一种阿霉素-土荆皮乙酸复合肿瘤靶向胶束及其制备方法

技术领域

本发明属于药物制造领域，具体涉及一种阿霉素-土荆皮乙酸复合肿瘤靶向胶束及其制备方法。

背景技术

阿霉素(DOX)属于蒽环类抗肿瘤抗生素，为增加水溶性，临床常用盐酸盐，其抗肿瘤谱广，在临床上常用于治疗乳腺癌、肺癌、卵巢癌等。但其组织选择性较差，毒副作用较大，限制了临床的使用。目前主要是通过载药传递系统来改变阿霉素的生物分布，从而减少阿霉素的毒副作用。其中，聚合物胶束在癌症治疗和药物传输方面具有广阔的应用前景。

肿瘤新生血管的形成是肿瘤生长和转移的基础，它主要为肿瘤的生长提供营养和氧气，并为其异处的转移提供路径。抑制肿瘤血管新生，阻断营养物质和氧气供应，是对肿瘤治疗的重要有效的方案之一。土荆皮乙酸(Pseudolaric acid B，PAB)是从土荆皮根皮中分离出的二萜酸，传统中医中用于治疗皮肤真菌感染。研究报道PAB具有较好的抗真菌、抗病毒、抗血管生成和抗生育活性。此外，PAB对多种肿瘤细胞具有抗癌活性，如胃肠癌细胞、呼吸道肿瘤细胞和妇科肿瘤细胞。值得一提的是研究发现PAB具有显著抑制血管生成的作用，并可以抑制癌细胞转移和逆转癌细胞的多药耐药性。

聚乙二醇维生素E琥珀酸酯(D-alpha-Tocopheryl polyethylene glycolsuccinate，TPGS)是由维生素E琥珀酸酯(vitamin E succinate，VES)与聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)酯化而成，它是一种新型的非离子表面活性剂，在水介质中能形成稳定的胶束。同时，它作为P-gp抑制剂，能有效克服肿瘤细胞的多药耐药性，提高抗癌药物的口服生物利用度。TPGS已被FDA批准为安全的药物辅料，并广泛应用于药物递送系统中。

目前，研究者发现了一类肿瘤归巢肽，它能与肿瘤细胞上的受体结合，从而能够增加载药系统从血管中将药物释放以及加强穿透实体瘤的能力。tLyP-1是其中一种肿瘤归巢肽，其氨基酸序列为CGNKRTR，能与乳腺癌、胶质瘤等肿瘤细胞上高表达的神经纤维蛋白-1(neuroplin-1,NRP-1)受体结合，从而进入实体肿瘤中并穿透肿瘤血管。

阿霉素制剂作为临床常用的抗肿瘤药，其较大的毒副作用以及多药耐药性问题亟待解决。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术问题的不足，提供一种阿霉素-土荆皮乙酸复合肿瘤靶向胶束及其制备方法，有效提高阿霉素的抗肿瘤作用，并降低耐药性及毒副作用。本发明合成了tLyp-1-TPGS，联合TPGS制备聚合物胶束，负载DOX和新生血管抑制剂PAB，用于癌症的靶向治疗。通过DOX和PAB联合用药、tLyp-1对肿瘤细胞的主动识别能力，并利用TPGS抗多药耐药，起到三位一体增强阿霉素的疗效、减低毒副作用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种阿霉素-土荆皮乙酸复合肿瘤靶向胶束，所述胶束是由阿霉素DOX和土荆皮乙酸PAB联用、以及载体自组装形成，所述载体包括有多肽修饰的双亲性聚合物，以及一种或多种双亲性材料。胶束形成示意图见图1。

优选的，所述多肽为tLyp-1，所述多肽修饰的双亲性聚合物为tLyp-1修饰的维生素E聚乙二醇琥珀酸酯TPGS(tLyp-1-TPGS)；更优选的，所述多肽修饰的双亲性聚合物为tLyp-1修饰的TPGS2000或TPGS1000。

优选的，所述双亲性材料为维生素E聚乙二醇琥珀酸酯TPGS及磷脂类化合物；更优选的，所述双亲性材料为TPGS2000或TPGS1000和卵磷脂(PC)的混合。

本发明还提供了一种前述任意一种DOX-PAB复合肿瘤靶向胶束的制备方法，所述方法包括如下步骤：

将一定量的DOX和PAB分别溶于有机溶剂中，将两种溶液混合均匀，再向混合溶液中加入一定量的载体，除去溶剂得到干燥的含药薄膜，最后加入与水化温度一致的纯化水适量，置于水化温度下搅拌一定时间进行水化，得到的胶束溶液离心后取其上清液过膜，即得所述阿霉素-土荆皮乙酸复合肿瘤靶向胶束(tLyp-1-DP-M)。

优选的，所述有机溶剂为甲醇，甲醇用量为将药物溶解即可。

优选的，所述DOX和PAB的重量比为1:0.8。

优选的，所述胶束中，各组分的投料量比例以重量份记为DOX 1份和PAB 0.8份、tLyp-1-TPGS 3份、TPGS 7～9份和磷脂类化合物1～3份。

优选的，所述的纯化水的用量以TPGS、磷脂类化合物的的重量之和计为每10mg加(8～12)mL水，水化温度为40～50℃，水化时间为1～2h；更优选的，所述的纯化水的用量以TPGS、磷脂类化合物的的重量之和计为每10mg加10mL水，水化温度为40℃，水化时间为2h。

