一种用于修复组织的黏合剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及材料技术领域，尤其是涉及一种用于修复组织的黏合剂及其制备方法和应用。

背景技术

组织黏合剂是由能够封闭肌肉和皮肤等软组织，并通过黏合力防止受伤组织分离的材料制成的。从广义上讲，医用黏合剂可分为止血剂、密封剂和黏合剂。到目前为止，只有几种商业上可以买到的具有注册商标的组织黏合剂得到认可。最常用的一种是纤维蛋白胶(商品名：

当组织黏合剂用于治疗需要保证一定力学强度的组织时，通常关注材料的黏合强度要求。然而，仅考虑组织黏合剂的强度是不够的，治疗软骨及骨组织需要的最重要的性能是对软骨碎片和骨碎片有足够的黏合强度以及保持碎片空间位置的能力。此外，骨黏合剂还应具有可调的生物降解性(以匹配新生组织的生长速度)、良好的生物相容性和促进组织修复的能力。此外，在应用过程中，组织黏合剂应具有在体温条件下快速固化的能力以黏附封闭组织。

在未来一段时间内，成熟的组织黏合剂不仅在骨科创伤相关的手术中需要，而且在关节外科手术、胸外科手术、口腔外科手术、神经外科手术以及普外科手术中也具有很可观的应用前景。

因此，开发一种相比于传统组织黏合剂具有低生物毒性，在不添加生物制剂的基础上，黏附组织的同时实现促进组织愈合功能的黏合剂是非常必要的。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种用于修复组织的黏合剂，本发明提供的黏合剂低毒性及适用于修复多种组织。

本发明提供了一种用于修复组织的黏合剂的制备方法，包括如下步骤：

A)葵二酸甘油酯、异佛尔酮二异氰酸酯在聚乙二醇的存在下共混，得到混合物；

B)多巴胺修饰的无机纳米粒子与所述混合物混合，反应，即得黏合剂。

优选的，所述多巴胺修饰的无机纳米粒子为无机纳米羟基磷灰石或纳米生物玻璃。

优选的，所述多巴胺修饰的无机纳米粒子的加入量为混合物总质量的0％～10％。

优选的，所述葵二酸甘油酯、异佛尔酮二异氰酸酯的质量比为0.6:1.2；所述聚乙二醇的分子量为200；所述聚乙二醇占混合物的比例为0.2～1.0。

优选的，步骤A)所述共混在氮气保护下进行，保持无水无氧条件；所述共混温度为50℃，共混的时间为20min。

优选的，所述葵二酸甘油酯的制备方法具体为：葵二酸与甘油在氮气保护下，低压缩聚；所述缩聚的压力为40mtorr，时间为6h；所述葵二酸与甘油的质量比为1:1。

优选的，步骤B)所述反应温度为50℃；时间为20min。

本发明提供了一种用于修复组织的黏合剂，由上述技术方案任意一项所述的制备方法制备得到。

本发明提供了上述技术方案任意一项所述的制备方法制备得到的黏合剂在制备修复组织产品中的应用。

本发明提供了一种修复组织产品，包括上述技术方案所述的黏合剂。

与现有技术相比，本发明提供了一种用于修复组织的黏合剂的制备方法，包括如下步骤：A)葵二酸甘油酯、异佛尔酮二异氰酸酯在聚乙二醇的存在下共混，得到混合物；B)多巴胺修饰的无机纳米粒子与所述混合物混合，反应，即得黏合剂。本发明以葵二酸甘油酯和异佛尔酮二异氰酸酯共混制备的双酯类黏合剂为主体，以经多巴胺修饰的无机纳米粒子为填料，制备有机无机复合黏合剂，植入生物组织缝隙中，促进组织修复愈合。该黏合剂相比于临床使用的氰基丙烯酸酯类黏合剂，具有低毒性及适用于修复多种组织(包括但不限于骨骼)的特点，从而解决黏合剂细胞毒性和阻碍组织愈合等诸多问题。

