接骨木莓磁场发酵物的制备方法及其用途

技术领域

本案是关于一种接骨木莓(Sambucus nigra)发酵物的用途，特别是关于接骨木莓发酵物用于制备促进硬骨分化、增强免疫力或抗氧化的组合物的用途。

背景技术

随着环境变迁，紫外线指数及空气污染日益严重，阳光中紫外线辐射是造成肌肤损伤、老化、晒黑的主要原因，肌肤长期暴露在阳光下甚至会生成黑色素，形成斑点，难以消退。另外，阳光中紫外线辐射会促使肌肤细胞中产生活性氧物质(reactive oxygenspecies，ROS，亦称自由基)影响，导致肌肤老化、失去光泽、干燥等，甚至呈现泛红的状态。

另外，肌肤细胞随着年纪而逐渐老化，肤质日渐变得粗糙并产生皱纹，由于肌肤细胞的代谢速度减缓而导致肌肤的复原速度日渐变慢，再加上长期受到空气污染等外在的环境刺激，累积大量活性氧物质及黑色素等无法及时完全代谢，造成肌肤状况无法得到改善。

习知的化妆品、保养品及健康食品大多由化学成分所制成，长期使用不但对人体健康有害无益，更对较敏感的肌肤造成刺激，加剧肌肤泛红的情况，此外，制造过程对环境及生态不友善，造成环境污染，甚至通过排水系统而进入生态圈。

为了解决上述问题，本领域的技术人员亟需研发出具有对抗紫外线、抗氧化、抑制黑色素生成、减少肌肤红色斑点、舒缓泛红现象及提升肌肤的保湿能力的调理肌肤的组合物，以造福有此需求的广大族群。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种接骨木莓(Sambucus nigra)发酵物的制备方法及此制备方法所制得的接骨木莓发酵物，并提供所述接骨木莓发酵物用于制备促进硬骨分化、增强免疫力或抗氧化的组合物的用途。

在一实施例中，一种接骨木莓发酵物的制备方法，包括：

提供一培养液，所述培养液包括由所述接骨木莓与水的重量比为1～3:5～29 所形成的一接骨木莓溶液及所述接骨木莓溶液总重的10重量％的葡萄糖；

在一实施例中，将所述培养液及复数菌种在一磁场内进行发酵4～15.5日以得到一发酵原液，其中所述复数菌种包括0.01～0.5重量％的酵母菌、0.01～0.25 重量％的乳酸菌及3～10重量％的醋酸菌；以及

调整所述发酵原液的糖度以形成所述接骨木莓发酵物。

在一实施例中，所述将所述培养液及所述多个菌种在所述磁场内进行发酵的步骤包括：

将所述酵母菌在所述磁场内进行发酵1～2.5日后形成一第一初发酵液；

添加所述乳酸菌于所述第一初发酵液内并于所述磁场内发酵1～3日后形成一第二初发酵液；

添加所述醋酸菌于所述第二初发酵液内并于所述磁场内发酵3～10日后形成所述初发酵液；以及

过滤所述初发酵液以得到所述发酵原液。

在一实施例中，所述磁场的磁通量密度为120～300毫特斯拉。

在一实施例中，所述接骨木莓发酵液中的总多酚含量为1134.6μg/ml。

在一实施例中，所述酵母菌为Saccharomyces cerevisiae，其保藏编号为ATCC26602，所述乳酸菌为Lactobacillus plantarum，其保藏编号为DSM33108，所述醋酸菌为Acetobacter aceti，其保藏编号为ATCC15973。

本发明还提供了一种接骨木莓发酵液用于制备促进硬骨分化、增强免疫力或抗氧化的组合物的用途。

在一实施例中，所述接骨木莓发酵液增加血液中的骨钙素(Osteocalcin)及 /或第一型前胶原蛋白氮端前胜链(P1NP)的浓度。

在一实施例中，所述接骨木莓发酵液增加白细胞介素18及/或白血球吞噬能力。

在一实施例中，所述接骨木莓发酵液增加血液中的红血球中的榖胱甘肽S 转移酶(GST-RBC)、含硫化合物(f-Thiols)、丙二醛(MDA)或其组合的浓度。

在一实施例中，所述接骨木莓发酵液中的接骨木莓与水的重量比为 1～3:5～29，并且通过复数菌种在一磁场内进行发酵4～15.5日，所述复数菌种包括0.01～0.5重量％的酵母菌、0.01～0.25重量％的乳酸菌及3～10重量％的醋酸菌。

