一种含鸡皮果的功能性复合酵素及其制备方法

技术领域

本发明涉及食品加工技术领域，具体涉及一种含鸡皮果的功能性复合酵素及其制备方法。

背景技术

细叶黄皮(学名：Clausena anisum-olens(Blanco)Merr.)又称鸡皮果、山黄皮。是亚热带野生植物，为芸香科多年生常绿灌木或小乔木，喜温暖湿润、阳关充足的气候环境。广西壮族自治区崇左市是我国最重要的细叶黄皮产区，其分布范围广、资源丰富。目前崇左市大力推广种植，仅龙州县种植的鸡皮果就达2万多亩，但对于鸡皮果的开发利用基础薄弱，当地主要以腌制的方法来加工鸡皮果。

根据文献报道，鸡皮果不仅营养丰富，含有丰富的挥发油，对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌等具有一定的抑制作用，具有广谱的杀菌活性；另外果仁还含有丰富的总黄酮，具有较强的抗氧化能力，提示鸡皮果作为功能性食品具有很大的开发潜力。但因果仁苦涩，大部分果仁在加工时被当做垃圾丢弃，每年丢弃的果仁达几百万公斤，造成极大的浪费。

超氧化物歧化酶Orgotein(Superoxide Dismutase,SOD)，别名肝蛋白、简称:SOD，SOD是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质，对人体不断地补充SOD具有抗衰老的特殊效果。

灵芝、枸杞、黄精、黄芪均为功能性食品，含有较多的活性多糖，具有多方面的功效，抗衰老效果显著。本申请人在实验过程中发现，灵芝、枸杞、黄精、黄芪与鸡皮果复合制成的酵素中超氧化物歧化酶的活性得到了显著的提高，远超于仅使用其中一种或多种原料制成的酵素中的超氧化物歧化酶的活性，具有良好的保健功效。公开号为CN111357988A的中国发明专利一种富硒复合酵素及其制作工艺中公开了一种酵素产品，由鲜三七花、苹果、黄芪、灵芝、谷胱甘肽、鲜黄精、枸杞子、鲜铁皮石斛、鲜玫瑰花按质量比为10:20:5:1:1:10:10:5:10混合，并采用嗜酸乳杆菌和富硒酵母菌对天然植物进行分级发酵，能够使发酵过程更为充分，植物提取与发酵相结合，使天然植物中包含的丰富营养成分的代谢更为完全，产生更多的风味物质和营养成分。但是该专利申请中并没有对SOD活性进行研究，也没有使用鸡皮果这种原料。目前还没有将灵芝、枸杞、黄精、黄芪与鸡皮果一起发酵制作酵素的相关报道。

发明内容

本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种含鸡皮果的功能性复合酵素及其制备方法，本发明的复合酵素利用了鸡皮果全果，加工工艺营养损失少，并以鸡皮果、灵芝、黄精、黄芪、枸杞为原料研制，不仅营养价值丰富而且SOD活性高。具有较好的抗氧化抗衰老保健功能。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种含鸡皮果的功能性复合酵素的制备方法，包括以下步骤：

(1)鸡皮果的选择与清洗：选八、九成熟的新鲜鸡皮果，清洗干净；

(2)辅料的处理：按重量份称取枸杞10～50份，灵芝粉20～70份、黄精粉10～50份、黄芪粉10～50份，水200～300份；将枸杞浸泡后与灵芝粉、黄精粉、黄芪粉混匀，加入剩余水，一起放入超声波提取器中进行提取，提取完毕后过滤去渣，得多糖提取液；

(3)鸡皮果果汁的制备：按重量份取鸡皮果40～60份，多糖提取液300～400份，将鸡皮果和多糖提取液放入榨汁机中，榨成鸡皮果复合果汁待用；

(4)鸡皮果功能酵素一次发酵：将鸡皮果复合果汁放入发酵容器中，加入白糖，调节糖度为18～25°Brix，杀菌后加入酵母菌，酵母菌的加入量为调节糖度后的鸡皮果复合果汁重量的0.7～1.6％，在25～37℃的温度下发酵，得一次发酵产物；

