一种DHA纳米乳液及其制备方法

技术领域

本发明涉及纳米乳液的技术领域，具体涉及一种DHA纳米乳液及其制备方法。

背景技术

DHA是一种人体难以自行合成的ω-3多不饱和脂肪酸，能促进视网膜和脑细胞生长与发育，改善皮肤炎症，且在癌症和心血管疾病的预防治疗方面有一定辅助作用，增强人体自身的生理机能。在代谢过程中，DHA可由α-亚麻酸生成，但生成量偏低，主要是依靠食物补充。而食品中的DHA主要来源于藻油、深海鱼油、南极磷虾油以及部分坚果等。DH A在藻油中是以天然的甘油三酯的形式存在的，且藻油是优质的DHA来源，与鱼油(DH A含量在5％～14％左右)相比较，含量更高。另外DHA藻油的生物利用率更高，易被人体吸收代谢，天然无污染。然而，藻油的腥味和油腻感通常不能直接摄入，其长链脂肪酸的疏水性，使得在普通水溶液中的溶解度微乎其微，并且DHA作为一种长链不饱和脂肪酸极易受环境的影响发生氧化，导致营养成分流失。因此，为保证其DHA理化性质稳定，构建一种纳米递送体系以增加DHA的溶解率及利用率，便于大量投入食品医疗等工业的生产。

相关技术中会使用蛋白类食品凝胶剂或淀粉多糖作为壁材包埋DHA，然而其在溶液环境改变时，例如偏酸碱环境或者盐溶液中，容易发生聚集沉淀，对产品的外观、功能和口感等产生影响。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提出一种DHA纳米乳液及其制备方法。将DHA包埋在递送体系中，能改善其理化稳定性，掩盖藻油原本的腥味和油腻感；并且在各种溶液环境中均可稳定保持。

为了实现上述目的，本发明的实施例在第一方面提出了一种DHA纳米乳液，按照质量百分比，包括：κ-卡拉胶或低熔点琼脂0.1％～0.2％、辛癸酸甘油酯0.5％～0.7％、大豆卵磷脂0.4％～0.6％、乙酸0.8％～1.2％，DHA藻油0.7％～1.2％，余量为水。

根据本发明实施例的一种DHA纳米乳液，通过κ-卡拉胶或低熔点琼脂作为包埋壁材，在保护DHA的活性的同时，可增加乳液在不同溶液环境下的稳定性，不影响人体的吸收及消化。

本发明的实施例在第二方面提出了一种上述的DHA纳米乳液的制备方法，其包括以下步骤：

(1)将DHA藻油、大豆卵磷脂和辛癸酸甘油酯以丙酮作溶剂混合超声，形成油相A液；

(2)将油相A液缓慢分散到水中，得到初乳B液；

(3)将初乳B液超声预处理，旋蒸或吹氮去除丙酮，超滤洗涤，得到未加胶的纳米乳液EDNP；

(4)将κ-卡拉胶或低熔点琼脂用1％乙酸配制，得到胶溶液；

(5)将未加胶的纳米乳液EDNP一比一滴加到胶溶液中，搅拌，得到DHA纳米乳液

根据本发明实施例的一种DHA纳米乳液的制备方法，该方法简单，且通过κ-卡拉胶或低熔点琼脂作为包埋壁材，在保护DHA的活性的同时，可增加乳液在不同溶液环境下的稳定性，不影响人体的吸收及消化。

另外，根据本发明上述实施例提出的一种DHA纳米乳液的制备方法，还可以具有如下附加的技术特征：

可选地，步骤(1)中，超声条件为800W，25min。

可选地，步骤(3)中，超声条件为800W，5min。

可选地，步骤(5)中，将未加胶的纳米乳液EDNP预先超声，再滴加到胶溶液中，超声条件为800W，1min。

可选地，步骤(5)中，搅拌为700r/min磁搅拌2h。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为根据本发明实施例的不同κ-卡拉胶对乳液包封率的影响；

