一种酶组合物应用于制备防止肉鸡霉菌毒素中毒的饲料

技术领域

本发明属于肉鸡饲料的技术领域，具体涉及一种酶组合物应用于制备防止肉鸡霉菌毒素中毒的饲料。

背景技术

动物体内存在氧化还原平衡，但当平衡被破坏时，就会引发氧化应激，从而危害动物健康生长。在肉鸡生产中，饲料霉菌毒素的污染是导致氧化应激的主要因素之一，因为饲料及原料(如玉米)在生产、运输、加工、贮存和饲喂等过程中易受到各种霉菌的污染，同时由于养殖用户难以时刻注意饲料发霉的情况，因而肉鸡易摄入霉菌污染的饲料，结果往往导致肉鸡出现采食下降、体态瘦弱、肌腺胃炎、氧化应激甚至死亡等中毒症状，给养殖生产造成巨大的经济损失。

因此，为解决上述技术问题，亟需提供能够防止肉鸡霉菌毒素中毒的饲料。现有技术中，常见的脱霉方法包括物理方法如吸附剂，往往针对某种霉菌毒素有一定效果，但饲料中大多是受到多种霉菌污染；化学方法如添加臭氧、氨或者碱，往往造成对饲料营养物质破坏，并且适口性差；微生物法，由于工业技术限制以及价格并不实惠而并未大量应用。在肉鸡养殖生产中，葡萄糖氧化酶可作为防霉剂，防霉效果好，而且不影响适口性和对营养物质吸收，但由于催化反应产生的过氧化氢属于一种活性氧，过多会对机体造成氧化损失，同时对该催化反应有抑制作用，导致作用效果降低；还有采用含有酿酒酵母yk18发酵培养物，其中包括酿酒酵母yk18活菌、酿酒酵母细胞壁及酿酒酵母发酵培养基，培养活菌及培养物需要较为昂贵的费用；还有的仅是对饲料和粪便的霉菌毒素含量进行测定，尽管对霉菌毒素降解率确实有一定提高，但未对肉鸡生产效果进行比较，不能够从实际生产中反应出能够防止肉鸡霉菌毒素中毒，且未能知其降解霉菌毒素的原因。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种酶组合物应用于制备防止肉鸡霉菌毒素中毒的饲料。

本发明的技术内容如下：

本发明提供了一种酶组合物应用于制备防止肉鸡霉菌毒素中毒的饲料，所述酶组合物的组分包括β-D-葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶；

所述酶组合物占饲料用量的0.1～0.6％；

所述酶组合物中β-D-葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的使用质量比为1:(1.5～2)，两者的协同作用为：在葡萄糖氧化酶催化的氧气氧化葡萄糖的过程中，与所需产物葡萄糖酸一起产生的副产物过氧化氢会对葡萄糖氧化酶的催化活性产生抑制作用，而过氧化氢酶能够催化过氧化氢分解生成氧气和水，不仅解除过氧化氢对葡萄糖氧化酶的催化活性产生抑制作用，而且生成的氧气和水促进了葡萄糖氧化酶催化反应的底物浓度；

所述β-D-葡萄糖氧化酶的酶活性≥15U/g；

所述过氧化氢酶的酶活性≥50U/g。

本发明还提供了一种防止肉鸡霉菌毒素中毒的饲料，所述饲料的组分包括玉米、豆粕、大豆油、磷酸氢钙I型、石粉、微量元素预混料、维生素预混料、L-赖氨酸硫酸盐、DL-蛋氨酸、氯化胆碱、氯化钠、甜菜碱以及上述酶组合物；

按重量份数计算，所述饲料中，所述饲料中，玉米占600～650份、豆粕占290～335份、大豆油占18～35份、磷酸氢钙I型占12～20份、石粉占8～11份、微量元素预混料占2份、维生素预混料占4份、L-赖氨酸硫酸盐占0.1～2.5份、DL-蛋氨酸占1～3份、氯化胆碱占0.5～1份、氯化钠占2～3份、甜菜碱占0～0.2份以及上述酶组合物占1～6份；

