一种木立芦荟原生质体的提取工艺

技术领域

本发明属于芦荟提取技术领域，具体涉及一种木立芦荟原生质体的提取工艺。

背景技术

木立芦荟具有增加机体的免疫力、强化心脏功能、调节胰岛素分泌、增强胃肠消化功能、消炎镇痛、利尿解毒的功效，还具有使皮肤组织新生和康复的作用，广泛用于心脑血管疾病、胃肠疾病、内分泌疾病、过敏性皮肤病等的治疗，因此具有极高的应用开发价值。原生质体是其除去细胞壁的植物细胞和细菌细胞，仍有正常细胞的全部功能，芦荟原生质体的提取为芦荟进一步再生出植株奠定了基础，同时也为芦荟原生质体的融合及遗传性状的改良提供了条件。

目前，关于木立芦荟原生质体的提取手段主要是采用酶解的方法以芦 荟的叶片为材料进行原生质体分离。王红霞，范雪晖报道了一种芦荟原生质体的分离方法，首先是将芦荟叶片清洗，杀菌，然后切成薄片置于酶解液进行酶解，酶解完成后经过滤、离心和漂浮3种方法结合进一步纯化 ，得到了较为纯净的原生质体，其活力值达到90%；利用这种方法能够提取活力值比较高的原生质体，但是这种方法的弊端是酶不能重复利用，容易造成一定的浪费，其提取成本较高；并且游离的酶不易保存，容易失活；另一方面影响原生质体的纯化，会造成一部分原生质体的损失。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的是提供一种木立芦荟原生质体的提取工艺。本发明将纤维酶固定到网状高分子聚合物上，然后通过酶解、过滤、离心对木立芦荟原生质体进行提取，该方法可以提高固定化酶的活性，经固定化后的酶稳定性大为提高，后期原生质体易提纯，收率高；另外固定化酶经充分洗涤可以回收利用，降低了提取成本。

本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：

一种木立芦荟原生质体的提取工艺，包括以下步骤：

①将清洗、灭菌处理的木立芦荟叶片在无菌条件下切成厚度为0.3~0.8mm的长条，加入固定化纤维酶和CPW13培养液，再加入葡聚糖硫酸钾，用磷酸盐缓冲液调节溶液的pH至5~6，将溶液置于暗处，在25~30℃下酶解5~10h，得到原生质体混合液；

②用200~300目筛网过滤分离步骤①得到的原生质体混合液，得到滤饼和滤液，所得滤饼用pH为7的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液洗涤2~3次后沥干即可重复利用；

③将步骤②所得滤液经400~600r/min离心5~15min，弃去上清液，收集得到的原生质体沉淀，将得到的原生质体沉淀用CPW13培养液洗涤2~3次 ，每次用750r/min离心5min，得到木立芦荟原生质体。

步骤①中所述木立芦荟叶片、固定化纤维酶、CPW13培养液和葡聚糖硫酸钾的质量比为1：5~10：20~30：1~1.5。

所述的固定化纤维酶按照如下方法制备得到：

（1）以重量份计，将1.5~3.5份单体1、1份单体2和0.05~0.25份第 I 代Grubbs 催化剂加入10~15份有机溶剂中，搅拌溶解后，25~30℃下反应10~15h，反应完成后向反应液中加入活性炭，待反应液澄清后，过滤，所得滤液减压蒸馏去除有机溶剂，干燥，得到聚合物；

（2）将1份步骤（1）得到的聚合物和ZA3867纤维酶加入5~10份非质子极性溶剂中，搅拌溶解后加入0.2~0.5份偶氮二甲酸二乙酯和0.1~0.4份1-羟基苯并三唑，在25~40℃下反应3~10h，反应结束后向其中加入10~20份石油醚，待析出固体后，过滤，所得滤饼干燥，得到固定化纤维酶；