在一实施例中，所述接骨木莓发酵液是进一步制备成保养品组合物、保健食品组合物、化妆品组合物或皮肤外用剂。

综上所述，任一实施例的制造方法使得所述接骨木莓发酵物的总多酚含量比传统制程高出一倍，大量提升所述接骨木莓发酵物的多个功效。此外，任一实施例的接骨木莓发酵物可用于制备促进硬骨分化、增强免疫力或抗氧化的组合物的用途，其中所述组合物用于透过增加血液中的骨钙素(Osteocalcin)及/ 或第一型前胶原蛋白氮端前胜链(P1NP)的浓度达到促进硬骨分化、提升骨细胞中的钙离子含量、预防骨质疏松症、加强骨密度及/或强化骨骼，透过增加白细胞介素18及/或白血球吞噬能力达到增强免疫力，达到身体保健的功效，以及透过增加血液中的红血球中的榖胱甘肽S转移酶(GST-RBC)、含硫化合物 (f-Thiols)、丙二醛(MDA)而达成抗氧化作用，增加血液中的还原物质，消除身体内的氧化物质而减少氧化压力，避免破坏蛋白质分子、氧化体内酵素而干扰其作用，也避免不饱和脂肪酸发生过氧化作用，本发明的接骨木莓发酵物实现促进硬骨分化、增强免疫力或抗氧化的功效。

以下结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述，但不作为对本发明的限定。

附图说明

图1是本发明一实施例的发酵液的制法的流程图。

图2是图1步骤S02的细部的流程图。

图3是本发明的一实施例的制造方法所制得的接骨木莓发酵物的总多酚含量。

图4是控制组、对照组1、对照组2及实验组分化成硬骨细胞的数量的结果比较图。**p值<0.01，相较于控制组。

图5是控制组、对照组1、对照组2及实验组的白细胞介素18的表达量的结果比较图。*p值<0.05，相较于控制组。

图6是控制组、对照组1、对照组2及实验组的白血球吞噬能力的结果比较图。***p值<0.001，相较于控制组。

图7是受试者连续摄取含有所述实验组的饮品在第0周及第8周的总和抗氧化能力的结果比较图。

图8是受试者连续摄取含有所述实验组的饮品在第0周及第8周的红血球中的榖胱甘肽S转移酶的结果比较图。

图9是受试者连续摄取含有所述实验组的饮品在第0周及第8周的含硫化合物的结果比较图。

图10是受试者连续摄取含有所述实验组的饮品在第0周及第8周的丙二醛的结果比较图。

图11是受试者连续摄取含有所述实验组的饮品在第0周及第8周的骨钙素的结果比较图。

图12是受试者连续摄取含有所述实验组的饮品在第0周及第8周的第一型前胶原蛋白氮端前胜链的结果比较图。

图13是受试者连续摄取含有所述实验组的饮品在第0周及第8周的骨质密度的T评分(T-score)的结果比较图。

具体实施方式

以下将描述本案的部分具体实施态样。在不背离本案精神下，本案尚可以多种不同形式的态样来实践，不应将保护范围限于说明书所具体陈述的条件。

本案使用Excel软体进行统计分析。数据以平均值±标准差(SD)表示，各组的间的差异以学生t检验(student's t-test)进行分析。

本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在正负10％的范围内，最佳为在正负5％的范围内。

如本文中所使用，术语“汁液提取”是指藉由提取作用所制备的产物。所述提取物可以溶于溶剂中的溶液形式呈现，或提取物可为不含或大体上不含溶剂的浓缩物或精华呈现。

依据本发明，医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于非经肠道地(parenterally)、口服地(orally)或局部地(topically)投药的剂型，这包括，但不限于：注射品(injection)[例如，无菌的水性溶液(sterile aqueous solution) 或分散液(dispersion)]、无菌的粉末(sterile powder)、锭剂(tablet)、片剂(troche)、口含锭(lozenge)、丸剂(pill)、胶囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或细颗粒(granule)、溶液、悬浮液(suspension)、乳剂(emulsion)、糖浆(syrup)、酏剂(elixir)、浓浆(slurry)、外部制剂(external preparation)以及类似的物。

依据本发明，医药品可进一步包含有一被广泛地使用于药物制造技术的医药上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，所述医药上可接受的载剂可包含一或多种选自于下列的试剂：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂 (disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、黏结剂(binding agent)、赋形剂 (excipient)、安定剂(stabilizing agent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gellingagent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wetting agent)、润滑剂 (lubricant)、吸收延迟剂(absorption delaying agent)、脂质体(liposome)以及类似的物。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。