附图说明

图1.葵二酸甘油酯(PGS)1H NMR谱；

图2.PGS、IPDI、PEG以及三种物质共混后的FT-IR光谱图；

图3.手术后8周时间点骨组织病理外像，胫骨长度恢复百分比以及Micro-CT检测骨折区域新生骨的形成，(n＝3)；

图4.手术后12周时间点骨组织病理外像，胫骨长度恢复百分比以及Micro-CT检测骨折区域新生骨的形成，(n＝3)；

图5动物模型造模及治疗外像；(A)3D打印截骨导板(横形骨折)；(B)45°斜形骨折截骨导板设计；(C)45°截骨导板固定于大鼠胫骨进行造模；(D)截骨完成，造模成功；(E)骨黏合剂“液体支架”方式治疗；(F)维持骨折位置，等待“液体支架”固化；(G)磷酸酸蚀剂预处理骨折断端两侧骨皮质表面；(H)PGS+IPDI骨黏合剂固定磷酸预酸蚀过的骨皮质表面。

具体实施方式

本发明提供了一种用于修复组织的黏合剂及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都属于本发明保护的范围。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供了一种用于修复组织的黏合剂的制备方法，包括如下步骤：

A)葵二酸甘油酯、异佛尔酮二异氰酸酯在聚乙二醇的存在下共混，得到混合物；

B)多巴胺修饰的无机纳米粒子与所述混合物混合，反应，即得黏合剂。

本发明提供的一种用于修复组织的黏合剂的制备方法首先制备葵二酸甘油酯。

本发明所述葵二酸甘油酯优选采用如下方法制备：葵二酸与甘油在氮气保护下，低压缩聚；所述缩聚的压力为40mtorr，时间为6h；所述葵二酸与甘油的质量比为1:1。

更优选具体为：反应器加入磁转子干燥处理后，于反应器中加入相同物质的量的葵二酸与甘油，抽真空后充入氮气。油浴锅120℃条件下开始缩聚反应。常压条件下反应24小时后，低压条件(40mtorr)下缩聚反应6h后再次常压条件下反应24小时。最后得到的聚合物。化学反应式如下：

本缩聚反应实验的关键点在于投料时需保证葵二酸和甘油物质的量投料比例为1：1，就可以确保反应准确进行。关键反应条件为缩聚反应过程中的低压聚合时间，本发明人通过对获得PGS预聚体产物进行流变学测试筛选出最佳低压缩聚反应时间(6h)，保证所得PGS预聚体的适用性。制得的PGS使用质谱检测方法测得得平均分子质量为1328(PGS聚合物的聚合度为5)。缩聚反应制得的PGS核磁如图1所示。图1.葵二酸甘油酯(PGS)1H NMR谱。

葵二酸甘油酯、异佛尔酮二异氰酸酯在聚乙二醇的存在下共混，得到混合物。然后立即将反应瓶置于冰上降温冷却。

按照本发明，所述葵二酸甘油酯、异佛尔酮二异氰酸酯的质量比为0.6:1.2；所述聚乙二醇的分子量为200；所述聚乙二醇占混合物的比例为0.2～1.0。

具体的，所述共混在氮气保护下进行，保持无水无氧条件；所述共混温度为50℃，共混的时间为20min。

在本发明其中一个具体实施方式中，上述反应具体为：

反应器加入磁转子干燥处理后，取一定质量的PGS预聚体加入反应瓶中，然后按照PGS预聚体、PEG-200和IPDI物质的量的比为0.6：0.4：1.2计算PEG-200和IPDI的投料量，依次投料混合。

投料过程中反应瓶内无水无氧条件。氮气氛围下保护，于50℃条件下混合20分钟。然后立即将反应瓶置于冰上降温冷却，转移至干燥灭菌消毒过的离心管内保存。物理共混所需的原料PGS、IPDI、PEG以及最终混合产物的红外图谱如图2所示。图2.PGS、IPDI、PEG以及三种物质共混后的FT-IR光谱图。

关于PGS预聚体、PEG-200和IPDI物质的量的比例，在保证PGS预聚体和IPDI物质的量比为0.6：1.2的前提下，PEG-200所占的比例可以在0.2至1.0范围内调整，随着PEG-200所占的比例增加，所获得的混合物流动性也随之增加。