(5)鸡皮果功能酵素二次发酵：向所得的一次发酵产物中加入白糖，调节糖度为18～23°Brix，杀菌后加入酵素粉，酵素粉的加入量为调节糖度后的一次发酵产物重量的0.8～2.0％，在32～37℃的温度下发酵，过滤，得含鸡皮果的功能性复合酵素。

本发明中，优选地，步骤(1)中所述新鲜鸡皮果是无病虫害、无霉烂的新鲜鸡皮果。

本发明中，优选地，步骤(2)中所述灵芝粉、黄精粉和黄芪粉是将干燥的灵芝、黄精和黄芪打粉，过100目筛得到。

本发明中，优选地，步骤(2)中所述提取是在功率为50～70W、温度为50～70℃的条件下提取20～50min。

本发明中，优选地，步骤(4)和步骤(5)中所述的杀菌是在温度为85～90℃的水浴中进行杀菌，杀菌时间为15～20min。

本发明中，优选地，步骤(4)中所述的发酵的时间为72～108h，间隔4～6h排一次气。

本发明中，优选地，步骤(5)中所述的发酵的时间为54～108h。

本发明所用的鸡皮果，具有消食健胃、理气健脾、行气止痛等功效。鸡皮果果仁挥发油对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌及杀螟杆菌具有较强的抑制作用，比食品常用的防腐剂山梨酸钾抑菌作用强；本发明使用带果仁、果皮的果实做成的产品，不仅能保留营养和功能性成份，具有更佳的抑菌及抗氧化效果；通过两步发酵的方法使果仁脱苦脱涩，充分利用了鸡皮果果仁，获得一种口感较好的风味食品。

灵芝又名芝草、瑞草、仙草，属于担子菌钢、多孔菌科、灵芝属真菌。据统计，灵芝多糖生物活性作用广泛，目前已被报道的生物活性作用有免疫调节、抗氧化、抗肿瘤、降血糖、抗衰老等。其中灵芝多糖抗衰老作用，在开发保健品，延缓人衰老的应用上具有非常好的应用前景。

枸杞是一种名贵药材，其含枸杞多糖、类胡萝卜素和黄酮等多种活性成分，具有调节免疫功能、保肝、抗氧化损伤、抗肿瘤、抗衰老等药理作用，一般认为该药理作用与其所含枸杞多糖、类胡萝卜素和黄酮等活性成分相关。

黄精性味甘甜，食用爽口，其肉质根状茎肥厚，含有大量淀粉、糖分、脂肪、蛋白质、胡萝卜素、维生素和多种其他营养成分，生食、炖服既能充饥，又有健身之用，可令人气力倍增、肌肉充盈、骨髓坚强，对身体十分有益。黄精还含黄精多糖A、B、C，具有抗病微生物、抗氧化、抗疲劳、延缓衰老、抑制血糖升高等保健功效。

中药黄芪中的主要活性成分是黄芪多糖，黄芪多糖具有多种生物活性，如促进生长、维持肠道微生态、改善抗氧化性以及抗衰老等生物学功能。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

1、本发明的鸡皮果复合酵素在制备过程中，鸡皮果经过添加酵母菌进行一次发酵，一次发酵产物再通过添加酵素粉进行二次发酵，可以消除鸡皮果果仁的苦涩味道，从而能充分利用鸡皮果全果，避免果仁的大量浪费，同时保留了抑菌及抗氧化的功能性成分，提高鸡皮果的应用价值和营养应用价值。同时，本发明的制作工艺简单，方法可行，投入低，生产效率高，很容易产业化，容易解决鸡皮果产量过剩的问题。

