一种提高槲皮素抗氧化能力并维持其稳定性的纳米晶体及其制备方法

技术领域

本发明属于槲皮素纳米晶体的制备方法，具体为一种提高槲皮素抗氧化能力并维持其稳定性的纳米晶体及其制备方法。

背景技术

槲皮素是一种多酚类黄酮化合物，它广泛并且大量存在于洋葱、豌豆、浆果、苹果、西兰花、卷心菜等日常食物当中。越来越多的证据表明，槲皮素在预防和治疗不同的慢性疾病方面具有巨大的潜力，例如心血管疾病(即心脏病、高血压和胆固醇)和癌症。此外，槲皮素在抗氧化、抗炎、抗病毒等日常健康防护方面也拥有显著活性，尤其是槲皮素的抗氧化能力，槲皮素可以直接清除活性氧(ROS)，从而减少氧化损伤，以防止随之而来的DNA损伤；槲皮素提高了抗氧化酶的活性，如过氧化氢酶(CAT)，谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)，超氧化物歧化酶(SOD)，谷胱甘肽(GSH)，并降低和抑制了脂质过氧化物酶的水平；槲皮素还可以调节由ROS引起的NRF2，AMPK和MAPK等信号通路，以促进抗氧化防御系统维持氧化平衡，同时，槲皮素的抗癌功能本质上与其强大的抗氧化能力有关。

槲皮素是一种低水溶性物质，并且在很多环境中不稳定，例如高热环境、碱性环境和金属粒子环境，从而导致槲皮素的渗透性和生物利用度较低，难以用于医疗用途。目前，脂质载体、聚合物纳米颗粒、乳剂、胶束和基于偶联物的包封的递送系统被视为可能提高槲皮素稳定性和生物利用度的方法。这些输送系统通常将药物有效包封各自的体系当中，以保护它免受化学降解(例如氧化)，并且将其能够在有效部位进行持续释放作为目标。虽然这些运输体系能够提高药物的稳定性，但是有关载药量和溶解度仍是亟需考虑的问题。

纳米晶体技术，是一种新颖的药剂学方法，这种技术通过表面活性剂或聚合物空间位阻稳定剂，使药物以无定形状态存在，从而拥有更大的表面积以达到增强溶解性和溶出速率的目的。纳米晶体与其他纳米制剂不同，纳米晶体100％由药物组成，并且不需要载体系统，具有较高的安全性。高载药能力使它们在将药物输送到细胞或进入细胞时能够达到较高的药物浓度和持续释放效果。此外，由于纳米晶体较小的粒径，使其能够因生物黏附作用而延长药物在肠胃的作用时间。

在现有技术中，虽然对槲皮素的溶解性和抗氧化功能都做出了进一步研究并获得了一些发现，但对于槲皮素的稳定性问题均未作出详细回应；同时，槲皮素载药量和渗透性有限；此外，对于槲皮素抗氧化效果的研究仅限于体外，并未对槲皮素体内抗氧化效果进行分析。因此，如何有效发挥槲皮素的体内外抗氧化功能并维持其稳定性，以及进一步提高槲皮素的生物利用度，是本领域亟需解决的技术问题。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种提高槲皮素抗氧化能力并维持其稳定性的纳米晶体及其制备方法，该方法简单、无毒、原料来源广泛；将槲皮素制备成纳米晶体，不仅拥有100％的药物组成，还具有高溶解和渗透特性。

为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一方面，提供一种提高槲皮素抗氧化能力并维持其稳定性的纳米晶体的制备方法，包括以下步骤：

1)有机相溶液的制备：将槲皮素类化合物溶解在有机溶剂中，制备得到有机相溶剂；

2)水相溶液制备：将稳定剂加入纯化水中，溶胀后得到水相溶剂，将水相溶液在4℃冷藏待用；

3)槲皮素纳米晶体的制备：将有机相溶液用注射器快速注入水相中，制备得到槲皮素纳米晶体。

本发明的第二方面，提供上述制备方法制备的槲皮素纳米晶体。

本发明实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

(1)本发明制备槲皮素纳米晶体的方法，原料天然，制备条件温和，不使用三氯甲烷、丙酮等毒性有机试剂，制备过程绿色环保，无毒害物质释放。

(2)本发明制备槲皮素纳米晶体不仅能够提高槲皮素稳定性，更能在体内外进一步增强槲皮素的抗氧化效果。

(3)本发明将槲皮素制备成纳米晶体，不仅拥有100％的药物组成，还具有高溶解和渗透特性。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1为50-QUE-NCs、140-QUE-NCs和380-QUE-NCs的粒径分布图。