所述微量元素预混料中，铁含量为84～180mg/kg、铜含量为8.4～18mg/kg、锌含量为56～120mg/kg、锰含量为70～150mg/kg；

所述维生素预混料中，维生素A含量为1900～2000IU/kg、维生素D3含量为750～800IU/kg、维生素E含量为7～8IU/kg、维生素K3含量为0.4～0.6mg/kg、维生素B1含量为0.4～0.6mg/kg、维生素B2含量为1.5～2mg/kg、维生素B7含量为1～1.5mg/kg、烟酰胺含量为9～9.5mg/kg；

进一步地，维生素A含量为1925IU/kg、维生素D

本发明的有益效果如下：

本发明的酶组合物应用于制备防止肉鸡霉菌毒素中毒的饲料，所采用得酶组合物为葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的混合物，具有解除霉菌毒素的初步机制，作为防霉剂，能够防止肉鸡霉菌毒素中毒，两者在酶催化反应过程中具有协同作用，在葡萄糖氧化酶的基础上添加过氧化氢酶，在促进动物生长性能、肠道健康、免疫等方面存在协同作用，同时都以抗氧化剂的角色抵抗霉菌毒素带来的氧化应激；过氧化氢酶催化过氧化氢分解，能够促进并稳定葡萄糖氧化酶的催化反应，使葡萄糖氧化酶发挥更好的催化效果；

本发明的饲料，相比现有技术，能够显著提高肉鸡的生长性能、降低肉鸡受霉菌的肌胃炎症的严重程度、改善十二指肠、空肠和回肠中的绒毛形态和结构、显著提高肉鸡肠道粘膜紧密连接蛋白基因表达、显著改变了饲喂发霉玉米肉鸡盲肠微生物区系的组成和结构，并且通过减少有害菌繁殖和增加有益菌来维持肠道微生物区系平衡、减少肉鸡肝脏的病变、显著提高抗氧化能力来预防肉鸡霉菌毒素中毒以及降低肉鸡体内的炎症水平。总之，本发明通过改善肠道屏障功能、调节盲肠微生物区系、提高抗氧化能力和增强免疫功能来防止肉鸡霉菌毒素中毒，最终对肉鸡的日增重和料重比等生长性能具有一定改善作用。

附图说明

图1为肌胃病理评分结果图；

图2为饲喂后肉鸡的十二指肠、空肠和回肠中绒毛形态和结构图；

图3为评估肉鸡盲肠微生物β多样性的PCoA图；

图4为饲喂后的肉鸡肝脏组织形态图；

图5为饲喂后的肉鸡肝脏组织中病变数量及面积结果图。

具体实施方式

以下通过具体的实施案例以及附图说明对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。

若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。

实施例1

一种酶组合物应用于制备防止肉鸡霉菌毒素中毒的饲料，所述饲料如表1所示，其中酶组合物的组分包括质量比为1:2的β-D-葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的混合物；

所述β-D-葡萄糖氧化酶的酶活性≥15U/g；

所述过氧化氢酶的酶活性≥50U/g。

表1饲料组分和营养水平(重量份)

所述微量元素预混料中，铁含量为84～180mg/kg、铜含量为8.4～18mg/kg、锌含量为56～120mg/kg、锰含量为70～150mg/kg；

所述维生素预混料中，维生素A含量为1925IU/kg、维生素D

实施例2

一种酶组合物应用于制备防止肉鸡霉菌毒素中毒的饲料，所述饲料如表2所示，其中酶组合物的组分包括质量比为1:1.5的β-D-葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的混合物。

表2饲料组分和营养水平(重量份)

所述微量元素预混料同实施例1；

所述维生素预混料中，维生素A含量为1900IU/kg、维生素D3含量为750IU/kg、维生素E含量为7IU/kg、维生素K3含量为0.4mg/kg、维生素B1含量为0.4mg/kg、维生素B2含量为1.5mg/kg、维生素B7含量为1mg/kg、烟酰胺含量为9mg/kg。

实施例3

一种酶组合物应用于制备防止肉鸡霉菌毒素中毒的饲料，所述饲料如表3所示，其中酶组合物的组分包括质量比为1:1.8的β-D-葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的混合物。

表3饲料组分和营养水平(重量份)