图2为根据本发明实施例的不同低熔点琼脂对乳液包封率的影响；

图3为根据本发明实施例的低熔点琼脂组在不同含量DHA藻油对乳液包封率的影响；

图4为根据本发明实施例的卡拉胶组在不同含量DHA藻油对乳液包封率的影响；

图5为根据本发明实施例的胶体添加量对乳液粒径变化；

图6为根据本发明实施例的藻油添加量对乳液粒径变化；

图7为根据本发明实施例的乳液在不同pH环境下粒径变化；

图8为根据本发明实施例的乳液在不同含量盐溶液下粒径变化；

图9为根据本发明实施例的乳液在不同温度处理后的粒径变化；

图10为根据本发明实施例的常温放置42天乳液中DHA包封率变化；

图11为根据本发明实施例的常温放置42天乳液粒径变化；

图12为根据本发明实施例的常温放置30天乳液中油脂的氧化程度；

图13为根据本发明实施例的体外胆汁盐和胆固醇吸附作用；

图14为根据本发明实施例的乳液中DHA在体外模拟消化中的释放率。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

实验材料表

以下实施例的指标测定：

1、包埋率的测定：

采用气相色谱法对样品的包埋率进行测定：

(1)前处理：取300μL乳液于2mL离心管中，混匀后再加400μL浓HCl，于60-70℃中水浴加热40-50min，然后加入400μL正己烷，超声混匀；再于常温下6000rpm离心2min，取上层部分的正己烷于10mL离心管中，萃取重复2-3次，后置于烘箱中2h除有机试剂；向提取到的油脂中添加1mL 0.8mol/L的KOH-甲醇，搅拌溶解10min后，60℃水浴1h；接着加入1mL 10％浓硫酸-甲醇，60℃水浴1h；冷却后加入1.8mL正己烷-甲基叔丁醚(2:1，v/v)；然后加入饱和NaCl至分层，取上层正己烷；在正己烷中加入无水氯化钙过夜，然后过0.22μm的有机系滤膜。

(2)上样：取100μL前处理后的样品，加入900μL正己烷，摇匀后上样分析。(3)检测条件：选用Rtx-5MS色谱柱(30m×0.32mm×0.25μm)，FID检测器，载气(He)流速为62.9cm/sec，不分流，进样量为1.0μL，进样口温度270℃；柱温(程序升温)：初始温度100℃，保持13min，随后以10℃/min的速率升到180摄氏度，保持6min，再以1℃/min的速率升温至200℃，保持20min，接着以4℃/min的速率升到230℃，保持10.5min，完成检测。

2、粒径的测定：

采用纳米粒度与Zeta电位分析仪对样品的粒径和PDI进行测定。

3、乳液的pH稳定性：

通过HCl和NaOH溶液分别配制pH值为2、4、6、8、10、12的液体体系，与乳液样品均匀混合，并在室温下储存12h后，在室温下测量粒径。

4、乳液的盐稳定性：

通过不同的NaCl水溶液调整不同的样本，以获得不同的盐浓度环境，然后摇晃所有样本1min，以确保所有液体充分混合，在室温下储存12h后，在室温下测量粒径。

5、乳液在不同的解离试剂中的稳定性：

将不同的样品加入不同的解离溶剂(0.5％尿素和6mol/L SDS)中，然后摇晃所有样本1min，以确保所有液体充分混合，在室温下储存24h后，在室温下测量粒径。

6、POV(油脂过氧化值)测量：

油脂酸败的根本原因是不饱和脂肪酸易发生自动氧化，产生过氧化氢，其中的过氧化值能够反映脂肪酸和油脂的氧化程度，采用国标法，将DHA原材料、ECDNP及EDNP分别以时间为变量测定POV值。