所述单体1的结构式为：

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所述单体2的结构式为：

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步骤（1）中所述有机溶剂为二氯甲烷、甲苯或苯。

步骤（2）中所述ZA3867纤维酶与聚合物的体积质量比为4~6ml：1g。

步骤（2）中所述非质子极性溶剂为二甲基亚砜或二甲基甲酰胺。

所述单体1按照如下方法制备得到：

1）以重量份计，将2~3份2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙醇、1份四乙二醇单对甲苯磺酸酯和0.4~0.6份碳酸钾加入5~10份乙腈中，搅拌溶解后，加热回流反应10~15h，反应结束后，过滤，所得滤液减压蒸馏去除乙腈，得到固体，将得到的固体加入5~10份二氯甲烷中，再加入0.6~1份二碳酸二叔丁酯，25~30℃下反应2~6h，反应结束后减压蒸馏去除二氯甲烷，得到胺基被保护的化合物；

2）将1份步骤1）制得的胺基被保护的化合物、0.55~0.8份溴丙烯和0.05~0.08份氢化钠加入5~10份四氢呋喃中，搅拌溶解后，加热至55~80℃反应3~8h，反应结束后，向反应液中加入2~3份水，淬灭反应，再加入5~10份二氯甲烷，静置分层，分出有机相，所得有机相减压蒸馏去除四氢呋喃，将得到的固体和0.2~0.3份三氟乙酸加入到5~10份二氯甲烷中，25~35℃下反应5~10h，反应结束后减压蒸馏去除二氯甲烷，干燥，得到单体1。

所述单体2按照如下方法制备得到：

以重量份计，将1份单体1和0.8~1份四乙二醇单对甲苯磺酸酯加入5~10份乙腈中，搅拌溶解后，加热回流反应10~15h，反应结束后，过滤，所得滤液减压蒸馏去除乙腈，得到固体，将得到的固体、0.2~0.4份溴丙烯和0.04~0.06份氢化钠加入5~10份四氢呋喃中，搅拌溶解后，加热至55~80℃反应3~8h，反应结束后，向反应液中加入2~3份水，淬灭反应，再加入5~10份二氯甲烷，静置分层，分出有机相，所得有机相减压蒸馏去除四氢呋喃，干燥，得到单体2。

本发明的固定化纤维酶的制备路线如下：

本发明相比现有技术具有以下优点：

1）本发明的木立芦荟原生质体的提取工艺，使用长柔性链单体1和单体2合成交联的网状高分子聚合物，使用合成的网状高分子聚合物作为载体，通过共价键与酶结合，得到固定化纤维酶，纤维酶与载体通过共价键结合比较牢固不易脱落，增大了酶的稳定性；

2）本发明使用长柔性链单体1和单体2合成的网状高分子聚合物，在没有缓冲液的情况下，酶被包裹在聚合物的网格内，进一步增加了酶的稳定性，可以较长期的储藏；当加入缓冲液后，聚合物会发生溶胀，使被包裹在网格内的酶得到伸展，从而接触芦荟叶片进行酶解；

3）本发明的木立芦荟原生质体的提取工艺，使用固定化纤维酶对芦荟叶片进行酶解，固定化纤维酶经过滤处理可以和原生质体自然分开，并经洗涤后能够反复使用，降低生产成本，后期原生质体容易提纯，收率高；

4）本发明酶固定化过程反应条件温和，酶的催化活性可以得到很好的保留，提取的原生质体具有较高的活力。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的固定化纤维酶重复使用后酶活力检测结果图。

图2为本发明实施例2制备的固定化纤维酶和游离酶放置30天的酶活力检测图。

具体实施方式

为了更好的理解本发明的技术方案，以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

以下实施例中单体1的结构式均为：

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单体2的结构式均为：

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实施例1 单体1的制备：

1）将25g 2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙醇、10g四乙二醇单对甲苯磺酸酯和5g碳酸钾加入60g乙腈中，搅拌溶解后，加热回流反应12h，反应结束后，过滤，所得滤液减压蒸馏去除乙腈，得到固体，将得到的固体加入70g二氯甲烷中，再加入8g二碳酸二叔丁酯，28℃下反应4h，反应结束后减压蒸馏去除二氯甲烷，得到胺基被保护的化合物；

