。我们的研究首次证明：牦牛瘤胃厌氧真菌和甲烷菌自然混合培养物能够应用于西门塔尔牛的秸秆粗饲料中并发挥独特优势，具有广阔应用前景。

附图说明

图1大理石花纹评分标准参照图

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的保护范围进行详细清楚的说明，应当说明的是，本发明的保护范围并不受以下实施例的限制。

实施例一、牦牛瘤胃厌氧真菌和甲烷菌混合培养物发酵液加入粗饲料后饲喂对牛的生长和肉品质的作用

1.试验设计与样品处理

(1)试验材料

玉米秸秆：取自甘肃省定西市通渭县升旭种植农民专业合作社，收集时间2020年12月，收集时含水量5.25％，属于干黄状态，粉碎至0.5～1cm备用。

将我们从青海省兴海县放牧牦牛瘤胃液中分离获得的厌氧真菌(Neocallimastixfrontalis)和甲烷菌(Methanobrevibacter gottschalkii)的自然混合培养物YakQH5在以玉米秸秆为底物(1％(w/v))厌氧培养72h的发酵液25mL接种在225mL液体厌氧真菌培养基中，以玉米秸秆为底物(1％(w/v))培养4d，将发酵液1000×g离心10min获得上清酶液备用，即为天然木质纤维素降解酶发酵液上清液。此上清液在西门塔尔牛的瘤胃条件下—即：pH 6.8、39℃时，

木聚糖酶活性为8235mU/mL，羧甲基纤维素酶活性为929mU/mL，阿魏酸酯酶活性是11.3mU/mL，乙酰酯酶活性是175mU/mL，香豆酸酯酶活性是2.8mU/mL，漆酶活性是67.5mU/mL，滤纸酶活1187mU/mL。

商品木聚糖酶：来自白银赛诺生物科技有限公司。粉末状木聚糖酶，酶活性为60万u/g，加蒸馏水溶解至饱和，弃沉淀后取上清液备用。

(2)试验动物的饲喂管理

试验动物为甘肃省定西市通渭县升旭种植农民专业合作社李岘村西门塔尔牛养殖场，每天饲喂3次，早上8:00、中午12:00、下午7:00，自由饮水。

日粮组成(风干基础％)：玉米秸秆90％，麦麸4％，豆粕3％，尿素1％，小苏打1％，碳酸钙1％。

(3)实验设计及样品采集

随机选取试验用9头牛分为3组分别标记，其中空白组3只西门塔尔牛(K1～K3)饲喂干黄玉米秸秆粗饲料，对照组3只西门塔尔牛(D1～D2)在饲喂前在干黄玉米秸秆粗饲料中加入商品木聚糖酶的饱和液，实验组3只西门塔尔牛(S1～S3)在饲喂前在干黄玉米秸秆粗饲料中加入厌氧真菌(Neocallimastixfrontalis)和甲烷菌(Methanobrevibactergottschalkii)的自然混合培养物YakQH5降解玉米秸秆所产的天然木质纤维素降解酶发酵液的上清液，试验预试期5d，正式期14d，在正式试验第一天开始先将9头牛进行48h空腹准备。将准备好的不同预处理的三组秸秆对试验牛进行饲喂，早晚各一次，自由饮水。

2.测定指标与测定方法

2.1生长性能测定

正式实验开始和结束时，试验西门塔尔牛均空腹禁食12h后，称重记为初重、末重，计算平均日增重。试验期间每日准确记录每组黄牛的给料量和剩料量，计算平均日增重量、料重比和平均日采食量。

平均日增重量(ADG)＝(末重-初重)/试验天数

平均日采食量(ADFI)＝每头牛试验期内的采食量/试验天数

料重比(F/G)＝平均日采食量/平均日增重量

2.2养分表观消化率的测定

取一定量样品烘干测定其水分含量和干物质(DM)，取烘干后的样品用粉碎机粉碎，然后过40目筛，取过筛后的样品测定干物质(DM)、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)，干物质(DM)测定采用105℃烘干法。木质纤维组分测定：NDF、ADF采用阿尔法F6800型纤维测定仪。