图2为50-QUE-NCs、140-QUE-NCs和380-QUE-NCs在4℃下不同时间的颜色变化和沉淀发生图。

图3为槲皮素原料及50-QUE-NCs、140-QUE-NCs和380-QUE-NCs在碱性条件被空气中氧化的颜色变化图片。

图4(a)为槲皮素原料药的拉曼光谱图(b)为50nm-QUE-NCs的拉曼光谱图(c)为140nm-QUE-NCs的拉曼光谱图(d)为380nm-QUE-NCs的拉曼光谱图；(a)(b)(c)(d)图中(1)(2)(3)(4)(5)依次为初始环境，碱性环境30min后，12h后，24h后，48h后拉曼光谱图。

图5为PTIO法体外抗氧化结果图。

图6为DPPH法体外抗氧化结果图。

图7为·OH法体外抗氧化结果图。

图8(a)为斑马鱼吖啶橙染色荧光图，(b)为过氧化氢诱导后斑马鱼吖啶橙荧光强度百分比图(与过氧化氢对照组相比)。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明；除非另有指明，本申请使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式；如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

具体地，本发明是通过如下所述的技术方案实现的：

本发明的第一种典型实施方式，提供了一种提高槲皮素抗氧化能力并维持其稳定性的纳米晶体的制备方法，包括以下步骤：

1)有机相溶液的制备：将槲皮素类化合物溶解在有机溶剂中，制备得到有机相溶剂；

2)水相溶液制备：将稳定剂加入纯化水中，溶胀后得到水相溶剂，将水相溶液在4℃冷藏待用；

3)槲皮素纳米晶体的制备：将有机相溶液用注射器快速注入水相中，制备得到槲皮素纳米晶体。

在一种或多种实施方式中，所述有机溶剂为乙醇、甲醇中的一种。

在一种或多种实施方式中，所述稳定剂为十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基磺酸钠、吐温、司盘(Span)、聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯(TPGS)、羟乙基纤维素、羟丙甲基纤维素(HPMC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、泊洛沙姆中的一种。

在一种或多种实施方式中，所述有机溶剂与槲皮素类化合物质量比为5:100～10:100。

在一种或多种实施方式中，所述稳定剂与纯化水质量比为6:1～1:6。

在一种或多种实施方式中，所述稳定剂与槲皮素类化合物的质量比为6:1～1:6。

在一种或多种实施方式中，步骤3)中有机相溶液的量为0-10ml(不包含0)。

在一种或多种实施方式中，步骤3)中将有机相溶液用注射器快速注入水相的条件为：转速为100-5000rpm或超声功率为100-1000W，注入速度为3-10mL/min。

本发明的制备原理为：槲皮素化合物易溶于有机溶剂而不易溶于水，将槲皮素化合物先溶解于有机溶剂中，后被添加至含有聚合物稳定剂的水溶液中，因其溶解度发生变化，槲皮素化合物过饱和成核生长，析出后形成无定形纳米晶体。无定形纳米晶体在溶液中会形成混悬液，溶液中的稳定剂能够在一定时间内限制晶体的生长和聚集，以免药物直接沉降。(沉降并不是槲皮素纳米晶体变性，而是会改变晶体的粒径，使得槲皮素晶体不在纳米晶体的粒径范围内。)

由于本申请的纳米晶体在溶液中会形成混悬液，不能直接用电镜测量其粒径的大小，所以本申请使用粒径Zeta电位分析仪对纳米晶体的粒径和PDI进行测量。

本发明的第二种典型实施方式，提供了上述制备方法制备的槲皮素纳米晶体。

在一种或多种实施方式中，所述槲皮素纳米晶体的平均粒径为30-900nm。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1