2）将10g步骤1）制得的胺基被保护的化合物、6.5g溴丙烯和0.65g氢化钠加入75g四氢呋喃中，搅拌溶解后，加热至65℃反应6h，反应结束后，向反应液中加入30g水，淬灭反应，再加入60g二氯甲烷，静置分层，分出有机相，所得有机相减压蒸馏去除四氢呋喃，将得到的固体和2.5g三氟乙酸加入到55g二氯甲烷中，25℃下反应7h，反应结束后减压蒸馏去除二氯甲烷，干燥，得到单体1。

单体2的制备：

将10g单体1和9g四乙二醇单对甲苯磺酸酯加入70g乙腈中，搅拌溶解后，加热回流反应12h，反应结束后，过滤，所得滤液减压蒸馏去除乙腈，得到固体，将得到的固体、3g溴丙烯和0.5g氢化钠加入75g四氢呋喃中，搅拌溶解后，加热至65℃反应6h，反应结束后，向反应液中加入25g水，淬灭反应，再加入70g二氯甲烷，静置分层，分出有机相，所得有机相减压蒸馏去除四氢呋喃，干燥，得到单体2。

木立芦荟原生质体的提取:

①固定化纤维酶的制备：将30g单体1、10g单体2和1.5g第 I 代Grubbs 催化剂加入120g二氯甲烷中，搅拌溶解后，25℃下反应12h，反应完成后向反应液中加入活性炭，待反应液澄清后，过滤，所得滤液减压蒸馏去除有机溶剂，干燥得到聚合物；将10g聚合物和50mlZA3867纤维酶加入60g二甲基亚砜中，搅拌溶解后加入3.5g偶氮二甲酸二乙酯和2.5g 1-羟基苯并三唑，在30℃下反应6h，反应结束后向反应液中加入150g石油醚，待析出固体后，过滤，所得滤饼干燥，得到固定化纤维酶；

②将清洗、灭菌处理的木立芦荟叶片0.5g在无菌条件下切成厚度为0.5mm的长条，加入固定化纤维酶3.5g和12.5g CPW13培养液，再加入0.6g葡聚糖硫酸钾，用磷酸盐缓冲液调节溶液的pH至5.8，置于暗处，在25℃下酶解7h，得到原生质体混合液；

③用200目筛网过滤分离步骤②得到的原生质体混合液，得到滤饼和滤液，所得滤饼用pH为7的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液洗涤2次后沥干即可重复利用；

④将步骤③所得滤液经500r/min离心10min，弃去上清液，收集得到的原生质体沉淀，将得到的原生质体沉淀用CPW13培养液洗涤2次 ，每次用750r/min离心5min，得到木立芦荟原生质体。

实施例2 单体1的制备：

1）将23g 2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙醇、10g四乙二醇单对甲苯磺酸酯和4.5g碳酸钾加入70g乙腈中，搅拌溶解后，加热回流反应12h，反应结束后，过滤，所得滤液减压蒸馏去除乙腈，得到固体，将得到的固体加入70g二氯甲烷中，再加入7g二碳酸二叔丁酯，26℃下反应3h，反应结束后减压蒸馏去除二氯甲烷，得到胺基被保护的化合物；

2）将10g步骤1）制得的胺基被保护的化合物、6g溴丙烯和0.6g氢化钠加入65g四氢呋喃中，搅拌溶解后，加热至60℃反应5h，反应结束后，向反应液中加入25g水，淬灭反应，再加入70g二氯甲烷，静置分层，分出有机相，所得有机相减压蒸馏去除四氢呋喃，将得到的固体和2.3g三氟乙酸加入到60g二氯甲烷中，28℃下反应6h，反应结束后减压蒸馏去除二氯甲烷，干燥，得到单体1。

单体2的制备：

将10g单体1和8.5g四乙二醇单对甲苯磺酸酯加入65g乙腈中，搅拌溶解后，加热回流反应11h，反应结束后，过滤，所得滤液减压蒸馏去除乙腈，得到固体，将得到的固体、2.5g溴丙烯和0.45g氢化钠加入80g四氢呋喃中，搅拌溶解后，加热至60℃反应6h，反应结束后，向反应液中加入25g水，淬灭反应，再加入65g二氯甲烷，静置分层，分出有机相，所得有机相减压蒸馏去除四氢呋喃，干燥，得到单体2。