多巴胺修饰的无机纳米粒子与所述混合物混合，反应，即得黏合剂。

本发明首先制备多巴胺修饰的无机纳米粒子。本发明所述多巴胺修饰的无机纳米粒子为无机纳米羟基磷灰石或纳米生物玻璃。

在本发明其中一个具体实施方式中，多巴胺修饰的无机纳米粒子制备方法具体为：

将Tris单体溶解于去离子水中，室温下置于磁力搅拌器上使其完全溶解，并用稀盐酸调节PH至8.5，把配置好的溶液倒入容量瓶中，去离子水定容，封口储存于冰箱中备用。

称量纳米羟基磷灰石/纳米生物玻璃，放入Tris溶液中，使用超声波细胞粉碎机对纳米无机粒子进行超声分散(500W，5min)。将多巴胺盐酸盐加入分散后的悬浮液中，室温下置于磁力搅拌器上搅拌48h。结束后对产物进行离心分离，去离子水洗涤3-4次，然后冷冻干燥，得到棕黑色粉末状产物。

在本发明其中一个具体实施方式中，多巴胺修饰的无机纳米粒子制备方法具体为：

将0.6057g Tris单体溶解于含有450mL去离子水的烧杯中，室温下置于磁力搅拌器上使其完全溶解，并用浓度为1mol/L的稀盐酸调节PH至8.5，把配置好的溶液倒入500mL容量瓶中，去离子水定容，封口储存于冰箱中备用。称量0.2g纳米羟基磷灰石/纳米生物玻璃，放入装有100mL Tris溶液的烧瓶中，使用超声波细胞粉碎机对纳米无机粒子进行超声分散(500W，5min)。将0.2478g多巴胺盐酸盐加入分散后的悬浮液中，室温下置于磁力搅拌器上搅拌48h。结束后对产物进行离心分离，去离子水洗涤3-4次，然后冷冻干燥，得到棕黑色粉末状产物。

将经多巴胺修饰的无机纳米粒子以PGS+IPDI混合物总质量的0％～10％的比例投放于反应瓶中，磁力搅拌下混合均匀，制成PGS+IPDI+nHA和PGS+IPDI+nBG两种配方的有机无机复合黏合剂。

按照本发明，所述反应需保持反应瓶内无水无氧条件，氮气氛围下保护，于50℃条件下混合20分钟。

本发明提供的有机无机复合的黏合剂，不降低黏合强度的前提下，促进组织愈合。

本发明提供了一种用于修复组织的黏合剂，由上述技术方案任意一项所述的制备方法制备得到。

本发明对于上述制备方法已经有了清楚的描述，在此不在赘述。

本发明提供了上述技术方案任意一项所述的制备方法制备得到的黏合剂在制备修复组织产品中的应用。

本发明所述修复的组织可以包括骨组织还可以包括软组织。

本发明提供了一种修复组织产品，包括上述技术方案所述的黏合剂。

本发明提供了一种用于修复组织的黏合剂的制备方法，包括如下步骤：A)葵二酸甘油酯、异佛尔酮二异氰酸酯在聚乙二醇的存在下共混，得到混合物；B)多巴胺修饰的无机纳米粒子与所述混合物混合，反应，即得黏合剂。本发明以葵二酸甘油酯和异佛尔酮二异氰酸酯共混制备的双酯类黏合剂为主体，以经多巴胺修饰的无机纳米粒子为填料，制备有机无机复合黏合剂，植入生物组织缝隙中，促进组织修复愈合。该黏合剂相比于临床使用的氰基丙烯酸酯类黏合剂，具有低毒性及适用于修复多种组织(包括但不限于骨骼)的特点，从而解决黏合剂细胞毒性和阻碍组织愈合等诸多问题。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种用于修复组织的黏合剂及其制备方法和应用进行详细描述。

实施例1聚葵二酸甘油酯的反应条件筛选与制备

反应器加入磁转子干燥处理后，于反应器中加入相同物质的量的葵二酸与甘油，抽真空后充入氮气。油浴锅120℃条件下开始缩聚反应。常压条件下反应24小时后，低压条件(40mtorr)下缩聚反应一段时间(3h/4h/5h/6h/7h)后再次常压条件下反应24小时

本次缩聚反应实验的关键点在于投料时需保证葵二酸和甘油物质的量投料比例为1：1，就可以确保反应准确进行。关键反应条件为缩聚反应过程中的低压聚合时间，我们通过对获得PGS预聚体产物进行流变学测试筛选出最佳低压缩聚反应时间，保证所得PGS预聚体的适用性。