依据本发明，所述医药上可接受的载剂包含有一选自于由下列所构成的群组中的溶剂：水、生理盐水(normal saline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline,PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)以及它们的组合。

依据本发明，所述医药品可以一选自于由下列所构成的群组中的非经肠道途径(parenteral routes)来投药：腹膜内注射(intraperitoneal injection)、皮下注射(subcutaneous injection)、表皮内注射(intraepidermal injection)、皮内注射(intradermal injection)、肌肉内注射(intramuscular injection)、静脉内注射(intravenous injection)以及病灶内注射(intralesional injection)。

依据本发明，医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于局部地施用于皮肤上的外部制剂(external preparation)，这包括，但不限于：乳剂(emulsion)、凝胶(gel)、软膏(ointment)、乳霜(cream)、贴片(patch)、擦剂 (liniment)、粉末(powder)、气溶胶(aerosol)、喷雾(spray)、乳液(lotion)、乳浆 (serum)、糊剂(paste)、泡沫(foam)、滴剂(drop)、悬浮液(suspension)、油膏(salve) 以及绷带(bandage)。

依据本发明，所述外部制剂是藉由将本发明的医药品与一为熟习此项技艺者所详知的基底(base)相混合而被制备。

依据本发明，所述基底可包含有一或多种选自于下列的添加剂(additives)：水、醇(alcohols)、甘醇(glycol)、碳氢化合物(hydrocarbons)[诸如石油胶(petroleum,jelly)以及白凡士林(white petrolatum)]、蜡(wax)[诸如石蜡(paraffin)以及黄蜡(yellow wax)]、保存剂(preserving agents)、抗氧化剂(antioxidants)、界面活性剂(surfactants)、吸收增强剂(absorption enhancers)、安定剂(stabilizing agents)、胶凝剂(gelling agents)[诸如

依据本发明，保养品可进一步包含有一被广泛地使用于保养品制造技术的可接受的佐剂(acceptable adjuvant)。例如，所述可接受的佐剂可包含有一或多种选自于下列的试剂：溶剂、胶凝剂、活性剂、防腐剂、抗氧化剂、遮蔽剂 (screening agent)、螯合剂、界面活性剂、染色试剂(coloring agent)、增稠剂 (thickening agent)、填料(filler)、香料以及气味吸收剂。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。

依据本发明，保养品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于护肤(skincare)或化妆(makeup)的形式，这包括，但不限于：水性溶液(aqueous solution)、水-醇溶液(aqueous-alcohol solution)或油性溶液(oily solution)、呈水包油型(oil-in-water type)、油包水型(water-in-oil type)或复合型的乳剂、凝胶、软膏、乳霜、面膜(mask)、贴片、贴布(pack)、擦剂、粉末、气溶胶、喷雾、乳液、乳浆、糊剂、泡沫、分散液、滴剂、慕斯(mousse)、防晒油(sunblock)、化妆水 (tonic water)、粉底(foundation)、卸妆产品(makeup remover products)、肥皂(soap) 以及其他身体清洁产品(body cleansingproducts)等。

依据本发明，保养品亦可与一或多种选自于下列的已知活性的外用剂 (externaluse agents)一起合并使用：美白剂(whitening agents)[诸如维生素A酸 (tretinoin)、儿茶素(catechin)、曲酸、熊果苷以及维生素C]、保湿剂、抗发炎剂 (anti-inflammatoryagents)、杀菌剂(bactericides)、紫外线吸收剂(ultraviolet absorbers)、植物提取物(plant extracts)[诸如芦荟提取物(aloe extract)]、皮肤营养剂(skin nutrients)、麻醉剂(anesthetics)、抗痘剂(anti-acne agents)、止痒剂 (antipruritics)、止痛剂(analgesics)、抗皮肤炎剂(antidermatitis agents)、抗过角化剂(antihyperkeratolytic agents)、抗干皮肤剂(anti-dry skin agents)、抗汗剂(antipsoriatic agents)、抗老化剂(antiaging agents)、抗皱剂(antiwrinkle agents)、抗皮脂溢出剂(antiseborrheic agents)、伤口治疗剂(wound-healing agents)、皮质类固醇(corticosteroids)以及激素(hormones)。有关这些外用剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。

依据本发明，食品产品可被当作食品添加物(food additive)，藉由习知方法于原料制备时添加，或是于食品的制作过程中添加，而与任一种可食性材料配制成供人类与非人类动物摄食的食品产品。