干物质消化率＝[(食入的干物质-排出的干物质)/干物质总量)]*100％

某养分的表观消化率＝[(某养分的食入含量-粪便中该养分的含量)/某养分的食入含量]*100％。

2.3血液生化指标的测定

试验最后1d晨饲前，每组西门塔尔牛采用含抗凝剂的抗凝管颈静脉采血，分析各组黄牛血液生化学指标[丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、甘油酸酯(TG)、葡萄糖(GLU)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)]。2.43组不同添加酶对西门塔尔牛的肉品质的影响

试验结束后，将每个组的肉牛进行屠宰，屠宰后取背最长肌样品，剔除表面筋膜和脂肪，进行肉品质评定。测定包括大理石花纹、等级、熟肉率、剪切力、系水力、pH；部分肌肉样品用锡纸包裹后，至于-20℃冰箱保存，用于粗灰分、粗蛋白和粗脂肪的测定。

(1)大理石花纹等级划分：大理石花纹按照NY/T 676-2010标准进行评定，评分标准如图1依次为1-5分。

(2)熟肉率测定：取屠宰后2h内背部最长肌100g做头，准确称量其质量，记为蒸煮前质量(m1)；在锅屉中蒸煮30min后，取出挂在室内阴凉处15～20min后准确称量其质量，记为蒸煮后质量(m2)。

熟肉率(％)＝100×(m

(3)剪切力测定：将待测肉样剪切为长度3～5cm，直径1cm左右，平整放入封口袋中，排出空气后封袋放在沸水中让肉样中心温度达到75℃，取出冷却，用CLM型肌肉嫩度仪测定剪切力，每个样品3个重复，记录并取平均值。

(4)系水力测定：在屠宰2h内，取第1、2腰椎处最长肌，切成1cm厚度的肉片，用感应量为0.0001kg的天平准确称量其质量，记为加压前质量(m1)；上、下各垫18层滤纸包住肉片放入加压其加压35kg保持5min后准确称量其质量，记为加压后质量(m2)。

系水力(％)＝100×(m1-m2)/m1

(5)pH测定：用H 9125便携式pH计测定宰后45min、24h背长肌的pH，分别几位pH(45min)、pH(24h)，每个样品检测3个重复，记录并取平均值。

(6)采集的肉样粉碎并在冷冻干燥器中冷冻干燥，采用凯氏定氮法测定粗蛋白含量，高温灼烧法测定粗灰分，索氏提取法测定粗脂肪含量。

(7)牛肉氨基酸含量的测定

肌肉氨基酸采用食品中氨基酸的测定方法(GB 5009.124－2016)：氨基酸分析仪测定。a.样品前处理：牛肉样本粉碎均匀后待水解；试样水解后转入进样瓶待测。

a.上机测定：色谱条件：磺酸星阳离子色谱柱；波长570nm和440nm；试样测定：混合氨基酸标准液与待测样先后以相同体积注入氨基酸分析仪，根据波峰面积计算试样氨基酸浓度。

(8)牛肉脂肪酸含量的影响

肌肉长链脂肪酸采用食品中脂肪酸的测定方法(GB5009.168－2016)：气相色谱仪测定。a.样品前处理：牛肉样本粉碎均匀后待水解；水解试样得到脂肪提取物；脂肪皂化及脂肪酸甲酯化得到待测液。b.测定：色谱操作条件：载气为99.9999％N2，尾吹流量30mL/min，H

3.数据分析

基础数据经Excel 2010初步整理并制作图表，利用SPSS 20.0软件对试验数据进行统计分析，采用单因子ANOVO模型处理，并用Duncan方法对数据进行多重比较分析，以平均值±标准差表示测定结果，P＜0.05代表数据存在显著性差异。

4.试验结果

4.1不同添加酶加入秸秆粗饲料对西门塔尔牛的生长性能的影响

表1 3组不同添加酶加入粗饲料的西门塔尔牛的生长性能

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由表1可以看出，用甲烷菌和厌氧真菌混合培养物预处理后的粗饲料饲喂西门塔尔牛后，其平均日增重量、平均日采食量均显著高于对照组和空白组(P>0.05)，空白组与对照组的料重比无显著性差异(P<0.05)，实验组料重比显著低于对照组和空白组(P>0.05)。