2、本发明采用鸡皮果与枸杞、灵芝粉、黄精粉、黄芪粉一起进行超声提取，可以获得多糖含量高达65.2％的多糖提取液，表明鸡皮果功能性酵素含有丰富的灵芝多糖、黄精多糖、黄芪多糖及枸杞多糖。灵芝多糖有广泛的药理活性，能提高机体免疫力，提高机体耐缺氧能力，消除自由基，抑制肿瘤、抗辐射，提高肝脏能力及延长寿命的功效；黄精多糖是黄精的主要功能成分，具有一定的抗氧化、免疫调节、抗病劳、抗病毒、调节血糖血脂、抑菌抗炎等活性；黄芪多糖对人体的免疫功能具有调节作用，同时具有抗病毒，抗肿瘤、抗衰老、抗辐射、抗应激及抗氧化等作用；枸杞多糖具有免疫调节、降血糖、降血脂、抗疲劳及延缓衰老的作用。因此，本发明的鸡皮果功能性复合酵素的功效是多方面的，对身体非常好。

3、本发明所获得的鸡皮果功能性复合酵素产品的SOD酶活力高达370.8U/ml。比QB/T5323-2018《植物酵素》中的“食用植物酵素”规定的15U/L高得多，且本发明的产品对羟自由基(·OH)的清除率为79.8％，因此，本发明的产品具有良好的抗衰老效果。本申请人经过试验发现单独的鸡皮果酵素产品，灵芝、黄精、黄芪及枸杞复合的发酵产品的SOD酶活力均低于200U/ml，自由基(·OH)的清除率也低于本发明，说明鸡皮果、灵芝、黄精、黄芪及枸杞的复配发生了协同增效作用，使得复合产品的SOD酶活力更强，清除羟基自由基的活性也更强。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明中的酵母菌和酵素粉购买自安琪酵母股份有限公司的葡萄酒果酒发酵专用酿酒酵母菌和果蔬酵素发酵剂。

实施例1

一种含鸡皮果的功能性复合酵素的制备方法，包括以下步骤：

(1)鸡皮果的选择与清洗：选八、九成熟、无病虫害、无霉烂的新鲜鸡皮果，清洗干净；

(2)辅料的处理：按重量份称取枸杞50份，灵芝粉20份、黄精粉10份、黄芪粉50份，水200份；将枸杞浸泡后与灵芝粉、黄精粉、黄芪粉混匀，加入剩余水，一起放入超声波提取器中，在功率为50W、温度为50～60℃的条件下进行提取，提取20min后过滤去渣，得多糖提取液；灵芝粉、黄精粉和黄芪粉是将干燥的灵芝、黄精和黄芪打粉，过100目筛得到；

(3)鸡皮果果汁的制备：按重量份取鸡皮果40份，多糖提取液300份，将鸡皮果和多糖提取液放入榨汁机中，榨成鸡皮果复合果汁待用；

(4)鸡皮果功能酵素一次发酵：将鸡皮果复合果汁放入发酵容器中，加入白糖，调节糖度为18°Brix，在温度为85～90℃的水浴中进行杀菌，杀菌时间为15min，杀菌后降温至35℃以下，加入酵母菌，酵母菌的加入量为调节糖度后的鸡皮果复合果汁重量的0.7％，在25～37℃的温度下发酵，发酵的时间为72h，发酵过程中间隔4h排一次气，得一次发酵产物；

(5)鸡皮果功能酵素二次发酵：向所得的一次发酵产物中加入白糖，调节糖度为18°Brix，在温度为85～90℃的水浴中进行杀菌，杀菌时间为15min，杀菌后降温至35℃以下，加入酵素粉，酵素粉的加入量为调节糖度后的一次发酵产物重量的0.8％，在32～37℃的温度下发酵，发酵的时间为54h，过滤，得含鸡皮果的功能性复合酵素。

实施例2

一种含鸡皮果的功能性复合酵素的制备方法，包括以下步骤：

(1)鸡皮果的选择与清洗：选八、九成熟、无病虫害、无霉烂的新鲜鸡皮果，清洗干净；

(2)辅料的处理：按重量份称取枸杞30份，灵芝粉40份、黄精粉30份、黄芪粉30份，水250份；将枸杞浸泡后与灵芝粉、黄精粉、黄芪粉混匀，加入剩余水，一起放入超声波提取器中，在功率为60W、温度为60℃的条件下进行提取，提取30min后过滤去渣，得多糖提取液；灵芝粉、黄精粉和黄芪粉是将干燥的灵芝、黄精和黄芪打粉，过100目筛得到；

