一种功能型仔猪诱食剂及其制备方法

技术领域

本申请涉及饲料领域，具体涉及一种功能型仔猪诱食剂及其制备方法。

背景技术

在保证畜禽健康生长的诸多因素中，采食量是非常重要的生产性能指标。在饲料营养和消化吸收水平相同的条件下采食量的高低决定了动物的生长和产出。因此，采食量水平的提高是动物营养调控的重要手段。在饲料中添加诱食剂是提高动物采食量有效的方法，目前猪饲料中使用的香精有芳香型、甜味型、鲜味型等，如柠檬醛、麦芽酚、香兰素、糖精、果糖、味精、富马酸等。以上诱食剂的添加会增加猪的采食量提高生产性能，但也存在一些共性问题：1、它们都为化学合成或提取，生产成本较高，如广泛使用的香兰素采用提取法需要天然植物香荚兰豆作为原料，采用合成法生产则需大量的石油化学品；2、无论哪种都存在工艺复杂设备多样的特点，且生产流程能耗高并有废气废水的产出；3、使用量不当时会造成猪肉生长迟缓，内脏器官肿大等问题；4、单一风味剂的诱食剂对储存条件较为严格，需严格的防潮密封且环境温度不能过高，否则风味物质容易挥发降低效果；5、有些诱食剂如味精的主要成分为谷氨酸钠，是不宜长期添加在饲料中。

目前复合型诱食剂产品多为使用化学类添加剂进行简单的复配，从功能上看，多数诱食剂的主要功能为改善饲料适口性从而单纯提高采食量，但在仔猪断奶产生应激的情况下，由于肠道形态及微生态发育还不健全，增加摄入的饲料需要消化率的提高才能更好消化及吸收，否则会加重应激程度造成腹泻或其他营养不良症状。由于普通的诱食剂功效多为单一提高采食量而并无肠道健康调控的功能，因此需要研发具有肠道健康调控防止腹泻的功能型诱食剂。

发明内容

本发明的目的是提供及一种功能型仔猪诱食剂。

本发明的另一目的是提供制备功能型仔猪诱食剂的方法。

根据本发明的营养型仔猪诱食剂，通过将原料在30℃发酵起始温度下发酵≧5d而获得，其中，所述原料包括玉米浆和麸皮物料固体，麸皮：玉米浆的质量配比为5:1；所述原料的含水量为45％；发酵接种菌株为CS2菌株，所述CS2菌株的保藏编号为CGMCC No.25179，菌株浓度为为1×10

根据本申请的营养型仔猪诱食剂，其中，所述原料包括0.5wt％糖蜜。

根据本申请的制备功能型仔猪诱食剂的方法，所述方法包括以下步骤：将原料在30℃发酵起始温度下发酵≧5d，其中，所述原料包括玉米浆和麸皮物料固体，麸皮：玉米浆的质量配比为5:1；所述原料的含水量为45％；发酵接种菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)CS2菌株，所述CS2菌株的保藏编号为CGMCC No.25179，所述CS2菌株的浓度为1×10

根据本申请的制备功能型仔猪诱食剂的方法，其中，所述原料包括0.5wt％糖蜜。

根据本申请的制备功能型仔猪诱食剂的方法，其中，50kg呼吸阀厌氧发酵袋发酵7d

根据本发明的营养型仔猪诱食剂，主要原料玉米浆具有丰富的营养物质，但同时存在酸度强、真菌毒素高等限制饲用化的特征。本申请发酵菌株是玉米浆来源的枯草芽孢杆菌，在酸性条件下具有良好的生长特性，同时具有丰富的转化酶系，可以将玉米浆中的多种醛醇类物质转化成酯类香型物质，对动物产生强烈的诱食效果。此外发酵菌株还具有突出的解毒作用，通过发酵可以显著降解物料中的玉米赤霉烯酮。本申请从发酵菌株配伍、接种量、主原料配比、含水量、pH值、外源碳氮辅料等参数进行调整，对发酵后物料的感官品质进行评分，从而获得最佳的实验室水平发酵工艺。