所述微量元素预混料同实施例1；

所述维生素预混料中，维生素A含量为2000IU/kg、维生素D3含量为800IU/kg、维生素E含量为8IU/kg、维生素K3含量为0.6mg/kg、维生素B1含量为0.6mg/kg、维生素B2含量为2mg/kg、维生素B7含量为1.5mg/kg、烟酰胺含量为9.5mg/kg。

所述酶组合物的用量可根据霉菌毒素污染严重程度或者肉鸡中毒程度应当做出适当调整。

试验例

1.试验动物与分组

选择1日龄土皇2号雏鸡(麻黄鸡)900羽进行试验，设置3个处理组：

CON组：饲喂正常玉米组成的基础饲粮；

MC组：饲喂由发霉玉米组成的基础饲粮；

MCG组：饲喂添加了酶组合物的由发霉玉米组成的基础饲粮(即实施例1的饲料)；

每个处理组设置6个重复组，每个重复50羽鸡，不同肉鸡饲养阶段(1～21天和22～42天)，在玉米和饲料中所得霉菌毒素的含量如表4所示。

表4不同饲养阶段玉米和饲料中霉菌毒素(μg/kg)的含量

其中，AFB1为黄曲霉毒素B1、DON为呕吐毒素、ZEN为玉米赤霉烯酮。

比较不同酶处理组队肉鸡生长性能的影响，设置空白对照组、MC组、MCG组以及对照组1(葡萄糖过氧化酶+载体的由发霉玉米组成的基础饲粮)、对照组2(葡萄糖过氧化酶+玉米淀粉的由发霉玉米组成的基础饲粮)，选择1日龄土皇2号雏鸡(麻黄鸡)1200羽进行试验，4个处理组，每个处理组设置6个重复组，每个重复50羽鸡，不同肉鸡饲养阶段(1～21天和22～42天)。

记录不同处理组饲料对肉鸡生长性能的影响，结果如表5所示。

表5不同处理组饲料对肉鸡生长性能的影响

由表5可见，本发明实施例1的饲料的对肉鸡的饲喂，日增重是最高(除了1-21d)，料重比(日均采食量/日增重)和日均采食量最低，表明同时添加葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶效果优于单一添加葡萄糖氧化酶。

2.试验过程

试验开始前对鸡舍进行甲醛熏蒸消毒与火焰消毒。采用地面平养，自由采食，自由饮水的饲养方式；0-7d光照24h，8-42d光照22h，停2h；试验期间疫苗参照梁平免疫程序；整个饲养试验持续42天，记录肉鸡在第1、21和42天体重以及每周的采食量。

3.屠宰试验

在肉鸡饲养至42日龄时，在每个重复中随机抽取2只鸡，进行屠宰、采血和组织采样。

1、解剖时观察肌腺胃健康症状并评分

评分规则为：1分，“正常”是指没有出血或溃疡；2分，“轻度”是指少量出血和溃疡；3分，“严重”是指大出血和溃疡。

2、组织采样

2.1组织切片采样：采集十二指肠、空肠、回肠中段1cm左右肠道样品在冰PBS缓冲液中清洗食糜，放入福尔马林固定液中保存；同时采集肝脏1cm3左右大小，放入福尔马林固定液中保存；用于观察肠道和肝脏组织形态和病变情况；

组织切片制作送至武汉塞维尔公司；

2.2肠道粘膜采样：取肉鸡十二指肠、空肠、回肠中段约5cm，用预冷的生理盐水冲去食糜，然后用载玻片轻轻刮取肠道粘膜，装入2mL冻存管后，迅速放入液氮中保存；用于肠道紧密连接蛋白基因表达、抗氧化指标和免疫指标测定；

2.3肠道内容物采样：采集盲肠内容物，放入离心管中液氮速冻，用于微生物16SrDNA测序。

4.指标测定

4.1肠道紧密连接蛋白基因表达测定

采集肉鸡十二指肠、空肠、回肠道粘膜组织样品放于离心管，加入磁珠，放于匀浆机进行匀浆，再离心，取上清液进行分析，取部分上清液通过Trizol法进行总RNA提取，将提取的RNA进行1ststrandcDNA合成反应反转录合成cDNA，最后通过实时荧光定量PCR(qPCR)检测肠道紧密连接蛋白基因(claudin-1、occludin和zo-1)表达情况；