(3)鸡皮果果汁的制备：按重量份取鸡皮果50份，多糖提取液320份，将鸡皮果和多糖提取液放入榨汁机中，榨成鸡皮果复合果汁待用；

(4)鸡皮果功能酵素一次发酵：将鸡皮果复合果汁放入发酵容器中，加入白糖，调节糖度为20°Brix，在温度为85～90℃的水浴中进行杀菌，杀菌时间为18min，杀菌后降温至35℃以下，加入酵母菌，酵母菌的加入量为调节糖度后的鸡皮果复合果汁重量的1.0％，在25～37℃的温度下发酵，发酵的时间为96h，发酵过程中间隔5h排一次气，得一次发酵产物；

(5)鸡皮果功能酵素二次发酵：向所得的一次发酵产物中加入白糖，调节糖度为20°Brix，在温度为85～90℃的水浴中进行杀菌，杀菌时间为18min，杀菌后降温至35℃以下，加入酵素粉，酵素粉的加入量为调节糖度后的一次发酵产物重量的1.2％，在32～37℃的温度下发酵，发酵的时间为72h，过滤，得含鸡皮果的功能性复合酵素。

实施例3

一种含鸡皮果的功能性复合酵素的制备方法，包括以下步骤：

(1)鸡皮果的选择与清洗：选八、九成熟、无病虫害、无霉烂的新鲜鸡皮果，清洗干净；

(2)辅料的处理：按重量份称取枸杞10份，灵芝粉70份、黄精粉50份、黄芪粉10份，水300份；将枸杞浸泡后与灵芝粉、黄精粉、黄芪粉混匀，加入剩余水，一起放入超声波提取器中，在功率为70W、温度为70℃的条件下进行提取，提取50min后过滤去渣，得多糖提取液；灵芝粉、黄精粉和黄芪粉是将干燥的灵芝、黄精和黄芪打粉，过100目筛得到；

(3)鸡皮果果汁的制备：按重量份取鸡皮果60份，多糖提取液400份，将鸡皮果和多糖提取液放入榨汁机中，榨成鸡皮果复合果汁待用；

(4)鸡皮果功能酵素一次发酵：将鸡皮果复合果汁放入发酵容器中，加入白糖，调节糖度为25°Brix，在温度为85～90℃的水浴中进行杀菌，杀菌时间为20min，杀菌后降温至35℃以下，加入酵母菌，酵母菌的加入量为调节糖度后的鸡皮果复合果汁重量的1.6％，在25～37℃的温度下发酵，发酵的时间为108h，发酵过程中间隔6h排一次气，得一次发酵产物；

(5)鸡皮果功能酵素二次发酵：向所得的一次发酵产物中加入白糖，调节糖度为23°Brix，在温度为85～90℃的水浴中进行杀菌，杀菌时间为20min，杀菌后降温至35℃以下，加入酵素粉，酵素粉的加入量为调节糖度后的一次发酵产物重量的2.0％，在32～37℃的温度下发酵，发酵的时间为108h，过滤，得含鸡皮果的功能性复合酵素。

对比例1

本对比例与实施例2的区别在于，没有步骤(2)，步骤(3)中鸡皮果汁的制备改为称取50份鸡皮果，放入榨汁机中，加入纯净水100份，榨成果汁待用，其他步骤与实施例2相同，制备得到纯鸡皮果酵素。

对比例2

本对比例与实施例2的区别在于，步骤(2)中辅料的处理为：按重量份称取灵芝粉70份、黄精粉60份，水250份；将灵芝粉、黄精粉混匀，加入剩余水，一起放入超声波提取器中，在功率为60W、温度为60℃的条件下进行提取，提取30min后过滤去渣，得多糖提取液；灵芝粉、黄精粉是将干燥的灵芝、黄精打粉，过100目筛得到；