本申请的有益技术效果：

本申请的诱食剂制备方法所需的玉米浆、麸皮和糖蜜皆为常规的饲料原料，非常容易获取且成本相对低廉，因此产品原料具有较高的成本优势。

本申请的制备方法为微生物固体发酵生物转化法，相对于现有诱食剂生产技术，工艺及设备要求简单且无污染物产生，属于环境友好型的生产模式，因此制备方法具有操作简单可靠高效环保的特点。

本申请制备的诱食剂产品含有短链脂肪酸如乳酸和乙酸，因此其pH值能达到4.02，由此能够很好的保持本身品质防止杂菌污染。产品保存条件在常温即可，开袋使用后及时封袋也能能够保持品质稳定一年以上。相对于其他诱食剂开袋易挥发污染或是需低温保存的要求有很大的优势。

酯类是众多的产香物质中很特殊的一类，比如白酒的风味主要由各种特定的酯类物质形成，但由于单一的酯类制备成本高昂，在已有的猪诱食剂中很少使用。本申请制备的诱食剂中含有多种产香味酯类成分，具有特殊的酯类风味特征。目前市场上的猪诱食剂产品多为化工合成的单一香精类物质或混合甜鲜味物质，本方法制备的诱食剂具有显著的酯香型特征，与其他产品比较有明显差异，能对仔猪产生强烈的诱食作用。

本申请通过功能枯草芽孢杆菌菌株对主要原料玉米浆麸皮组合进行转化，枯草芽孢杆菌是目前饲料添加剂目录中明确允许使用的微生物添加剂类菌种之一。此菌株一方面能够将玉米浆中的多种醛醇类物质高效转化为酯类物质形成特殊香型特征，另一方面还能高效降解玉米浆中的霉菌毒素玉米赤霉烯酮，达到显著低于饲料最小限量的程度，从而使发酵后的物料饲用安全性显著提升。另外此菌株还有优良的抑制肠道有害菌能力，通过对物料固体发酵后其代谢产物对仔猪肠道健康具有明显的调控作用从极显著降低仔猪腹泻率，这与目前市场上大部分猪诱食剂单纯的提高采食量具有显著的区别。

本申请制备的诱食剂用于仔猪断奶后的0-28天进行添加饲喂，因此相应的对仔猪饲料中大原料进行替代，在替代添加量为1％和3％不同工艺发酵饲料时都有显著提高生产性能的效果，其中以3％本发明发酵饲料的替代添加效果更优。按目前市场饲料原料成本计，3％本发明发酵饲料的替代添加能够节省约100元/吨仔猪饲料成本。目前市场上的猪诱食剂使用都是在饲料中额外添加，按现在仔猪诱食剂市场价格每吨仔猪饲料增加的成本约在20-100元左右，而本方法制备的诱食剂在仔猪饲喂时是对其饲粮进行替代使用并无额外成本增加且能节约饲粮成本，因此具有巨大的成本优势。

附图说明

图1为不同规模发酵的饲料中挥发性有机物的GC-IMS谱图。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CS2于2022年6月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，保藏编号为CGMCC No.25179。

具体实施方式

实施例1

1.枯草芽孢杆菌CS2(CGMCC 25179)液体菌剂制备

由于玉米浆所具有的高酸度特性，在物料混合后不调整pH值直接添加菌剂即能高效发酵，一方面可以降低生产成本，一方面可以简化生产流程，才能成为实际生产中优化的工艺方案。菌株CS2(CGMCC No.25179)是针对本申请的技术方案所特异性筛选的菌株以玉米浆和麸皮主原料的微生物菌株，从玉米浆中经过分离、鉴定及测试评估筛选最终获得。

表1显示，CS2与其它含枯草芽孢杆菌的测试菌剂能够在富含玉米浆的液体测试培养基中有效生长，而测试菌剂由于培养基的低pH值都未能有效生长，这表明CS2具有针对以玉米浆为主料的饲料原料高效发酵转化的潜力。

表2显示，进一步的固体发酵测试表明相同的发酵条件下测试菌剂样品都未表现出优良的发酵感官品质，而加有CS2菌剂的物料则呈现显著的醇香风味以及良好的流动性，显示其在固态发酵中同样对玉米浆及麸皮具有高效转化能力。