7、胆固醇吸附能力的测定：

采用白利等人的邻苯二甲醛(OPA)法评估ECDNP及EDNP对胆固醇的吸附效果。

8、体外结合胆酸盐能力的测定：

参考刘荣等的实验方法，通过模拟人体胃肠消化环境，体外研究乳液与胆酸盐结合的效果。

9、体外模拟消化：

一、模拟消化用的电解质溶液配制

1.胃液电解质

6.9mmol/L KCl、0.9mmol/L KH2PO4、25mmol/L NaHCO3、47.2mmol/L NaCl、0.1mmol/L MgCl2·(H2O)6、0.5mmol/L(NH4)2CO3

2.肠液电解质

6.8mmol/L KCl、0.8mmol/L KH2PO4、85mmol/L NaHCO3、38.4mmol/L NaCl、0.33mmol/L MgCl 2·(H2O)6

二、体外模拟消化模型

模拟胃消化

①取胃电解质250ml，加入0.0042g CaCl

②将口腔消化后的样品与10mL模拟胃电解液混合后，混合体系的pH调节至3.0，体系最终酶活力为2000U/mL，CaCl2浓度为0.075mM，放入37℃、150r/min的恒温摇床中振荡180min。在胃消化过程中，分别于60、120min情况下取样，于95℃下加热10min以灭酶活，并于-20℃下保存。

模拟小肠消化

①取小肠电解质500mL，加入0.0333g CaCl

②将胃消化后的样品与20mL模拟肠液，混合体系的pH调节至7.0，混合体系中胰酶活力为200U/mL，淀粉葡萄糖苷酶活力为150U/mL，CaCl2浓度为0.3mM，胆汁浓度为10mM，放入37℃、150r/min的恒温摇床中振荡360min。在小肠消化过程中，分别于60、120、180、240、300、360min情况下取样，于95℃下加热10min以灭酶活，并于-20℃下保存。

指标的测定

模拟消化过程中的样品处理后，按照方法包封率的测定来计算DHA的释放率以及测定模拟消化样品在消化过程中Zeta电位和粒径的变化。

下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。

实施例1

未加胶初乳的制备：

将250mg DHA和200mg大豆卵磷脂、125μL辛癸酸甘油酯，溶于10mL丙酮中，超声(800W，25min)形成油相A液，然后将A液缓慢分散到20mL的水相中，得到初乳B液。

纳米乳液制备：

使用超声预处理(800W，5min)初乳B液，形成纳米乳液，然后使用旋蒸或吹氮蒸发丙酮。制备的纳米乳液经超滤洗涤3次，获得未加胶的纳米乳液(EDNP)，置于4℃冰箱中保存。以未添加DHA的空白纳米粒子(ENP)为对照。

空白胶乳液的制备：

通过静电作用力将不同含量κ-卡拉胶溶液(0.1w/w、0.2w/w、0.3w/w、0.4w/w)包覆在ENP上。将ENP混合物(超声提前处理；800W，1min)一比一滴加到胶溶液(用1％乙酸配制，称取对应质量的卡拉胶后，加入蒸馏水后高温溶解，至胶溶液为无色透明时根据溶液体积加入1％的乙酸)中，700r/min磁搅拌2h后，得到溶液C。一半的样品储存在4℃，其余样品经冻干获得未加DHA的空白胶乳液(ECNP)。

DHA纳米乳液的制备：

将EDNP(预先超声；800W，1min)一比一滴加到胶溶液(用1％乙酸配制)中，700r/min搅拌2h。一半的样品储存在4℃，其余样品经冻干得到DHA纳米乳液(ECDNP)。

结果如图1所示，在加胶量0.1～0.4(w/w)卡拉胶乳液中DHA的包封率为71.3％～92.5％，且由图5乳液粒径结果可知，粒径变化范围在303.9～5860nm，乳液粒径随加胶量变化较大，故选择包封率较高、粒径较小的一组卡拉胶加胶量配比，即0.2(w/w)的卡拉胶添加量。