木立芦荟原生质体的提取:

①固定化纤维酶的制备：将20g单体1、10g单体2和1.0 g第 I 代Grubbs 催化剂加入110g二氯甲烷中，搅拌溶解后，27℃下反应11h，反应完成后向反应液中加入活性炭，待反应液澄清后，过滤，所得滤液减压蒸馏去除有机溶剂，干燥得到聚合物；将10g聚合物和45mlZA3867纤维酶加入60g二甲基亚砜中，搅拌溶解后加入3g偶氮二甲酸二乙酯和1.5g 1-羟基苯并三唑，在30℃下反应6h，反应结束后向反应液中加入130g石油醚，待析出固体后，过滤，所得滤饼干燥，得到固定化纤维酶；

②将清洗、灭菌处理的木立芦荟叶片0.5g在无菌条件下切成厚度为0.4mm的长条，加入3g固定化纤维酶和11g CPW13培养液，再加入0.55g葡聚糖硫酸钾，用磷酸盐缓冲液调节溶液的pH至5.6，置于暗处，在28℃下酶解6.5h，得到原生质体混合液；

③用200目筛网过滤分离步骤②得到的原生质体混合液，得到滤饼和滤液，所得滤饼用pH为7的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液洗涤2次后沥干即可重复利用；

④将步骤③所得滤液经500r/min离心12min，弃去上清液，收集得到的原生质体沉淀，将得到的原生质体沉淀用CPW13培养液洗涤3次 ，每次用750r/min离心5min，得到木立芦荟原生质体。

实施例3 单体1的制备：

1）将24g 2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙醇、10g四乙二醇单对甲苯磺酸酯和5g碳酸钾加入80g乙腈中，搅拌溶解后，加热回流反应13h，反应结束后，过滤，所得滤液减压蒸馏去除乙腈，得到固体，将得到的固体加入70g二氯甲烷中，再加入7.5g二碳酸二叔丁酯，28℃下反应4h，反应结束后减压蒸馏去除二氯甲烷，得到胺基被保护的化合物；

2）将10g步骤1）制得的胺基被保护的化合物、6.5g溴丙烯和0.65g氢化钠加入85g四氢呋喃中，搅拌溶解后，加热至65℃反应6h，反应结束后，向反应液中加入25g水，淬灭反应，再加入55g二氯甲烷，静置分层，分出有机相，所得有机相减压蒸馏去除四氢呋喃，将得到的固体和2.4g三氟乙酸加入到75g二氯甲烷中，30℃下反应8h，反应结束后减压蒸馏去除二氯甲烷，干燥，得到单体1。

单体2的制备：

将10g单体1和9.5g四乙二醇单对甲苯磺酸酯加入85g乙腈中，搅拌溶解后，加热回流反应13h，反应结束后，过滤，所得滤液减压蒸馏去除乙腈，得到固体，将得到的固体、3g溴丙烯和0.5g氢化钠加入85g四氢呋喃中，搅拌溶解后，加热至70℃反应7h，反应结束后，向反应液中加入25g水，淬灭反应，再加入75g二氯甲烷，静置分层，分出有机相，所得有机相减压蒸馏去除四氢呋喃，干燥，得到单体2。

木立芦荟原生质体的提取:

①固定化纤维酶的制备：将25g单体1、10g单体2和1.5 g第 I 代Grubbs 催化剂加入130g二氯甲烷中，搅拌溶解后，28℃下反应13h，反应完成后向反应液中加入活性炭，待反应液澄清后，过滤，所得滤液减压蒸馏去除有机溶剂，干燥得到聚合物；将10g聚合物和48mlZA3867纤维酶加入65g二甲基甲酰胺中，搅拌溶解后加入3.8g偶氮二甲酸二乙酯和2.5g 1-羟基苯并三唑，在35℃下反应8h，反应结束后向反应液中加入140g石油醚，待析出固体后，过滤，所得滤饼干燥，得到固定化纤维酶；

②将清洗、灭菌处理的木立芦荟叶片0.5g在无菌条件下切成厚度为0.6mm的长条，加入4g固定化纤维酶和13.5g CPW13培养液，再加入0.65g葡聚糖硫酸钾，用磷酸盐缓冲液调节溶液的pH至5.5，置于暗处，在29℃下酶解7.5h，得到原生质体混合液；