表3表明，CS2与其他测试菌相比，在各自最适生长条件下CS2是唯一能够显著降解玉米浆中玉米赤霉烯酮含量约65％的菌株，而其他测试菌无一表现出降解毒素的功能。由于不同测试菌剂中包含枯草芽孢杆菌单菌或其他种属的饲用菌种菌株，综合液体发酵固体发酵的比较结果说明了CS2菌株在本方案应用中的独一性，因此CS2最终被确认为本方案中的核心微生物菌株材料。

表1菌株CS2与测试菌剂液体培养生物量比较

注：测试菌株1-10为含有枯草芽孢杆菌的单菌菌剂或复合菌剂，测试液体培养基成分：30％玉米浆+70％LB(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g)，自然pH值，培养条件：37℃，200rpm，12小时。

表2菌株CS2与测试菌剂固体发酵感官品质测试比较

注：测试菌株1-10为含有枯草芽孢杆菌的单菌菌剂或复合菌剂，固体发酵条件按表1发酵组合11的条件设置。

表3菌株CS2与测试菌剂液体培养赤霉烯酮降解效率评测

注：测试菌株1-10为含有枯草芽孢杆菌的单菌菌剂或复合菌剂，利用玉米浆和LB液体培养基按1:3比例配制测试培养基，玉米赤霉烯酮浓度调至约112μg/L；其中CS2液体培养基pH值调至4.5，其余测试菌株液体培养基pH值调至7以形成最适培养环境；接种后于30℃、200rpm培养12h进行胶体金试纸条法进行检测。

1.1CS2一级种子液培养

LB固体培养基配制：称取胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L NaCl 10g/L、琼脂粉15g/L用5mol/L NaOH调pH至7.0，用去离子水定容，在15psi高压下蒸汽灭菌21min备用。LB液体培养基配制：称取胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L NaCl10g/L用5mol/L NaOH调pH至7.0.用去离子水定容，在15psi高压下蒸汽灭菌21min备用。取低温冰箱中保藏的CS2菌株保藏管于LB固体培养基平板上划线，于培养箱中37℃培养12h至长出单菌落。用接种环挑取适量单菌落菌体接种于30ml液体LB培养基中，于恒温摇床中37℃、200rpm培养12h-15h至OD600吸光值为1。

1.2CS2二级种子液培养

按1％接种量将CS2一级种子液接种至200ml液体LB培养基中，设37℃、200rpm于恒温摇床中培养4h-5h至OD600吸光值为0.5。

1.3CS2高密度液体发酵种子液

使用10L液体发酵罐对CS二级种子液进行高密度发酵制备物料固体发酵用液体菌剂。按每份质量比玉米浆1％、玉米淀粉1％、尿素0.15％、硫酸铵0.15％、磷酸二氢钾0.3％、酵母粉0.01％、消泡剂(硅油)0.01％配制液体培养基7L，原料混合后调节pH＝6.0，121-123℃灭菌30min。接入200ml CS2二级种子液，按以下控制工艺进行液体发酵培养：温度37℃、pH低于5.5补氨控制至5.5、风量初始1m

2.物料固体发酵制备诱食剂

2.1诱食剂固体发酵小试及中试工艺

(1)实验室小试工艺：小麦麸皮6kg，玉米浆1.2kg，发酵菌株种子液接种量1％(按发酵液菌浓一百亿cfu/mL计)，糖蜜0.5％，含水量45％，温度30℃，10kg呼吸阀袋式厌氧发酵5d。

(2)放大中试工艺：小麦麸皮：2000kg，玉米浆：400kg，发酵菌株种子液：CS2发酵菌株种子液接种量1％(按发酵液菌浓一百亿cfu/mL计)，糖蜜：0.5％，含水量45％，起始温度25℃。50kg呼吸阀厌氧发酵7d。

2.2本发明制备的诱食剂小试及中试物料营养成分、霉菌毒素、风味物质检测结果2.2.1营养成分分析

表4中试物料营养成分检测结果

对小试及中试发酵物料的营养成分检测表明，在中试生产条件下与在实验室水平下获得的发酵物料总体结果相似，其中中试物料粗蛋白稍低于小试物料，而中试物料乳酸及乙酸含量稍高于小试物料，导致其pH值稍低于小试物料达到4.05。总体上看经小试发酵条件优化后的工艺放大到中试生产条件下所获得的发酵物料营养成分与小试物料相当，说明发酵体系放大后仍能获得预期效果。