实施例2

未加胶初乳的制备：

将250mg DHA和200mg大豆卵磷脂、125μL辛癸酸甘油酯，溶于10mL丙酮中，超声(800W，25min)形成油相A液，然后将A液缓慢分散到20mL的水相中，得到初乳B液。

纳米乳液制备：

使用超声预处理(800W，5min)初乳B液，形成纳米乳液，然后使用旋蒸或吹氮蒸发丙酮。制备的纳米乳液经超滤洗涤3次，获得未加胶的纳米乳液(EDNP)，置于4℃冰箱中保存。以未添加DHA的空白纳米粒子(ENP)为对照。

空白胶乳液的制备：

通过静电作用力将不同含量低熔点琼脂溶液(0.1w/w、0.2w/w、0.3w/w、0.4w/w)包覆在ENP上。将ENP混合物(超声提前处理；800W，1min)一比一滴加到胶溶液(用1％乙酸配制，称取对应质量的低熔点琼脂后，加入蒸馏水后高温溶解，至胶溶液为无色透明时根据溶液体积加入1％的乙酸)中，700r/min磁搅拌2h后，得到溶液C。一半的样品储存在4℃，其余样品经冻干获得未加DHA的空白胶乳液(ECNP)。

DHA纳米乳液的制备：

将EDNP(预先超声；800W，1min)一比一滴加到胶溶液(用1％乙酸配制，称取对应质量的低熔点琼脂后，加入蒸馏水后高温溶解，至胶溶液为无色透明时根据溶液体积加入1％的乙酸)中，700r/min搅拌2h。一半的样品储存在4℃，其余样品经冻干得到DHA纳米乳液(ECDNP)。

结果如图2所示，在加胶量0.1～0.4(w/w)低熔点琼脂乳液中DHA的包封率为27.8％～41.9％，且由图5乳液粒径结果所示，不同加胶量下的低熔点琼脂乳液粒径比较均一，变化范围在253.5～353.8nm，为纳米级乳液粒径的大小，故选择包封率较高的一组低熔点琼脂加胶量配比，即0.1(w/w)的低熔点琼脂添加量。

实施例3

未加胶初乳的制备：

将不同含量DHA(5mg、10mg、50mg、100mg、250mg、350mg)和200mg大豆卵磷脂、125μL辛癸酸甘油酯，溶于10mL丙酮中，超声(800W，25min)形成油相A液，然后将A液缓慢分散到20mL的水相中，得到初乳B液。

纳米乳液制备：

使用超声预处理(800W，5min)初乳B液，形成纳米乳液，然后使用旋蒸或吹氮蒸发丙酮。制备的纳米乳液经超滤洗涤3次，获得未加胶的纳米乳液(EDNP)，置于4℃冰箱中保存。以未添加DHA的空白纳米粒子(ENP)为对照。

空白胶乳液的制备：

通过静电作用力将κ-卡拉胶溶液0.2w/w包覆在ENP上。将ENP混合物(超声提前处理；800W，1min)一比一滴加到胶溶液(用1％乙酸配制，称取对应质量的卡拉胶后，加入蒸馏水后高温溶解，至胶溶液为无色透明时根据溶液体积加入1％的乙酸)中，700r/min磁搅拌2h后，得到溶液C。一半的样品储存在4℃，其余样品经冻干获得未加DHA的空白胶乳液(ECNP)。

DHA纳米乳液的制备：

将EDNP(预先超声；800W，1min)一比一滴加到胶溶液(用1％乙酸配制，称取对应质量的卡拉胶或低熔点琼脂后，加入蒸馏水后高温溶解，至胶溶液为无色透明时根据溶液体积加入1％的乙酸)中，700r/min搅拌2h。一半的样品储存在4℃，其余样品经冻干得到DHA纳米乳液(ECDNP)。