其他步骤与实施例2相同，制备得到鸡皮果-灵芝-黄精酵素。

对比例3

本对比例与实施例2的区别在于，步骤(2)中辅料的处理为：按重量份称取灵芝粉70份、黄芪粉60份，水250份；将灵芝粉、黄芪粉混匀，加入剩余水，一起放入超声波提取器中，在功率为60W、温度为60℃的条件下进行提取，提取30min后过滤去渣，得多糖提取液；灵芝粉、黄精粉是将干燥的灵芝、黄芪打粉，过100目筛得到；

其他步骤与实施例2相同，制备得到鸡皮果-灵芝-黄芪酵素。

对比例4

本对比例与实施例2的区别在于，步骤(2)中辅料的处理为：按重量份称取枸杞50份、黄精粉50份、水250份；将枸杞浸泡后与黄精粉混匀，加入剩余水，一起放入超声波提取器中，在功率为60W、温度为60℃的条件下进行提取，提取30min后过滤去渣，得多糖提取液；灵芝粉、黄精粉是将干燥的灵芝、黄芪打粉，过100目筛得到；

其他步骤与实施例2相同，制备得到鸡皮果-枸杞-黄精酵素。

对比例5

本对比例与实施例2的区别在于，步骤(2)中辅料的处理为：按重量份称取枸杞50份，黄精粉40份、黄芪粉40份，水250份；将枸杞浸泡后与黄精粉、黄芪粉混匀，加入水，一起放入超声波提取器中，在功率为60W、温度为60℃的条件下进行提取，提取30min后过滤去渣，得多糖提取液；灵芝粉、黄精粉和黄芪粉是将干燥的灵芝、黄精和黄芪打粉，过100目筛得到。

其他步骤与实施例2相同，制备得到鸡皮果-枸杞-黄精-黄芪酵素。

对比例6

本对比例与实施例2的区别在于，步骤(2)中辅料的处理为：按重量份称取枸杞40份，灵芝粉50份、黄芪粉40份，水250份；将枸杞浸泡后与灵芝粉、黄精粉、黄芪粉混匀，加入水，一起放入超声波提取器中，在功率为60W、温度为60℃的条件下进行提取，提取30min后过滤去渣，得多糖提取液；灵芝粉、黄精粉和黄芪粉是将干燥的灵芝、黄精和黄芪打粉，过100目筛得到。

其他步骤与实施例2相同，制备得到鸡皮果-枸杞-灵芝-黄芪酵素。

对比例7

本对比例与实施例2的区别在于，步骤(2)中辅料的处理为：按重量份称取枸杞30份，灵芝粉40份、黄精粉30份、黄芪粉30份、水250份；将枸杞浸泡后与灵芝粉、黄精粉、黄芪粉混匀，加入水，一起放入超声波提取器中，在功率为60W、温度为60℃的条件下进行提取，提取30min后过滤去渣，得多糖提取液；灵芝粉、黄精粉和黄芪粉是将干燥的灵芝、黄精和黄芪打粉，过100目筛得到。

没有步骤(1)和(3)中使用鸡皮果的步骤，步骤(4)是用多糖提取液代替实施例2中的鸡皮果复合果汁，其他步骤均与实施例2相同，制备得到枸杞-灵芝-黄精-黄芪酵素。

产品品质测试

1、多糖提取液中多糖含量的测定

(1)葡萄糖标准曲线的绘制：

a配制5％苯酚溶液

称量苯酚药品100g，再称取0.1g铝片和0.05g碳酸氢钠一起放入圆底烧瓶中进行加热蒸馏，待温度到达182℃时收集此温度下的馏分。等到温度达到室温时准确称量重蒸苯酚的馏分12.5g，放入250mL的棕色容量瓶中，加入蒸馏水定容到刻度，摇匀，密封好放入冰箱，冷藏待用。