依据本发明，食品产品的种类包括但不限于：饮料(beverages)、发酵食品(fermented foods)、烘培产品(bakery products)、健康食品(health foods)以及膳食补充品(dietary supplements)。

于下列实施方式的说明中，除非另有相关说明，则「％」符号是指重量百分比。

接骨木莓(学名：Sambucus nigra，又称西洋接骨木莓)是五福花科接骨木属的一种灌木的果实，主要种植在欧洲，举例而言，义大利的米兰诺(Merano)，其果实的果熟期7-8月。果实亮黑色，直径3～5毫米。在一实施例中，接骨木莓是在义大利的米兰诺以阿尔卑斯山的融雪与遍布境内的温泉灌溉生长，使接骨木莓具有丰富的矿物质等生物活性物质。

参考图1。在一实施例中，接骨木莓发酵物的制备方法包括下列步骤：提供培养液(步骤S01)、将培养液及复数菌种在磁场内进行发酵7日以得到发酵原液(步骤S02)、以及调整发酵原液的糖度(Degrees Brix，°Bx)以完成接骨木莓发酵物(步骤S03)。

在步骤S01中，培养液包括由所述接骨木莓与水的重量比为1～3:5～29所形成的一接骨木莓溶液及接骨木莓溶液总重的10％的葡萄糖。在一些实施例中，「接骨木莓」通常是指植物果实，其中果实可包含原始、经干燥或以其他物理方式加工以利于处理的果实，其可进一步包含完整、剁碎、切丁、碾磨、研磨或以其他方式经加工以影响原物料的大小及实体完整性的果实。

在一些实施例中，「接骨木莓发酵物」中的接骨木莓可为接骨木莓的果实经榨取而得的汁液。举例而言，在一些实施例中，是将接骨木莓的果实经碾碎、挤压并去除果渣与较细小的悬浮物后，再将其浓缩至一定糖度而得。在另一些实施例中，接骨木莓发酵物于制备过程中亦可经过其他大致上不影响其产生本文所述功效的程序，例如发酵，以增添风味或其他用途。

在一些实施例中，「接骨木莓发酵物」中的接骨木莓亦可为使用合适的提取溶剂提取接骨木莓的果实而得到的提取液。举例而言，可将接骨木莓浸泡于水中于常温下经适当时间进行提取，再经过滤去除固态杂质后可得到接骨木莓果实提取液。

在一实施例中，步骤S01可包括：依上述比例混合接骨木莓及葡萄糖形成混合液；以及将混合液于50-100℃下提取0.5-1.5小时以得到培养液。于此，将葡萄糖与接骨木莓溶液一并进行提取程序，藉以助于葡萄糖溶解并且还可以避免污染。

在另一个实施例中，步骤S01包括：将接骨木莓及水于50-100℃下提取 0.5-1.5小时形成水萃液；以及将葡萄糖加入水萃液以得到培养液。于此，将接骨木莓单独进行提取程序，以利于接骨木莓内有效成分的确实地释出。

在一些实施例中，提取是指将混合液维持在50-100℃并静置0.5-1.5小时。在一实施例中，提取是指将混合液维持在95℃并静置1小时。

在一实施例中，培养液的糖度为9°Bx～10°Bx。于此，足够的糖度可以确保后续发酵的顺利进行，菌种可以有足够的养份。

后续，将培养液及复数菌种在磁场内进行发酵4～15.5日以得到发酵原液(步骤S02)。其中，复数菌种包括相对于培养液为0.01％～0.5％的酵母菌、相对于培养液为0.01％～0.25％的乳酸菌及相对于培养液为3～10％的醋酸菌(Acetobacter aceti)。在一实施例中，培养液不另滤除其内部的固形物(提取后的接骨木莓)直接加入菌种进行发酵，藉以利用菌种进一步提取固形物中的活性成分。

在一实施例中，酵母菌可以是市售的啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。举例而言，向食品工作发展研究所采购保藏编号BCRC20271(国际保藏 ATCC26602)菌株的啤酒酵母。

在一实施例中，乳酸菌可以是为市售的胚芽乳酸杆菌(Lactobacillusplantarum)、市售的嗜热链球菌(Streptococcus thermophiles)或植物乳杆菌。举例而言，采用胚芽乳酸杆菌(购自食品工作发展研究所，寄存编号BCRC910760)。再举例而言，采用保藏编号BCRC910636菌株的嗜热链球菌TCI633(嗜热链球菌TCI633国际保藏：德国微生物保藏中心，保藏日期2013年12月12日，保藏编号DSM28121，保藏地址：德国)。