③用300目筛网过滤分离步骤②得到的原生质体混合液，得到滤饼和滤液，所得滤饼用pH为7的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液洗涤3次后沥干即可重复利用；

④将步骤③所得滤液经500r/min离心9min，弃去上清液，收集得到的原生质体沉淀，将得到的原生质体沉淀用CPW13培养液洗涤3次 ，每次用750r/min离心5min，得到木立芦荟原生质体。

实施例4 单体1的制备：

1）将29g 2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙醇、10g四乙二醇单对甲苯磺酸酯和5.5g碳酸钾加入90g乙腈中，搅拌溶解后，加热回流反应14h，反应结束后，过滤，所得滤液减压蒸馏去除乙腈，得到固体，将得到的固体加入90g二氯甲烷中，再加入9g二碳酸二叔丁酯，29℃下反应5.5h，反应结束后减压蒸馏去除二氯甲烷，得到胺基被保护的化合物；

2）将10g步骤1）制得的胺基被保护的化合物、7.5g溴丙烯和0.75g氢化钠加入90g四氢呋喃中，搅拌溶解后，加热至80℃反应7h，反应结束后，向反应液中加入28g水，淬灭反应，再加入80g二氯甲烷，静置分层，分出有机相，所得有机相减压蒸馏去除四氢呋喃，将得到的固体和2.9g三氟乙酸加入到90g二氯甲烷中，33℃下反应9h，反应结束后减压蒸馏去除二氯甲烷，干燥，得到单体1。

单体2的制备：

将10g单体1和9.5g四乙二醇单对甲苯磺酸酯加入95g乙腈中，搅拌溶解后，加热回流反应14h，反应结束后，过滤，所得滤液减压蒸馏去除乙腈，得到固体，将得到的固体、3.8g溴丙烯和0.55g氢化钠加入80g四氢呋喃中，搅拌溶解后，加热至80℃反应7h，反应结束后，向反应液中加入28g水，淬灭反应，再加入80g二氯甲烷，静置分层，分出有机相，所得有机相减压蒸馏去除四氢呋喃，干燥，得到单体2。

木立芦荟原生质体的提取:

①固定化纤维酶的制备：将30g单体1、10g单体2和2.0g第 I 代Grubbs 催化剂加入140g甲苯中，搅拌溶解后，29℃下反应12h，反应完成后向反应液中加入活性炭，待反应液澄清后，过滤，所得滤液减压蒸馏去除有机溶剂，干燥得到聚合物；将10g聚合物和40mlZA3867纤维酶加入80g二甲基亚砜中，搅拌溶解后加入4.5g偶氮二甲酸二乙酯和2.5g 1-羟基苯并三唑，在40℃下反应9h，反应结束后向反应液中加入180g石油醚，待析出固体后，过滤，所得滤饼干燥，得到固定化纤维酶；

②将清洗、灭菌处理的木立芦荟叶片0.5g在无菌条件下切成厚度为0.7mm的长条，加入3g固定化纤维酶和11.5g CPW13培养液，再加入0.56g葡聚糖硫酸钾，用磷酸盐缓冲液调节溶液的pH至5.2，置于暗处，在26℃下酶解9h，得到原生质体混合液；

③用200目筛网过滤分离步骤②得到的原生质体混合液，得到滤饼和滤液，所得滤饼用pH为7的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液洗涤3次后沥干即可重复利用；

④将步骤③所得滤液经500r/min离心7min，弃去上清液，收集得到的原生质体沉淀，将得到的原生质体沉淀用CPW13培养液洗涤3次 ，每次用750r/min离心5min，得到木立芦荟原生质体。

实施例5 单体1的制备：

1）将30g 2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙醇、10g四乙二醇单对甲苯磺酸酯和6g碳酸钾加入100g乙腈中，搅拌溶解后，加热回流反应15h，反应结束后，过滤，所得滤液减压蒸馏去除乙腈，得到固体，将得到的固体加入100g二氯甲烷中，再加入10g二碳酸二叔丁酯，30℃下反应6h，反应结束后减压蒸馏去除二氯甲烷，得到胺基被保护的化合物；