b绘制葡萄糖的标准曲线

取适量葡萄糖标准品放入远红外快速恒温干燥箱105℃烘干至恒重，称取标准品10.0mg，加少量蒸馏水进小烧杯中溶解，然后用玻璃棒进行引流转入100mL容量瓶，加蒸馏水清洗两三遍烧杯其液体转入容量瓶，最后加蒸馏水定容，摇匀，即葡萄糖标准溶液浓度为0.1mg/mL。移取标准溶液0.00mL，0.20mL，0.40mL，0.60mL，0.80mL，1.00mL放入10mL比色管中，分别各加入质量分数为5％的重蒸苯酚1mL及浓硫酸4mL，加蒸馏水定容到10mL，室温放置7到8min后摇匀，室温静置15min，再放进装有自来水的烧杯中放置15min。用试剂空白作为参比，于490nm处测得其吸光度。得到的5组吸光度值和葡萄糖浓度就构成了一个坐标图，得葡萄糖标准溶液线性方程y＝17.014x+0.0004，R

(2)测试方法和结果：

取实施例2中步骤(2)制备得到的多糖提取液样品Vml，转移到50mL容量瓶中，加蒸馏水稀释到刻度，摇匀。取0.50mL溶液放入25mL比色管中，加入苯酚和硫酸进行显色后，放入波长为490nm处测出吸光度，把测得的数值A代入线性回归方程求多糖的浓度，最后得出多糖质量浓度C。计算公式：

多糖得率＝(C×V)/m×100％

其中，C是指多糖提取液样品质量浓度mg/mL；V是指多糖提取液样品体积mL；m是指多糖提取液样品的干质量g。

按以上方法测定得到多糖提取液中多糖含量为65.2％，表明鸡皮果功能性酵素中含有丰富的灵芝多糖、黄精多糖、黄芪多糖及枸杞多糖。

2、酶活力和清除羟自由基(·OH)活性的测定

(1)酶活力的测试：采取GB/T 5009.171-2003《保健食品中超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定》中的方法，对实施例2及对比例1～6中制得的酵素中的SOD活性进行测定，其测定结果如表1。

(2)清除羟自由基(·OH)活性的测定

取25mL的比色管,先向比色管中加浓度为9.0mmol/L的水杨酸0.40mL，然后加入2.00mL的酵素，把配好9mmol/L的亚铁离子溶液移取0.40mL滴入，紧接加浓度为9mmol/L的过氧化氢溶液4.00mL，最后加蒸馏水，使其被稀释到25mL刻度，摇匀，静置几分钟。用蒸馏水做参比，最后把液体放入波长为510nm处测出吸光度A1，定为样品组。

将加入0.40mL亚铁离子溶液这一步换成用蒸馏水，剩余的步骤和样品组实验相同，测出其吸光度为A2，定为本底组。

同理，将加酵素这步变成加蒸馏水，其余步骤和样品组的实验相同，测出其吸光度为A3，定为空白组。

每组溶液分别测定3次，取测得这3次结果的平均值。按照以下的公式进行计算羟自由基(·OH)的清除率，用P表示。

P＝[1-(A

按上述方法测试实施例2及对比例1-7制备所得酵素的清除羟自由基(·OH)活性，其结果见表1。

表1测定结果表

由表1的测试结果可知，使用鸡皮果、灵芝、黄精、黄芪、枸杞复合制成的酵素中超氧化物歧化酶(SOD)的活性得到了显著的提高，远超于仅使用其中一种或多种原料制成的酵素中的超氧化物歧化酶(SOD)的活性。使用鸡皮果、灵芝、黄精、黄芪、枸杞复合制成的酵素的清除率(％)也远超于仅使用其中一种或多种原料制成的酵素中自由基清除率(％)。形成该效果原因可能是由于每种原料的成分都较为复杂，多种成分之间发生了协同作用，混合在一起进行发酵的过程中，使得原料中的SOD能更多溶出，或者获得了SOD酶活力更高和自由基清除能力更高的产物。

3、理化指标的测定结果

总酸含量的测定参考GB 12456-2021《食品中总酸的测定》进行测定，酸度用pH计进行测定；酒精度采用酒精计法测定；可溶性固形物采用手持折光仪进行测定，其测定结果如下表2。

表2理化指标结果表

由表2的数据可知，本发明的功能性复合酵素的上述指标符合QB/T 5323-2018《植物酵素》中对食用植物酵素的要求。

上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。