在一实施例中，向美国菌种中心(American Type Culture Collection)采购保藏编号BCRC11688(国际保藏ATCC15973)菌株的醋酸菌。

在一实施例中，「啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)」、「胚芽乳酸菌(Lactobacillus plantarum)」以及「醋酸菌(Acetobacter aceti)」分别意欲涵盖那些为熟习此项技术人士可易于获得的啤酒酵母菌、胚芽乳酸菌以及醋酸菌(例如，可购自于国内或国外保藏机构者)，或者利用本技艺中所惯用的微生物分离方法而从天然来源中所分离纯化出的啤酒酵母菌、胚芽乳酸菌以及醋酸菌菌株。

参考图2。在一实施例中，步骤S02可包括：将酵母菌在磁场内进行发酵 1～2.5日后形成第一初发酵液(步骤S21)；添加乳酸菌于第一初发酵液内并在磁场内发酵1～3日后形成第二初发酵液(步骤S22)；添加醋酸菌于第二初发酵液内并于磁场内发酵3～10日后形成初发酵液(步骤S23)；以及过滤初发酵液以得到发酵原液(步骤S24)。

在步骤S21中，透过先添加酵母菌可以使培养液发酵以产生酒精；于此，酒精有利提取出人参与枸杞内不同的有效成份。在一些实施例中，第一初发酵液的PH值小于4，且其糖度为约9°Bx。

在步骤S22中，透过添加乳酸菌可以使得第一初发酵液内的葡萄糖被进一步消耗而降低糖度并且产生乳酸，以降低第一初发酵液的PH值；于此，降低第一初发酵液的PH值有利于进一步提取人参与枸杞内其他不同有效成分。在一些实施例中，第二初发酵液的PH值小于3.5，且其糖度为约6°Bx。

在步骤S23中，透过添加醋酸菌可以使得第二初发酵液内的酒精被消耗，而进一步再降低葡萄糖的含量。在一些实施例中，初发酵液的PH值小于3.5，且其糖度为为约3°Bx。

在步骤S24的一实施例中，可以是过滤并浓缩初发酵液以得到发酵原液。在一示范例中，浓缩方式可以采取在60℃下的减压浓缩，以及过滤方式可以是以200mesh过滤。在一些实施例中，发酵原液的糖度为约2°Bx。在一些实施例中，发酵原液的PH值小于3.5。

在步骤S03的一实施例中，可以是添加寡糖至发酵原液以使发酵原液的糖度达到40°Bx以形成接骨木莓发酵物。于此，寡糖是指由3～10个单醣分子聚合而成的低聚糖。其中，寡糖可为果寡糖、半乳寡糖、木寡糖、异麦芽寡糖等等。在一实施例中，所添加的寡糖可为含40％～70％异麦芽寡糖的寡糖溶液。

在一实施例中，步骤S03所得的接骨木莓发酵物的总多酚含量为 436.33μg/ml。在一实施例中，接骨木莓发酵物的黄酮含量为12703μg/ml。

[例1]：接骨木莓发酵物的制备

将采购自义大利的米兰诺的接骨木莓、水与葡萄糖混合成为混合液。在混合液中，所述接骨木莓与水的重量比为1:5所形成的一接骨木莓溶液(即，接骨木莓为一倍重量，水为五倍重量)，并且葡萄糖为接骨木莓与水所形成的接骨木莓溶液总重的10％。接着，将混合液于95℃下提取1小时以得到培养液。发酵桶外围设置的磁铁能在发酵桶内形成磁场，待培养液冷却之后置入其外围设置有磁铁的发酵桶内，使培养液在磁场内进行发酵。添加相对于培养液为 0.01％的BCRC20271菌株的啤酒酵母菌于发酵桶中的培养液内，然后于30℃下进行发酵1天以形成第一初发酵液。再添加相对于培养液为0.05％的嗜热链球菌(嗜热链球菌TCI633，寄存编号BCRC910636；嗜热链球菌TCI633国际保藏：德国微生物保藏中心，保藏日期2013年12月12日，保藏编号DSM28121)于发酵桶中的第一初发酵液内，然后进行发酵1天以形成第二初发酵液。最后添加相对于培养液为5％的BCRC11688菌株的醋酸菌于发酵桶中的第二初发酵液内，然后进行发酵5天以得到发酵原液。于得到发酵原液后，在60℃下减压浓缩及以200mesh过滤初发酵液以得到发酵原液。然后，以异麦芽寡糖60％及发酵原液40％的比例进行混合以使发酵原液的糖度达到40°Bx而形成接骨木莓磁场发酵物。