2）将10g步骤1）制得的胺基被保护的化合物、8g溴丙烯和0.8g氢化钠加入100g四氢呋喃中，搅拌溶解后，加热至80℃反应8h，反应结束后，向反应液中加入30g水，淬灭反应，再加入100g二氯甲烷，静置分层，分出有机相，所得有机相减压蒸馏去除四氢呋喃，将得到的固体和3g三氟乙酸加入到100g二氯甲烷中，35℃下反应10h，反应结束后减压蒸馏去除二氯甲烷，干燥，得到单体1。

单体2的制备：

将10g单体1和10g四乙二醇单对甲苯磺酸酯加入100g乙腈中，搅拌溶解后，加热回流反应15h，反应结束后，过滤，所得滤液减压蒸馏去除乙腈，得到固体，将得到的固体、4g溴丙烯和0.6g氢化钠加入100g四氢呋喃中，搅拌溶解后，加热至80℃反应8h，反应结束后，向反应液中加入30g水，淬灭反应，再加入100g二氯甲烷，静置分层，分出有机相，所得有机相减压蒸馏去除四氢呋喃，干燥，得到单体2。

木立芦荟原生质体的提取:

①固定化纤维酶的制备：将15g单体1、10g单体2和0.5g第 I 代Grubbs 催化剂加入100g苯中，搅拌溶解后，30℃下反应10h，反应完成后向反应液中加入活性炭，待反应液澄清后，过滤，所得滤液减压蒸馏去除有机溶剂，干燥得到聚合物；将10g聚合物和40mlZA3867纤维酶加入50g二甲基亚砜中，搅拌溶解后加入2g偶氮二甲酸二乙酯和1g 1-羟基苯并三唑，在25℃下反应3h，反应结束后向反应液中加入200g石油醚，待析出固体后，过滤，所得滤饼干燥，得到固定化纤维酶；

②将清洗、灭菌处理的木立芦荟叶片0.5g在无菌条件下切成厚度为0.8mm的长条，加入2.5g固定化纤维酶和10g CPW13培养液，再加入0.5g葡聚糖硫酸钾，用磷酸盐缓冲液调节溶液的pH至5，置于暗处，在25℃下酶解10h，得到原生质体混合液；

③用200目筛网过滤分离步骤②得到的原生质体混合液，得到滤饼和滤液，所得滤饼用pH为7的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液洗涤3次后沥干即可重复利用；

④将步骤③所得滤液经500r/min离心5min，弃去上清液，收集得到的原生质体沉淀，将得到的原生质体沉淀用CPW13培养液洗涤3次 ，每次用750r/min离心5min，得到木立芦荟原生质体。

实施例6 单体1的制备：

1）将20g 2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙醇、10g四乙二醇单对甲苯磺酸酯和4g碳酸钾加入50g乙腈中，搅拌溶解后，加热回流反应10h，反应结束后，过滤，所得滤液减压蒸馏去除乙腈，得到固体，将得到的固体加入50g二氯甲烷中，再加入6g二碳酸二叔丁酯，25℃下反应2h，反应结束后减压蒸馏去除二氯甲烷，得到胺基被保护的化合物；

2）将10g步骤1）制得的胺基被保护的化合物、5.5g溴丙烯和0.5g氢化钠加入50g四氢呋喃中，搅拌溶解后，加热至55℃反应3h，反应结束后，向反应液中加入250g水，淬灭反应，再加入50g二氯甲烷，静置分层，分出有机相，所得有机相减压蒸馏去除四氢呋喃，将得到的固体和2g三氟乙酸加入到50g二氯甲烷中，25℃下反应5h，反应结束后减压蒸馏去除二氯甲烷，干燥，得到单体1。

单体2的制备：

将10g单体1和8g四乙二醇单对甲苯磺酸酯加入50g乙腈中，搅拌溶解后，加热回流反应10h，反应结束后，过滤，所得滤液减压蒸馏去除乙腈，得到固体，将得到的固体、2g溴丙烯和0.4g氢化钠加入50g四氢呋喃中，搅拌溶解后，加热至55℃反应3h，反应结束后，向反应液中加入20g水，淬灭反应，再加入50g二氯甲烷，静置分层，分出有机相，所得有机相减压蒸馏去除四氢呋喃，干燥，得到单体2。