2.2.2霉菌毒素玉米赤霉烯酮含量分析

表5.中试物料玉米赤霉烯酮检测结果

玉米浆作为发酵物料中的主要原料，由于其中所含的玉米赤霉烯酮(浓度：451.4±1.4μg/L)较高，如果在发酵后有效降解将在最终动物饲喂中成为重要的影响因素。发酵物料100g经同位素内标法检测结果表明，通过优化的发酵工艺CS2菌株能有效降解玉米浆中含有的玉米赤霉烯酮，使发酵物料中的玉米赤霉烯酮降到显著低于饲料卫生标准要求的最低限制，从而可以作为安全的诱食剂进行添加。

2.2.3风味物质成分分析

使用G.A.S.公司生产的

经过分析可得以下信息：

(1)物料样品发酵前的挥发性有机物主要包括醛类、烯醛类、醇类和酮类等；饲料发酵后的挥发性有机物主要包括酯类、酸类和酮类等。

(2)物料样品前后挥发性有机物发生了明显变化。

(3)部分物质在物料样品发酵后含量大幅下降，包括1-戊烯-3-醇、反-2-壬烯醛、反-2-庚烯醛、反-2-辛烯醛、异丁醇、1-戊醇、庚醛、3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、异丁醛、反-2-己烯醛、苯乙醛和己醛等，主要是醛类和烯醛类物。

(3)部分物质在物料样品发酵后含量显著增加，包括辛酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异戊酯、乙酸戊酯和乙酸己酯等，主要是酯类。

综上可知，通过优化的发酵工艺处理后，CS2菌通过发酵作用以玉米浆麸皮物料为底物转化合成了丰富的酯类物质，这些物质形成了物料特有的香型特征，是对动物进行诱食的主要因素。

实施例2

发酵工艺是本技术方案的核心，需要优化不同参数达到最优效果。从发酵菌株配伍、接种量、主原料配比、含水量、pH值、外源碳氮辅料等参数进行调整，对发酵后物料的感官品质进行评分，从而获得最佳的实验室水平发酵工艺。具体各参数设置及评分如下表：

本发明所获得的诱食剂是利用微生物发酵饲料原料获得，因此对本申请技术方案具有影响的因素有发酵菌株、不同原料的配比、含水量、发酵方式(有氧/厌氧)、发酵环境温度、发酵时长。

表6玉米浆麸皮诱食剂发酵参数优化策略及评分

(1)利用其他来源的饲用枯草芽孢杆菌作为对照测试菌在相同条件下与菌株CS2比较发酵效果，综合显示CS2对以玉米浆为主要原料的物料的发酵效率显著高于其他来源的对照测试菌株。

(2)设计发酵物料整体碳氮比为5:1～5:2，由此设定发酵原料中两种主料MF/CS配比为300g/60g、300g/90g、300g/120g三个水平。综合评分结果表明300g/120g与前两个水平差异较大，其中300g/60g最好，显示主料配比为5:1时总体碳氮比最适于CS2菌株发酵转化。

(3)设计含水量30％、40％和50％三个梯度。结果表明，30％含水量下发酵几乎不能启动，评分为所有组合中最低，而50％含水量下物料评分稍高于40％且达到最高分，显示45％及以上含水量能有效提高发酵品质。

(5)在菌浓为一百亿cfu/ml的条件下，结果显示接种量水平1％、3％显著高于0.33％，说明3株候选菌添加量需在物料中达到合适的菌浓(1*10

(6)物料混匀后未经调整的自然pH值为4左右，设计pH值5、6、7三水平测试最佳pH环境。结果表明，与其他组合的自然pH环境想比较，发酵品质在偏酸环境中较佳，在pH 5时评分稍好于pH 6，而pH值升至7时则显著下降，因此发酵条件无需调整自然pH值。

(7)糖蜜作为速效启动发酵的外源碳源需达到一定的添加量，不同比例的添加结果显示0.5％的添加量较1％及2％有较大差距，而1％和2％评分相同。外源尿素添加测试结果表明外源添加的尿素并未提高评分，以CS为主料的情况下可以不再添加外源氮素提高发酵品质，并且可以降低生产成本。