固态的接骨木莓磁场发酵物的制备：

为获得固态的接骨木莓磁场发酵物，可将前述经减压浓缩的接骨木莓磁场发酵物以喷雾干燥方式去除溶剂，因此获得接骨木莓磁场发酵物粉末。

[例2]:接骨木莓发酵物(一般发酵)的制备

采用与例1的接骨木莓发酵物相同的原料比例与发酵程序，但其发酵桶外围并未设置磁铁，来制得接骨木莓发酵物。

[例3]:接骨木莓水萃物(无发酵)的制备

将采购自义大利的米兰诺的接骨木莓与水以1:5的比例混合均匀，再添加葡萄糖溶液将糖度调整为9，得到接骨木莓水萃液，其pH值为6.3。

[例4]:总多酚含量测试

分别以例1所得的接骨木莓发酵物及例2所得的接骨木莓水萃物作为实验组及对照组。将各样本以水稀释10倍后取100mL到离心管中。接着，加入500μL 的Folin-Ciocalteu酚试剂至离心管中与稀释后的样本混合并静置3分钟后，再加入400μL的7.5％碳酸钠混匀静置30分钟后以得到待测反应溶液。于二次静置后，取200μL的待测反应溶液至96孔板中，并测量待测反应溶液于750nm 下的吸光值。

并且，以没食子酸(Gallic acid)作为标准品制作标准曲线。于此，配置 0μL/mL、20μL/mL、40μL/mL、60μL/mL、80μL/mL、及100μL/mL的没食子酸的标准溶液，并分别取100μL的各浓度的标准溶液至10mL离心管中。加入 500μL的Folin-Ciocalteu酚试剂至离心管内与标准溶液混合并静置3分钟后，再加入400μL的7.5％碳酸钠混匀静置30分钟后以得到标准反应溶液。取200μL 的标准反应溶液96孔板中，并测量其在750nm下的吸光值，以获得标准曲线。

接着，利用标准曲线将待测反应溶液的吸光值换算成总多酚含量。于此，可得到实验组的接骨木莓磁场发酵物总多酚含量为1134.6μg/ml及对照组的接骨木莓发酵物中总多酚含量557.6μg/ml，如图3所示。

由实验结果可知，接骨木莓磁场发酵物总多酚含量相较于接骨木莓发酵物总多酚含量提升203.5％；基此可知在磁场内进行发酵更有利于有效成份的提取。

[例5]:促进硬骨形成(Osteogenesis)试验

为证实本发明的接骨木莓磁场发酵物具有促进硬骨形成的能力，本发明利用茜素红(Alizarin Red S)(Sigma-Aldrich)染色进行确认。Alizarin Red S是橙黄色结晶物，可溶于水，会与钙盐结合而形成橘红色的沉淀物，用于检测细胞的钙沉积或钙化物质的检测。

本发明利用所述接骨木莓磁场发酵物处理OP9新生小鼠骨髓间质细胞株 (是由ATCC编号为CRL-2749取得)，以未经处理的OP9细胞株作为控制组，例3的接骨木莓水萃物作为对照组1，例2的接骨木莓发酵物作为对照组2，观察例1的接骨木莓磁场发酵物对OP9细胞株分化成硬骨细胞的情形。结果显示，经由茜素红染色分析显示所述接骨木莓磁场发酵物处理的OP9细胞可分化成硬骨细胞，进而增加钙离子的累积。且其经分析后的数据结果如图4所示，相较于未以接骨木莓磁场发酵物处理控制组的分化成硬骨细胞的数量为100％，对照组1的接骨木莓水萃物处理的OP9细胞株分化成硬骨细胞的数量为 72.05％，对照组2的接骨木莓发酵物处理的OP9细胞株分化成硬骨细胞的数量为74.38％，实验组的接骨木莓磁场发酵物处理的OP9细胞株分化成硬骨细胞的数量为129.45％，故本发明经接骨木莓磁场发酵物处理的OP9细胞株可有效提升软骨分化能力1.29倍，证实本发明的接骨木莓磁场发酵物具有效促进硬骨细胞生长及硬骨形成的能力。

[例6]:巨噬细胞吞噬活性相关基因检测

准备一个6孔盘(购自GeneDireX公司)，在各孔中注入例6的控制组、对照组1、对照组2及实验组的人类单核球细胞株THP-1(包含RPMI培养液、以及10％FBS)，以5x10

以RNA提取套组、反转录酶、KAPA

表1:

*R为REVERSE反向，F为FORWARD顺向。

请参阅图5。将控制组的IL-18基因的表达量视为1(即100％)，相对于控制组1的IL-18基因表达量上升至1.74，控制组2的IL-18基因表达量上升至2.04，实验组的IL-18基因表达量上升至2.48，代表实验组的IL-18基因的表达量为控制组的2.48倍。由此可知，当小鼠巨噬细胞以含有接骨木莓磁力酵素处理后，IL-18基因的表达量提高，表示接骨木莓磁力酵素具有刺激先天免疫力及提升巨噬细胞吞噬活性的功效。

[例7]:巨噬细胞吞噬活性检测

在例6的控制组、对照组1、对照组2及实验组的巨噬细胞中加入0.5％的萤光微珠(大小为1.7微米至2.2微米，购自Spheroteth公司)，继续培养4小时。接者，清除培养液，加入1X PBS清洗3次，再将每孔分为5区，每区随机选取2个视野以萤光显微镜(购自ZEISS公司)进行拍照，进一步计算照片中巨噬细胞里萤光微珠的数量，并将结果统计示于图6。

如图6所示，以控制组的巨噬细胞里萤光微珠的数量作为100％，对照组1 的巨噬细胞里萤光微珠的数量为106.03％，对照组2的巨噬细胞里萤光微珠的数量为113.79％，实验组1的巨噬细胞里萤光微珠的数量为145.69％。可见，相较于控制组，与接骨木莓磁力酵素共培养的巨噬细胞，皆可吞噬较多的萤光微珠，显示接骨木莓磁力酵素可显著提升巨噬细胞的吞噬能力。

而为证实本发明的接骨木莓磁力酵素对于人体的功效，亦进行相关人体实验如下。

[例8]：人体实验-抗氧化能力测定

本实验针对6位45-65岁的已停经女性的受试者连续8周服用含有7.5ml 的如例1所制的接骨木莓磁力酵素的饮品。在第0周及第8周进行抽血，以侦测在服用含有本发明的接骨木莓磁力酵素的饮品前后的其血液中的总和抗氧化能力(TAC)、榖胱甘肽S转移酶(GST-RBC)、含硫化合物(f-Thiols)、丙二醛(MDA) 的变化量。

本实施例受试者血液中的总和抗氧化能力(TAC)、榖胱甘肽S转移酶(GST-RBC)、含硫化合物(f-Thiols)、丙二醛(MDA)是委由立人检验所(中国台湾)测定。

图7示出了受试者在服用含有本发明的接骨木莓磁力酵素的饮品于第0周及第8周的总和抗氧化能力的变化量，第0周时的受试者的总和抗氧化能力 (TAC)值为约0.56mmol/L，受试者于第8周的总和抗氧化能力增加至约0.64 mmol/L，上升了14.3％，总和抗氧化能力(Total Antioxidant Capacity，TAC)检测测量血浆中非酵素類抗氧化物总体的抗氧化能力，比单独测量某一抗氧化物更能反应全身抗氧化的能力。所测得的TAC值越高表示体内抗氧化能力越高。本发明的接骨木莓磁力酵素可强化体内抗氧化力，帮助抵御自由基诱发的伤害。

图8示出了受试者在服用含有本发明的接骨木莓磁力酵素的饮品于第0周及第8周的榖胱甘肽S转移酶的变化量，第0周时的受试者的榖胱甘肽S转移酶(GST-RBC)值为约5.17U/g-Hb，受试者于第8周的榖胱甘肽S转移酶增加至约6.19U/g-Hb，上升了19.7％，榖胱甘肽S转移酶的增加提升抗氧化及免疫力的功效，使体内的过氧化氢还原成水及氧气，并且还原脂质过氧化物为无害的产物，降低体内的氧化压力。

图9示出了受试者在服用含有本发明的接骨木莓磁力酵素的饮品于第0周及第8周的含硫化合物的变化量，第0周时的受试者的含硫化合物的浓度为约 311.00μg/mL，受试者于第8周的含硫化合物的浓度上升至约348.50μg/mL，上升了12％。本发明的接骨木莓磁力酵素可增加含硫化合物的含量，含硫化合物为一良好的抗氧化物质，对自由基相当敏感，能缓和活性氧自由基(ROS)的伤害，具有解毒与强化肝脏功能的作用。