4.2不同添加酶加入秸秆粗饲料对西门塔尔牛营养物质表观消化率的影响

表2不同添加酶加入秸秆粗饲料的营养物质表观消化率

由表2可以看出，添加木聚糖酶的干黄玉米秸秆其干物质表观消化率与空白组差异不显著(P<0.05)，而添加瘤胃厌氧真菌和甲烷菌混合培养物的干物质表观消化率显著高于对照组与空白组(P>0.05)。实验组和对照组的中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维表观消化率相较于空白组差异显著(P>0.05)，其中实验组的NDF、ADF表观消化率显著高于空白组和对照组(P>0.05)，且实验组NDF、ADF表观消化率最高(P>0.05)。

4.3不同添加酶加入秸秆粗饲料对西门塔尔牛血液生化指标的影响

表3不同添加酶加入秸秆粗饲料的血液生化指标

由表3可以看出，实验组的ALT、AST和ALP均显著低于对照组和空白组(P>0.05)，对照组与空白组的TG差异不显著，实验组TG添加木聚糖酶的干黄玉米秸秆其干物质表观消化率与空白组差异不显著(P>0.05)，实验组GLU显著高于对照组(P>0.05)，实验组的TP、ALB和GLB含量显著高于对照组和空白组(P>0.05)。

4.4不同添加酶加入秸秆粗饲料对西门塔尔牛肉品质的影响

由表4可以看出，试验组的大理石花纹评分、熟肉率、干物质、粗蛋白、粗脂肪、粗灰分显著高于空白组与对照组(P>0.05)；pH值对照组与空白组无显著性差异(P<0.05)，试验组显著低于其他两组(P>0.05)；剪切力试验组显著低于空白组与对照组(P>0.05)，系水力试验组与空白组无显著性差异(P<0.05)，高于对照组(P>0.05)。

表4不同添加酶加入秸秆粗饲料对西门塔尔牛肉物理特性和营养物质的影响

4.5不同添加酶加入秸秆粗饲料对西门塔尔牛肉氨基酸含量的影响

由表5可以看出，相比空白组，试验组的牦牛肉中氨基酸总含量提高2.50％，并且牛肉氨基酸中的甘氨酸、天冬氨酸和苯丙氨酸含量增加，进一步改善了牛肉风味和品质。

表5不同添加酶加入粗饲料对西门塔牛肉中氨基酸含量的影响

4.6不同添加酶加入粗饲料对西门塔尔牛肉脂肪酸含量的影响

由表6可以看出，相比空白组，试验组的西门塔牛肉中单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸的总含量提高了7.01％，进一步改善了牛肉的保健功能，增强了牛肉的保健功效。

表6不同添加酶加入粗饲料对西门塔尔牛肉中脂肪酸含量的影响

综上所述，本发明首先提供了厌氧真菌(Neocallimastix frontalis)和甲烷菌(Methanobrevibactergottschalkii)的自然混合培养物YakQH5作为饲料添加剂的新用途，所述的厌氧真菌(Neocallimastixfrontalis)和甲烷菌(Methanobrevibactergottschalkii)的自然混合培养物YakQH5降解玉米秸秆的发酵液添加在玉米秸秆粗饲料中以后饲喂西门塔尔牛，能够显著提高其平均日增重量、平均日采食量，提高了西门塔尔牛的玉米秸秆粗饲料的中性洗涤纤维素消化率10.2％；平均日增重量增加695.0g；平均日采食量增加2.83kg；血液中葡萄糖(GLU)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)的含量显著高于对照组和空白组，增强了西门塔尔牛机体代谢能力；还提高了西门塔尔牛肉中甘氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸的含量和总氨基酸的含量2.50％，及单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸的总不饱和脂肪酸的含量7.01％，显著改善了西门塔尔牛肉品质。我们的研究首次证明：牦牛瘤胃厌氧真菌和甲烷菌自然混合培养物能够应用于西门塔尔牛的秸秆粗饲料中并发挥独特优势，具有广阔应用前景。