由于本申请的发酵产品为具诱食性的发酵饲料，因此在进行感观评价时气味的权重较大，相同评分下以气味分值为主要评判指标。确定针对玉米浆和麸皮物料固体发酵的各因素最佳条件如下：发酵用菌CS2菌株，麸皮玉米浆配比5:1，含水量45％，菌剂发酵液接种量1％，pH值自然，糖蜜添加量0.5％，发酵起始温度30℃，呼吸阀袋式厌氧发酵方式，发酵时长5d以上。

实施例3断奶仔猪动物养殖试验

饲粮中添加不同水平发酵饲料产品，评价其对断奶仔猪生长性能和腹泻率的影响，确定发酵饲料产品的最佳比例。

选用150头断奶仔猪(8公斤左右)按体重随机分配到5个处理，分别为对照组(常规饲料)、2个添加水平的发酵饲料处理组(1％和3％)、3％其它工艺(表6组合2)发酵饲料处理组、3％非发酵饲料处理组。每个处理6个重复，每个重复5头仔猪，试验期为28天。仔猪饲养于塑料漏缝地面栏内，各重复均匀分布于控制温度的室内。每栏的面积为2平方米，配有温控连接的风扇用于保持通风，舍内的温度保持在25-28℃。所有仔猪自由采食和饮水。3个处理的各重复随机区组均匀分布于控制温度的室内。

试验饲粮参照NRC(2012)的断奶仔猪营养水平，常规饲粮采用玉米豆粕型饲粮。饲粮组成及营养组成见表7，试验饲粮采用粉料形式饲喂。

表7保育猪试验饲粮配方组成(风干基础，g/kg)

每千克饲粮提供：VA 162,400IU，VD3124,00IU，VE 250mg，VK 12.5mg，烟酸500mg，泛酸250mg，叶酸7.5mg，生物素1.2mg，氯化胆碱5g，Fe 1000mg，Zn 700mg，Cu 125mg，Mn250mg，Se 3mg，I2.5 mg。

耗料量：记录每天每个重复的投料量，于试验第28天称重前对余料称重。计算方法：耗料量＝∑(投料量-余料量)。

平均日采食量(g/头/天)＝{【∑(投料量-余料量)】-∑(n*∑第i天平均采食量)}/(存活猪头数*饲养天数)。(注意：i代表试验进行的某一天；本公式中的n代表第i天死亡/淘汰猪只头数。)

平均日增重：于试验第28天清晨以重复为单位对猪只称重，计算平均日增重。计算方法：平均日增重(g/天)＝(末重-始重)/(饲养天数*猪头数)。(始重和末重均为当天清晨重量)。

重料比＝平均日增重/平均日采食量

腹泻率：试验第0-14天，使用4分法每天记录仔猪的腹泻情况。计算方法：腹泻率＝腹泻猪头次/(试验猪头数*总天数)。

试验数据将使用SAS 9.2的One-wayANOVA程序进行统计分析。每一栏将作为生长性能的统计单位。Tukey HSD检验用于组间的多重比较，P值小于或等于0.05代表组间差异显著。

结果表明不同添加水平和工艺发酵饲料产品对断奶仔猪生长性能和腹泻率的影响见表8。相比对照组，3％本发明发酵饲料具有显著的诱食效果(提高51.84％)，并提高末重(20.77％)和日增重(57.67％)(P<0.001)。在0-14天，所有发酵饲料处理组相比对照组均极显著降低了断奶仔猪的腹泻率(P<0.001)，其中3％本发明发酵饲料组的效果最佳。然而，饲粮中添加非发酵饲料与对照组在生长性能和腹泻率方面无显著性差异(P>0.05)，添加3％不同工艺发酵饲料相比添加3％本发明发酵饲料具有更低的生长性能和更高的腹泻率(P<0.05)。此外，在饲粮添加3％发酵饲料替代等量大原料，可节省约100元/吨的仔猪饲料成本。

表8本申请的发酵饲料对断奶仔猪生长性能和腹泻率的影响

注：FF1-1＝基础饲粮+1％发酵饲料；FF1-2＝基础饲粮+3％发酵饲料；FF2＝基础饲粮+3％不同工艺发酵饲料；NFF＝基础饲粮+3％非发酵饲料。

本发明通过改善饲料风味特性从而提高仔猪的生长性能，同时该诱食剂的添加还能显著降低仔猪腹泻率，节省饲料成本。