4.2抗氧化指标检测

屠宰采集肉鸡的肝脏和肠道粘膜组织样品，进行抗氧化指标的测定；

每个重复随机选2只鸡，取将肠道黏膜或肝脏样品进行匀浆、离心，取上清液进行分析，通过TBA法测定丙二醛(MDA)水平以及采用比色法测定总抗氧化能力(T-AOC)，采用商用抗氧化试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定肝脏中抗氧化相关指标；

4.3免疫指标检测

采集血清和肠粘膜进行炎症因子水平的测定。

通过ELISA试剂盒(上海酶免)测定肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)水平。

5.结果

5.1肉鸡生长性能

表6本发明饲料对肉鸡生长性能的影响

由上表可见，在试验前期即1-21d，与CON组相比，在饲喂发霉玉米后，肉鸡的日均采食量显著降低2.34％(P<0.05)，21日龄体重、日均采食量和日增重分别降低1.44％、2.34％和1.62％(P>0.05)，料重比增加1.28％(P>0.05)；与MC组相比，饲喂MCG组饲料后，肉鸡的均重(21d)和日增重分别提高1.66％、0.06％和1.86％(P>0.05)，料重比降低1.30％(P>0.05)；

在试验后期即22-42d，与CON相比，在饲喂发霉玉米后，肉鸡的42日龄体重显著降低3.93％(P<0.05)，日均采食量和日增重分别降低1.19％和5.39％(P>0.05)，料重比增加4.15％(P>0.05)；与MC组相比，饲喂MCG组饲料后，肉鸡的42日龄体重、日均采食量和日增重分别提高2.43％和3.13％(P>0.05)，料重比降低2.39％(P>0.05)；

在整个试验期间即1-41d，与CON组相比，在饲喂发霉玉米后，肉鸡的日增重显著降低4.10％(P<0.05)，日均采食量降低1.49(P>0.05)，料重比增加2.87％(P>0.05)；与MC组相比，饲喂MCG组饲料后，肉鸡的日增重增加2.54％(P>0.05)，料重比降低2.79％(P>0.05)。

5.2肉鸡肌胃

如图1所示，为肌胃病理评分，其中，CON组肉鸡除了一个症状外，所有肌胃都表现为健康状态；与CON组相比，在肉鸡被饲喂发霉玉米后，MC组几乎一半数量的肌胃出现出血和局灶性溃疡(P＝0.061)的炎症状态；与MC组相比，饲喂MCG组降低了肌胃炎症的严重程度(P>0.05)。

5.3肉鸡肠道形态

如图2所示，为十二指肠、空肠和回肠中绒毛形态和结构图，可见，CON组绒毛较多，排列整齐，长度较长，而在肉鸡被饲喂发霉玉米(MC组)后，绒毛数量较少，有断裂和粘连现象，在饲喂本发明饲料(MCG组)后，特别是在十二指肠中可以明显看出绒毛形态得到一定改善。

表7本发明饲料对肉鸡肠道绒毛形态的影响

由表7可见，在肉鸡被饲喂发霉玉米后，十二指肠中隐窝深度显著加深(P<0.05)；与MC组相比，在饲喂MCG组饲料后，十二指肠中隐窝深度显著变浅(P<0.05)；各个试验组中绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度均无显著差异(P＞0.05)；然而，在肉鸡被饲喂发霉玉米后，绒毛高度/隐窝深度在各个试验组中是最低的，其比值越低表示营养物质吸收能力越低。

5.4肉鸡肠道粘膜紧密连接蛋白基因表达

表8本发明饲料对肉鸡肠道紧密连接蛋白基因表达的影响

如表8所示，与CON组相比，在肉鸡被饲喂发霉玉米后，肠道紧密连接蛋白基因表达并未显著发生改变(P＞0.05)，但在回肠中Occludin、claudin-1和zo-1的相对mRNA表达均处于最低水平；与MC组相比，在饲喂MCG组饲料后，十二指肠、空肠和回肠中claudin-1和zo-1的相对mRNA表达水平均显著提高(P<0.05)，并且回肠中Occludin的相对mRNA表达水平也得到显著提高(P<0.05)。