结果如图3所示，在不同DHA藻油添加量乳液(5mg、10mg、50mg、100mg、250mg、350mg)中DHA的包封率为18.7％～61.4％，且由图6乳液粒径结果所示，不同加胶量下的卡拉胶乳液粒径比较均一，变化范围在331.2～560.2nm，为纳米级乳液粒径的大小，故选择包封率较高的一组DHA藻油添加量配比，即12.5mg/mL的DHA藻油添加量。

实施例4

未加胶初乳的制备：

将不同含量DHA(5mg、10mg、50mg、100mg、250mg、350mg)和200mg大豆卵磷脂、125μL辛癸酸甘油酯，溶于10mL丙酮中，超声(800W，25min)形成油相A液，然后将A液缓慢分散到20mL的水相中，得到初乳B液。

纳米乳液制备：

使用超声预处理(800W，5min)初乳B液，形成纳米乳液，然后使用旋蒸或吹氮蒸发丙酮。制备的纳米乳液经超滤洗涤3次，获得未加胶的纳米乳液(EDNP)，置于4℃冰箱中保存。以未添加DHA的空白纳米粒子(ENP)为对照。

空白胶乳液的制备：

通过静电作用力将低熔点琼脂溶液0.1w/w包覆在ENP上。将ENP混合物(超声提前处理；800W，1min)滴加到胶溶液(用1％乙酸配制，称取对应质量的低熔点琼脂后，加入蒸馏水后高温溶解，至胶溶液为无色透明时根据溶液体积加入1％的乙酸)中，700r/min磁搅拌2h后，得到溶液C。一半的样品储存在4℃，其余样品经冻干获得未加DHA的空白胶乳液(ECNP)。

DHA纳米乳液的制备：

将EDNP(预先超声；800W，1min)滴加到胶溶液(用1％乙酸配制)中，700r/min搅拌2h。一半的样品储存在4℃，其余样品经冻干得到DHA纳米乳液(ECDNP)。

结果如图4所示，在不同DHA藻油添加量乳液(5mg、10mg、50mg、100mg、250mg、350mg)中DHA的包封率为41.08％～66.70％，且由图6乳液粒径结果所示，不同加胶量下的低熔点琼脂乳液粒径比较均一，变化范围在312.6～615.1nm，为纳米级乳液粒径的大小，故选择包封率较高的一组DHA藻油添加量配比，即12.5mg/mL的DHA藻油添加量。

实施例5

未加胶初乳的制备：

将12.5mg/mL DHA和200mg大豆卵磷脂、125μL辛癸酸甘油酯，溶于10mL丙酮中，超声(800W，25min)形成油相A液，然后将A液缓慢分散到20mL的水相中，得到初乳B液。

纳米乳液制备：

使用超声预处理(800W，5min)初乳B液，形成纳米乳液，然后使用旋蒸或吹氮蒸发丙酮。制备的纳米乳液经超滤洗涤3次，获得未加胶的纳米乳液(EDNP)，置于4℃冰箱中保存。以未添加DHA的空白纳米粒子(ENP)为对照。

空白胶乳液的制备：

通过静电作用力将0.1％低熔点琼脂溶液0.2％κ-卡拉胶包覆在ENP上。将ENP混合物(超声提前处理；800W，1min)滴加到胶溶液(用1％乙酸配制，称取对应质量的卡拉胶或低熔点琼脂后，加入蒸馏水后高温溶解，至胶溶液为无色透明时根据溶液体积加入1％的乙酸)中，700r/min磁搅拌2h后，得到溶液C。一半的样品储存在4℃，其余样品经冻干获得未加DHA的空白胶乳液(ECNP)

DHA纳米乳液的制备：

将EDNP(预先超声；800W，1min)滴加到胶溶液(用1％乙酸配制)中，700r/min搅拌2h。一半的样品储存在4℃，其余样品经冻干得到DHA纳米乳液(ECDNP)。