小粒径槲皮素纳米晶体50-QUE-NCs的制备：

将10mg槲皮素溶于1mL无水乙醇中以获得有机相；将20mg PVPK30溶于19mL纯化水中制备水相。在1000rmp的转速搅拌下将1mL有机相用注射器以6mL/min(5s)的速度注入水相，制备小粒径的槲皮素纳米晶体(QUE-NCs)。图1为其粒径分布图，图2为其在4℃下的颜色变化和沉淀发生图，图2表明50-QUE-NCs在4℃下的稳定性为五天，五天后出现片状沉淀聚沉在瓶底。

实施例2

中粒径槲皮素纳米晶体140-QUE-NCs的制备：

将20mg槲皮素溶于2mL无水乙醇中以获得有机相；将60mg PVPK30溶于18mL纯化水中制备水相。在1000rmp的转速搅拌下将2mL有机相用注射器以6mL/min(5s)的速度注入水相，制备中粒径的QUE-NCs。

实施例3

大粒径槲皮素纳米晶体380-QUE-NCs的制备：

将10mg槲皮素溶于1mL无水乙醇中以获得有机相；将60mg PVPK30溶于9mL纯化水中制备水相。在1000rmp的转速搅拌下将1mL有机相用注射器以6mL/min(5s)的速度注入水相，制备大粒径的QUE-NCs。

图1为实施例1、实施例2、实施例3制备的槲皮素纳米晶体粒径分布图，通过分别改变槲皮素与稳定剂的浓度得到50nm，140nm和380nm三种粒径的纳米晶体。

图2为实施例1、实施例2、实施例3制备的槲皮素纳米晶体在4℃下的颜色变化和沉淀发生图，图2表明50-QUE-NCs、140-QUE-NCs、380-QUE-NCs在4℃下的稳定性为五天，五天后出现块状沉淀聚沉在瓶底。

表1为实施例1、实施例2、实施例3制备的50-QUE-NCs、140-QUE-NCs、380-QUE-NCs在1、2、3、4、5、6、7、8d的平均粒径及PDI。

实施例4

碱性条件下空气氧化槲皮素原料药以及槲皮素纳米晶体：

取制备完成的50nm-QUE-NCs、140nm-QUE-NCs和380nm-QUE-NCs混悬液一定量于敞口试管中，调节PH值至10，并使之与空气充分接触，相同浓度的槲皮素原料药溶于相同的溶剂作为对照组。在30min，12h，24h，48h之后取定量溶液拍照并挥干制成粉末。后用激光共聚焦显微拉曼光谱仪(inVia plus，雷尼沙，英国)保持激发波长于532nm，研究不同时间段的官能团变化。不同时间段的颜色变化图像如图3所示，不同时间段的官能团变化如图4所示。

如图3所示，随着槲皮素原料药溶液和槲皮素纳米晶体混悬液在空气中暴露的时间越长，其溶液颜色变得越深。槲皮素原料药溶液和槲皮素纳米晶体混悬液在碱性环境中的前30min颜色几近相似，都呈现稻草黄色。在经过12h的空气持续氧化后，三种粒径的槲皮素纳米晶体混悬液颜色加深，呈现橙黄色，而槲皮素原料药溶液颜色变为深褐色。48h后，槲皮素原料药溶液颜色持续变化，变为深黑色。槲皮素纳米晶体混悬液，除140nm-QUE-NCs变为深褐色外，其他两种粒径混悬液颜色略有加深，但仍为橙黄色。后续观察发现，各粒径纳米晶体混悬液在四至五天后才变为深黑色。因此，根据上述实验结果显示，槲皮素纳米晶体较槲皮素原料药而言，颜色变化得更为缓慢。即槲皮素纳米晶体有着延迟槲皮素颜色变化的能力。

如图4所示，槲皮素原料药和槲皮素纳米晶体在碱性条件下被空气氧化后化学结构都出现了变化，第一次变化出现在30min时，第二次变化出现在12h时，24h，48h几乎没有变化。30min时的变化主要集中为b环的C＝C拉伸振动和3-OH弯曲振动消失，12h后的变化较为复杂，主要反映为C＝O拉伸振动变多和各环的O-H的弯曲振动消失。各粒径纳米晶的拉曼图谱的变化几乎相同。将50nm-QUE-NCs和槲皮素原料药对比可知，槲皮素原料药的拉曼图谱比50nm-QUE-NCs在30min时有更多O-H的变化，12h和之后的变化几乎相同。这说明槲皮素纳米晶体比槲皮素原料药更晚被空气氧化，即槲皮素纳米晶有一定抵抗空气氧化的能力。