图10示出了受试者在服用含有本发明的接骨木莓磁力酵素的饮品于第0 周及第8周的丙二醛的变化量，第0周时的受试者的丙二醛的浓度为约1.36 nmol/mL，受试者于第8周的丙二醛的浓度下降至约1.30nmol/mL，下降了 4.4％，丙二醛(malondialdehyde,MDA)是由体内自由基与细胞膜上的磷脂质 (phospholipids)发生脂质过氧化反应而形成，MDA形成越快表示身体抗氧化能力较差，MDA累积越多，表示受伤害机率高。本发明的接骨木莓磁力酵素可减少MDA的含量，避免MDA造成皮肤产生黑斑、雀斑，加速老化过程，同时会破坏胆固醇伤害动脉血管、冠状动脉硬化等心血管疾病、DNA损伤导致癌症。降低细胞膜上的磷脂质(phospholipids)发生脂质过氧化。

[例9]：人体实验-促进骨质生成能力测定

本实验针对例8的受试者在第0周及第8周进行抽血，以侦测在服用含有本发明的接骨木莓磁力酵素的饮品前后的骨钙素及第一型前胶原蛋白氮端前胜链(P1NP)的浓度的变化。

本实施例受试者血液中的骨钙素及第一型前胶原蛋白氮端前胜链的浓度是委由立人检验所(中国台湾)测定。

图11示出了受试者在服用含有本发明的接骨木莓磁力酵素的饮品于第0 周及第8周的骨钙素的浓度的变化，结果示于图11，以第0周时的骨钙素的浓度为约17.70ng/mL，受试者于第8周的骨钙素的浓度增加至约18.02ng/mL，增加了1.8％，具有促进骨质生成速率、减缓骨质疏松的功效。

图12示出了受试者在服用含有本发明的接骨木莓磁力酵素的饮品于第0 周及第8周的第一型前胶原蛋白氮端前胜链的浓度的变化，结果示于图11，以第0周时的第一型前胶原蛋白氮端前胜链的浓度为约60.66ng/mL，受试者于第 8周的第一型前胶原蛋白氮端前胜链的浓度增加至约66.65ng/mL，增加了 9.9％，具有促进骨质生成速率、减缓骨质疏松的功效。

[例10]：人体实验-骨质密度测定

本实验针对例8的受试者在第0周及第8周使用双能谱X光骨质密度吸收测量仪(dual-energy x-ray absorptiometry)来量测T评分，以评估骨质密度。

图12示出了受试者在服用含有本发明的接骨木莓磁力酵素的饮品于第0 周及第8周的T评分的变化，结果示于图13，以第0周时的T评分为约-0.92，受试者于第8周的T评分增加至-0.85，增加了7.6％，本发明的接骨木莓磁力酵素确实可以预防骨质疏松症、加强骨密度及强化骨骼的功效。

综上所述，任一实施例的制造方法使得所述接骨木莓发酵物的总多酚含量比传统制程高出一倍，大量提升所述接骨木莓发酵物的多个功效。此外，任一实施例的接骨木莓发酵物可用于制备促进硬骨分化、增强免疫力或抗氧化的组合物的用途，其中所述组合物用于透过增加血液中的骨钙素(Osteocalcin)及/ 或第一型前胶原蛋白氮端前胜链(P1NP)的浓度达到促进硬骨分化、提升骨细胞中的钙离子含量、预防骨质疏松症、加强骨密度及/或强化骨骼，透过增加白细胞介素18及/或白血球吞噬能力达到增强免疫力，达到身体保健的功效，以及透过增加血液中的红血球中的榖胱甘肽S转移酶(GST-RBC)、含硫化合物(f-Thiols)、丙二醛(MDA)而达成抗氧化作用，增加血液中的还原物质，消除身体内的氧化物质而减少氧化压力，避免破坏蛋白质分子、氧化体内酵素而干扰其作用，也避免不饱和脂肪酸发生过氧化作用，本发明的接骨木莓发酵物实现促进硬骨分化、增强免疫力或抗氧化的功效。

当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。

序列表

<110> 百岳特生物技术（上海）有限公司

<120> 接骨木莓磁场发酵物的制备方法及其用途

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> Artificial Sequence

<222> (1)..(23)

<223> IL-18-F

<400> 1

tcttcattga ccaaggaaat cgg 23

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> Artificial Sequence

<222> (1)..(21)

<223> IL-18-R

<400> 2

tccggggtgc attatctcta c 21

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> Artificial Sequence

<222> (1)..(19)

<223> GAPDH-F

<400> 3

ctgggctaca ctgagcacc 19

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> Artificial Sequence

<222> (1)..(21)

<223> GAPDH-R

<400> 4

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