对本实施例的DHA纳米乳液进行不同环境下乳液的稳定性的测定：

结果如图7所示，随着pH的增加，乳液粒径均呈现逐渐减小的趋势，在强酸性(pH2)溶液环境下，粒径结果均超过1000nm，但在弱酸性或者碱性条件下，乳液粒径比较均一，在245.5～729.8nm之间浮动，说明该体系在弱酸或碱性条件下具有良好的稳定性。

结果如图8所示，随着盐浓度的增加，乳液粒径均呈现逐渐增大的趋势，在1000mM的盐溶液环境下，卡拉胶、低熔点琼脂、未加胶组粒径结果均超过1000nm，但在＜1000mM的盐溶液环境下，乳液粒径稳定性较好，其粒径范围在255.3～952.6nm之间，说明该体系在低盐环境条件下具有良好的稳定性但在高盐浓度环境下易出现沉淀。

结果如图9所示，随着环境温度的增加，乳液粒径均呈现逐渐增大的趋势，但整体变化趋势不大，卡拉胶、低熔点琼脂、未加胶组粒径结果均未超过1000nm，粒径变化范围在100nm左右，乳液粒径稳定性较好，其粒径300nm左右，说明该体系在常温及一些高温环境下均不易产生沉淀，该体系对温度具有一定抗性。

结果如图10所示，随着常温放置时间的增加，乳液包封率逐渐减小，未加胶和添加卡拉胶、低熔点琼脂乳液的包封率变化差异不大，说明添加胶体对该体系对DHA的包封率无太大影响，在21天左右，乳液中DHA包封率降为50％，仍有较高含量的DHA包覆在乳液中，说明该体系对DHA具有一定的保藏作用。

结果如图11所示，随着常温放置时间的增加，乳液包封率有小幅浮动，但整个体系的粒径大小变化不明显，在21天左右，乳液粒径大小仍维持稳定，说明该体系对DHA具有一定的保藏作用。

结果如图12所示，油脂POV值是反应油脂氧化程度的一个指标，新线油脂的POV值一般小于10meq/kg，当油脂POV值在30～40meq/kg时会有明显酸败味，从图12中可看到整个体系在放置30天后POV值均小于10，且添加卡拉胶、低熔点琼脂的氧化程度明显低于未加胶组，说明该体系对DHA具有一定保护作用，且添加胶体后抗氧化程度更高。

结果如图13所示，胆酸盐是胆汁中参与脂肪消化和吸收的主要成分。胆酸盐与脂肪酸甘油—酯等结合，形成水溶性复合物，促进脂肪消化产物的吸收，并能促进脂溶性维生素的吸收。在人体内胆酸盐在体内含量一直处于一个动态平衡状态，95％的胆酸盐在小肠末端被重新吸收后和胆固醇、磷脂等又重新合成为胆汁。胆酸盐和胆固醇被一些食品成分吸附排出后能降低人体对脂肪的吸收以及血液中胆固醇的含量，故胆酸盐和胆固醇吸附常用于评价是否有降血脂能力。图13中显示，未加DHA的乳液体系对胆酸盐的结合量在60％～80％左右，说明该体系本身具有良好的降血脂能力，添加了DHA的乳液体系结合能力虽然变低，其结合量也在20％～70％左右，说明该体系能良好的与胆汁盐结合。另外，在胆固醇吸附方面，也出现了类似的现象，未添加DHA的乳液对胆固醇吸附能力明显高于添加了DHA的乳液，但添加DHA的乳液对胆固醇的吸附量仍有15％-50％，说明该乳液在维持人体血脂平衡方面具有一定作用。

结果如图14所示，乳液在胃中的释放率只有30％左右，在小肠中逐步释放完全，且整个体系的DHA释放与胶体添加无明显关系，说明添加胶体的体系在具有降血脂、保护油脂不被氧化功能的同时，不影响DHA在人体内的释放吸收。

综上，根据本发明的实施例，。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。