在筛选最佳低压反应条件后，我们将所得最终产物测试核磁以证明反应的准确性。图1.葵二酸甘油酯(PGS)1H NMR谱；由图可以看出在1.25ppm和1.71ppm两处的共振归属于PGS主链中亚甲基质子(d)和(e)；在2.25ppm处的共振信号归属于PGS主链上与酯键羰基相连的亚甲基质子(c)；在5.0ppm处的共振峰对应PGS主链上与羟基相连的次甲基质子(b)；4.25ppm处共振信号归属于主链亚甲基质子(a)。氢谱核磁测试结果验证了在材料制备过程中PGS预聚体的正确合成。

实施例2聚葵二酸甘油酯和异佛尔酮二异氰酸酯混合物的制备

反应器加入磁转子干燥处理后，取一定质量的PGS预聚体加入反应瓶中，然后按照PGS预聚体、PEG-200和IPDI物质的量的比为0.6：0.4：1.2计算PEG-200和IPDI的投料量，依次投料混合。投料过程中要注意保持反应瓶内无水无氧条件。氮气氛围下保护，于50℃条件下混合20分钟。然后立即将反应瓶置于冰上降温冷却，转移至干燥灭菌消毒过的离心管内保存待测试用和下游实验用。

为了明确所得混合物中羟基和异氰酸酯两种基团的存在，我们对混合物样品做了红外检测。傅立叶变换红外谱图(FT-IR)由Bio-Rad Win-IR红外光谱仪检测，利用溴化钾压片法制样测试。红外谱图用来证明我们制备的PGS+IPDI双酯类混合物可以与骨组织断端或骨皮质表面存在的氨基基团发生反应，具有黏附性。图2.PGS、IPDI、PEG以及三种物质共混后的FT-IR光谱图。由图可以看出PGS，PEG在3448cm-1处出现-OH的强而宽的特征峰，IPDI中2275cm-1处具有-N＝C＝O的不对称的伸缩振动吸收峰，通过物理共混获得交联产物，交联产物进行红外分析在3400cm-1处出现-NH-COO-较窄的特征峰，在3448cm-1处仍有-OH的强而宽的特征峰，在1775cm-1处仍有PGS的-C＝O的特征峰，证明实验中所用的原料仍然存在，并生成了交联产物。

这项红外表征测试证明了混合物体系中的-N＝C＝O和-OH都存在，这可以为骨黏合剂与在骨折断端和骨皮质表面存在的活性氨基基团发生反应，产生交联黏合作用提供理论基础。体系中引入的PEG既能稀释PGS预聚体的-OH基团，也能够改善混合物的流动性，为骨黏合剂的可注射性以及定量应用提供了可行性的保证。

实施例3无机纳米粒子(nHA和nBG)的制备

将0.6057g Tris单体溶解于含有450mL去离子水的烧杯中，室温下置于磁力搅拌器上使其完全溶解，并用浓度为1mol/L的稀盐酸调节PH至8.5，把配置好的溶液倒入500mL容量瓶中，去离子水定容，封口储存于冰箱中备用。称量0.2g纳米羟基磷灰石/纳米生物玻璃，放入装有100mL Tris溶液的烧瓶中，使用超声波细胞粉碎机对纳米无机粒子进行超声分散(500W，5min)。将0.2478g多巴胺盐酸盐加入分散后的悬浮液中，室温下置于磁力搅拌器上搅拌48h。结束后对产物进行离心分离，去离子水洗涤3-4次，然后冷冻干燥，得到棕黑色粉末状产物，以用于测试和下游实验。

在制备无机纳米粒子后对经多巴胺修饰前后两种状态下的无机纳米粒子进行粒径、电势和透射电子显微镜等表征以明确无机纳米粒子的特性。无机纳米粒子的粒径和电势由Zeta Potential/BI-90Plus检测，样品浓度为0.1mg/mL。