5.5肉鸡盲肠微生物区系

表9本发明饲料对肉鸡盲肠微生物α多样性的影响

物种数目和香农指数用于评估肉鸡盲肠微生物α多样性，由表9可见，CON组和MC组观察到的物种数目和香农指数差异不显著(P＞0.05)；与MC组相比，饲喂MCG组饲料显著降低了物种数目和香农指数(P＜0.05)；这表明本发明饲料后可以显著降低饲喂发霉玉米肉鸡盲肠微生物区系的α多样性；

再如图3可见，主坐标分析(PCoA)用于评估肉鸡盲肠微生物β多样性，其结果显示，在饲喂MCG组饲料后，肉鸡盲肠微生物结构组成显著不同于CON组和MC组(P＜0.05)；

为了确定各个试验组之间盲肠微生物区系的差异，分别在门、属和种的水平上分析了微生物结构组成，如表9所示。

表10本发明饲料对肉鸡盲肠微生物群组成的影响

在门水平上，与CON组和MC组相比，饲喂MCG组饲料显著增加了放线菌门(Actinobacteria)的相对丰度(P＜0.05)；在属水平上，饲喂MCG组饲料显著增加了双歧杆菌属(Bifidobacterium)和乳酸杆菌属(Lactobacillus)的丰度(P＜0.05)，并且显著降低梭菌的丰度(P＜0.05)；在种水平上，饲喂MCG组饲料显著降低了大肠杆菌(Escherichiacoli)和螺旋藻梭菌(Clostridium spiroforme)的丰度(P＜0.05)；

总之，饲喂本发明饲料显著改变了饲喂发霉玉米肉鸡盲肠微生物区系的组成和结构，并且通过减少有害菌繁殖和增加有益菌来维持肠道微生物区系平衡。

5.6肉鸡肝脏组织形态

如图4所示，通过对肝脏切片的观察，发现饲喂发霉玉米肉鸡的肝脏组织出现许多病变，如肝细胞核增大(图中矩形框内箭头)和炎性细胞浸润(图中黑色箭头)。

同时统计图4中病变的数量和面积(图中曲线包围的区域)，如图5所示，与CON组相比，饲喂MC组饲料肉鸡的肝组织中有更多病变数量和面积的损伤(P＜0.05)，而饲喂MCG组饲料减少了病变的发生数量(P＝0.079)。

5.7肉鸡体内抗氧化指标

表11本发明饲料对玉米肉鸡体内抗氧化水平的影响

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由表11可见，与CON组相比，饲喂MC组饲料肉鸡血清(P＝0.067)和回肠(P＝0.076)中MDA浓度更高，并且空肠中T-AOC浓度更低(P＝0.098)；与MC组相比，饲喂MCG组饲料能够显著降低血清和空肠中的丙二醛浓度(P＜0.05)以及显著增加血清和十二指肠中总抗氧化能力(P＜0.05)。

这些结果表明，饲喂本发明饲料能够通过提高体内抗氧化能力来预防肉鸡霉菌毒素中毒。

5.8肉鸡体内炎症水平

表12本发明饲料对肉鸡体内炎症水平的影响

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由表12可见，与CON组相比，饲喂MC组饲料肉鸡的十二指肠中白介素-6的浓度显著提高(P＜0.05)以及空肠中肿瘤坏死因子-α的浓度极显著提高(P＜0.001)；与MC组相比，饲喂MCG组饲料显著降低血清中IL-6的浓度(P＜0.05)以及显著降低血清和空肠中TNF-α的浓度(P＜0.05)。

综上，饲喂发霉玉米会引起肉鸡出现霉菌毒素中毒症状，如肌胃炎、肠道屏障受损、肝脏病变、抗氧化能力下降、炎症反应增强，最终导致生长性能下降。而饲喂本发明的饲料可以通过改善肠道屏障功能、调节盲肠微生物区系、提高抗氧化能力和增强免疫功能来防止肉鸡霉菌毒素中毒，最终对肉鸡的日增重和料重比等生长性能具有一定改善作用。