木立芦荟原生质体的提取:

①固定化纤维酶的制备：将35g单体1、10g单体2和2.5 g第 I 代Grubbs 催化剂加入150g甲苯中，搅拌溶解后，25℃下反应15h，反应完成后向反应液中加入活性炭，待反应液澄清后，过滤，所得滤液减压蒸馏去除有机溶剂，干燥得到聚合物；将10g聚合物和60mlZA3867纤维酶加入100g二甲基亚砜中，搅拌溶解后加入5g偶氮二甲酸二乙酯和4g 1-羟基苯并三唑，在40℃下反应10h，反应结束后向反应液中加入100g石油醚，待析出固体后，过滤，所得滤饼干燥，得到固定化纤维酶；

②将清洗、灭菌处理的木立芦荟叶片0.5g在无菌条件下切成厚度为0.3mm的长条，加入5g固定化纤维酶和15g CPW13培养液，再加入0.75g葡聚糖硫酸钾，用磷酸盐缓冲液调节溶液的pH至6，置于暗处，在30℃下酶解5h，得到原生质体混合液；

③用300目筛网过滤分离步骤②得到的原生质体混合液，得到滤饼和滤液，所得滤饼用pH为7的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液洗涤2次后沥干即可重复利用；

④将步骤③所得滤液经500r/min离心15min，弃去上清液，收集得到的原生质体沉淀，将得到的原生质体沉淀用CPW13培养液洗涤2次 ，每次用750r/min离心5min，得到木立芦荟原生质体。

分别将实施例1~6制备的化合物进行核磁检测，单体1核磁检测结果为：

性能评价 分别取实施例1~6制备的固定化纤维酶50 mg，加入3.0mL 含 1％羧甲基纤维素钠溶液的醋酸钠-醋酸缓冲液，40°C水浴保温 20 min，过滤，吸取反应液 1.2 mL加入 2 mol/L的NaOH溶液0.4mI，加入 1 mL3,5-二硝基水杨酸显色剂，定容至5.6 mL；沸水浴10 min后，流水冷却，在500 nm下测吸光度．酶活可定义为：1g固定化酶1min产生1 umol葡萄糖所需的酶量为一个单位（u）。其检测结果如表1所示。从表1可以看出本发明制备的固定化纤维酶活力值较高。

表1 实施例1~6制备的固定化纤维酶活力值

将实施例1制备的固定化纤维酶50mg置于锥形瓶中，加入3.0mL含 1％羧甲基纤维素钠溶液的醋酸钠-醋酸缓冲液在40°C下反应，测定其在20 min内500nm处的吸光度变化，底物被完全反应后分离固定化酶，用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液(pH=7.0)洗涤三次，测定酶活力值，然后重新装入新鲜底物溶液，重复上述操作，循环以上操作7次，固定化纤维酶活力检测结果如图1所示，结果表明固定化纤维酶在经过7次循环以后，酶活力值保持在85%以上，说明固定化纤维酶操作稳定性好，经充分洗涤后可以重复利用。

分别将实施例2制备的固定化纤维酶和游离酶放置在4℃下保存30天，分别在0天、7天、15天、24天和30天检测其酶活力值，其对比结果如图2所示，结果表明固定化纤维酶在保存1个月后，其酶活力值保持在85%以上，说明固定化纤维酶稳定性较好，能够长期储藏。

分别取实施例1~6制备的原生质体悬浮液0.5ml，置于试管中，加入FDA溶液使其最终浓度为0.01%，混匀置于室温条件下5min后，用荧光显微镜观察，发黄绿色荧光的原生质体为有活力的，发红色荧光的为无活力的，并计算原生质体的活力，原生质体的活力=活的原生质体/总原生质体 *100％。检测结果如表2所示，说明本发明的木立芦荟原生质的提取工艺提取的原生质体活力较高。

表2 实施例1~6提取的原生质体活力表

上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。