在1.2的预混操作中，将提前制备好的经多巴胺修饰的无机纳米粒子以PGS+IPDI混合物总质量的1％(0％—10％)的比例投放于反应瓶中，磁力搅拌下混合均匀，制成PGS+IPDI+nHA(下文简称为+nHA)和PGS+IPDI+nBG(下文简称为+nBG)两种配方的功能性复合骨黏合剂，以用于测试和下游实验。

实施例4手术分组及各组骨折的固定方式

72只SD大鼠，术前行随机分组，分为6组，每组12只。分组如下：PGS+IPDI组，+nHA组，+nBG组，磷酸预处理组，康派特组，空白对照组。

将72只SD大鼠少量吸入异氟烷麻醉后，腹腔注射2％戊巴比妥钠2.0mL/kg体重。待麻醉生效后，将大鼠的左下肢按照胫骨前内侧切口位置剃毛备皮，局部消毒并用无菌中单覆盖。沿胫骨中段纵轴方向纵行切开皮肤，切口长约2cm，然后将皮下组织和筋膜分开，暴露胫骨前内侧骨皮质。使用45°斜形截骨导板通过止血钳固定于胫骨前内侧，用电锯在胫骨前内侧按照截骨导板方向截骨获得标准的45°斜形骨折模型。操作过程中尽量小心轻柔，避免造成腓骨骨折及软组织损伤。

骨折模型造好后，根据术前设计的分组分别植入不同的骨黏合剂进行修复治疗。分组如下：PGS+IPDI组是指在骨折缝隙处注入100μL PGS+IPDI骨黏合剂，+nHA组是指在骨折缝隙处注入100μL PGS+IPDI+nHA骨黏合剂，+nBG组是指在骨折缝隙处注入100μL PGS+IPDI+nBG骨黏合剂，磷酸预处理组是指在骨折两端皮质先涂抹100μL磷酸酸蚀剂，酸蚀30秒时间后纱布擦拭，生理盐水冲洗干净擦拭干后，在骨折两端涂抹100μL PGS+IPDI骨黏合剂，康派特组是指在骨折缝隙处注入100μL康派特组织黏合剂，空白对照组是指只造模，未进行任何固定治疗(如图5所示)。固定骨折牢靠后(空白对照组造模后)，用生理盐水冲洗切口，选择3-0和2-0慕丝缝合线将切口逐层缝合。手术前2小时和手术后3天(1次/天)每只大鼠肌肉注射8万单位青霉素以预防感染。这些实验大鼠被关在单独的鼠笼里，以避免相互撕咬下肢手术切口，直到伤口愈合。结果如图5所示，图5.动物模型造模及治疗外像；(A)3D打印截骨导板(横形骨折)。(B)45°斜形骨折截骨导板设计。(C)45°截骨导板固定于大鼠胫骨进行造模。(D)截骨完成，造模成功。(E)骨黏合剂“液体支架”方式治疗。(F)维持骨折位置，等待“液体支架”固化。(G)磷酸酸蚀剂预处理骨折断端两侧骨皮质表面。(H)PGS+IPDI骨黏合剂固定磷酸预酸蚀过的骨皮质表面。

实施例5新生骨形成的Micro-CT分析(8W和12W时间节点)

术后8周和12周两个时间点每组随机处死(过量吸入异氟烷)3只SD大鼠。对每只大鼠双下肢进行完整取材，胫腓骨部分用手术刀和剥离子等骨科手术器械清除表面的软组织，足踝部皮肤等软组织予以保留。对所有标本进行拍照并测量胫骨长度。对左侧胫腓骨标本进行Micro-CT扫描，而后再用4％(w/v)浓度的多聚甲醛固定，以期后续进行病理组织学分析。通过Micro-CT射线照相分析评估了骨折线附近新生骨组织的再生水平。以9μm相机像素尺寸，27.22μm像素尺寸，80kV和100μA扫描样品。在180°角度范围内以0.6°的步长采集数据集，行数为666，列数为1000。扫描后，数据通过NRecon软件与重建角范围为192.60°进行数据重建，并通过CT–VOX对样本进行三维重建分析。使用CT–Analyser软件计算ROI区域中新形成的骨骼的骨形态学参数。将ROI设置为骨折线附近的矩形区域(8W标本ROI矩形大小1mm×4mm；12W标本ROI矩形4mm×7mm)。测量ROI内的骨体积(BV，mm