实施例5

体外抗氧化测试：

(1)PTIO法：配置0.2mg/mL的PTIO工作液；将三种粒径QUE-NCs混悬液均稀释到0.5、0.3、0.2、0.1、0.05mg/mL，以相同浓度的VC溶液为阳性对照；PTIO法检测分为三组实验，分别设定为A0、A1、A2，其中A0组为40μL纯水和160μL PTIO自由基工作液；A1组为40μL不同浓度的实验组和对照组溶液以及160μL PTIO自由基工作液；A2组为40μL不同浓度的实验组和对照组溶液以及160μL纯化水；每组实验均设置三组重复实验；于96孔板中加入各反应液，在37℃条件下静置30min，采用酶标仪于557nm波长处测定A0、A1、A2组的吸光度。按照式(1)计算PTIO的清除率，结果如5。图5表明QUE-NCs清除PTIO自由基的能力均呈浓度依赖性增加，且在三种粒径之间略有不同。在最大浓度(0.5mg/mL)下，380nm-QUE-NCs的PTIO自由基清除能力最强，为67.0％±3.0％，50nm-QUE-NCs的为63.0％±2.0％，140nm-QUE-NCs的为53.3％±3.4％。三种粒径的槲皮素纳米晶体均具有较强的PTIO自由基清除能力。

式(1)PTIO自由基清除率(％)＝[1-(A1-A2)/A0]×100％。

(2)DPPH法：配置0.1mmol/L的DPPH溶液；将三种粒径QUE-NCs混悬液均稀释到0.5、0.3、0.2、0.1、0.05mg/mL，以相同浓度的VC溶液为阳性对照；DPPH法检测分为三组实验，分别设定为A0、A1、A2，其中A0组为40μL纯水和160μL DPPH自由基工作液；A1组为40μL不同浓度的实验组和对照组溶液以及160μL DPPH自由基工作液；A2组为40μL不同浓度的实验组和对照组溶液以及160μL纯化水；每组实验均设置三组重复实验；于96孔板中加入各反应液，在37℃条件下静置30min，采用酶标仪于516nm波长处测定A0、A1、A2吸光度。按照式(2)计算DPPH的清除率，结果如图6。图6表明QUE-NCs的DPPH清除作用均与浓度密切相关，浓度越大，QUE-NCs的DPPH自由基清除作用越强。在0.1mg/mL～0.3mg/mL范围内，50-QUE-NCs的DPPH自由基清除能力甚至优于Vc。当浓度达到0.5mg/mL时，50nm-QUE-NCs，140nm-QUE-NCs和380nm-QUE-NCs的DPPH自由基清除活性分别增加到95.0％±1.0％、92.3％±3.4％和94.4％±0.7％。这说明三种粒径的槲皮素纳米晶体具有极强的DPPH自由基清除能力。

式(2)PTIO自由基清除率(％)＝[1-(A1-A2)/A0]×100％

(3)·OH法：将三种粒径QUE-NCs混悬液均稀释到0.5、0.3、0.2、0.1、0.05mg/mL，以相同浓度的VC溶液为阳性对照；试管中依次加入硫酸亚铁(9mmol/L)、H

式(3)·OH清除率(％)＝[1-(A1-A2)/A0]×100％

实施例6

体内抗氧化测试：

斑马鱼模型：将24hpf的斑马鱼胚胎转移至24孔板，分别加入2mL不同粒径的53μg/mL的QUE-NCs溶液在28℃下孵育，1h后加入5mM H

氧化应激状态会导致细胞DNA、脂质或蛋白质受到不可逆转的氧化损害，从而导致细胞死亡、癌变等。而吖啶橙荧光染色后可与DNA和RNA相互作用，并显现机体上坏死或凋亡细胞，以此评价QUE-NCs对H