优选的，所述离心速率为10000r/min，离心时间为15min。

优选的，所述过膜为过0.22μm微孔滤膜。

优选的，所述上清液过膜后经冷冻干燥，得到tLyp-1-DP-M冻干粉。

优选的，所述冷冻干燥方法为将制备好的胶束放入-80℃低温冰箱中预冻12h后将样品取出，置于冷冻干燥器内干燥24h。

本发明与现有技术相比，其有益效果主要体现在：

本发明提供了一种阿霉素-土荆皮乙酸复合肿瘤靶向胶束及其制备方法，所述靶向胶束同时负载两种药物，充分发挥了化疗药物与抑制血管新生药物的协同抗癌作用；tLyp-1对聚合物胶束表面靶向修饰，同时载体材料TPGS能抗多药耐药性，进一步提高了治疗效果。

附图说明

图1为阿霉素-土荆皮乙酸复合肿瘤靶向胶束形成示意图；

图2为DP-M及tLyp-1-DP-M在PBS稀释下平均粒径及PDI的变化图(n＝3)；

图3为流式细胞仪检测各组在MCF-7细胞的摄取情况图；

图4为各组荷瘤鼠肿瘤体积在给药期间的变化图(n＝5)；

图5为各组荷瘤鼠肿瘤解剖图和瘤重图(n＝5)；

图6为各组荷瘤鼠肿瘤病理学切片图；

图7为给药期间各组荷瘤鼠的相对体重变化图(n＝6)；

图8为各组荷瘤鼠心、肝、脾、肺、肾病理学切片图；

图9为各组荷瘤鼠肿瘤的CD31的表达图(SP，×400)；

图10为各组荷瘤鼠肿瘤的MVD统计图(SP，×400)。

具体实施方式

下面通过具体实施例，并结合附图对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

实施例1阿霉素-土荆皮乙酸复合肿瘤靶向胶束的制备

(2)将盐酸阿霉素用三乙醇胺脱盐，配制成含阿霉素1mg、PAB0.8mg的甲醇溶液，再向所述混合甲醇溶液中加入含8mg TPGS1000、2mg PC、3mg tLyp-1-TPGS2000的甲醇溶液。随后于25℃水浴下旋转蒸发除去溶剂，得到干燥的含药薄膜。最后加入10mL 40℃的纯化水，于40℃下磁力搅拌水化2h，得到的胶束溶液以10000r/min速度离心15min，取其上清液过0.22μm微孔滤膜，即得阿霉素-土荆皮乙酸复合肿瘤靶向胶束(tLyp-1-DP-M)。将所述胶束在-80℃低温冰箱中预冻12h后取出，置于冷冻干燥器内干燥24h，即得tLyp-1-DP-M冻干粉。

利用马尔文激光粒度测定仪测得胶束在水溶液中的粒径大小为(128.4±0.79)nm，PI值为0.27，Zeta电位为(22.8±0.15)nm。用UV测定DOX含量，HPLC测定PAB含量，得到tLyp-1-DP-M的包封率为97.67％(DOX)和96.89％(PAB)，载药量为7.02％(DOX)和5.82％(PAB)。

实施例2阿霉素-土荆皮乙酸复合肿瘤靶向胶束的制备

制备阿霉素-土荆皮乙酸复合肿瘤靶向胶束时，TPGS1000为7mg，PC为3mg，水化温度40℃，水化体积10mL，水化时间1h，其余操作同实施例1。

实施例3阿霉素-土荆皮乙酸复合肿瘤靶向胶束的制备

制备阿霉素-土荆皮乙酸复合肿瘤靶向胶束时，TPGS1000为9mg，PC为1mg，水化温度50℃，水化体积8mL，水化时间1.5h，其余操作同实施例1。

实施例4不含肽的阿霉素-土荆皮乙酸复合胶束(DP-M)的制备按实施例1方法制备，除去不加tLyp-1-TPGS2000这一步骤。

本发明通过以下试验例证明本发明的有益效果：

试验例1本发明阿霉素-土荆皮乙酸复合肿瘤靶向胶束的理化性质

(1)粒径和电位

各取tLyp-1-DP-M和DP-M溶液放入比色皿中，使溶液体积约占比色皿体积的2/3，排出气泡，放入激光粒度测定仪中测定粒径。各取DP-M和tLyp-1-DP-M溶液放入电位杯中，使溶液在U形槽内两侧均高于金属片，排出槽内气泡，放入激光粒度测定仪中测定电位。测得的粒径和电位结果如下：DP-M粒径为(120.3±0.54)nm，分布均匀，电位为(0.58±0.21)mv；tLyp-1-DP-M粒径为(128.4±0.79)nm，分布均匀，电位为(22.8±0.15)mv。tLyp-1-DP-M因tLyp-1肽修饰在胶束的表面导致电位发生较大的改变，胶束的正电性能较好地与负电性的细胞膜结合，预示着细胞对药物有更高的摄取率。

(2)稳定性考察

取制备好的tLyp-1-DP-M、DP-M溶液与pH7.4的PBS缓冲液以体积比1:3混合，混合均匀后置于37℃恒温振荡器中孵育。分别在0、6、12、24、36、48h时间点取样，测定稀释后胶束的粒径及PDI值的大小。结果见图2。由图可以看出，DP-M及tLyp-1-DP-M的粒径虽略有增加，但是几乎没有变化，PDI均小于0.3。实验结果显示所制备的聚合物胶束能在体内稳定存在。

试验例2本发明阿霉素-土荆皮乙酸复合肿瘤靶向胶束肿瘤细胞毒性实验

(1)不同处方制剂含药物浓度的配制

精密称取tLyp-1-DP-M、DP-M胶束冻干粉用纯化水溶解后配制成1mg/mL(以DOX含量计算)的溶液，通过0.22μm的无菌滤膜过滤。用RPMI-1640培养液稀释至含DOX浓度为12.5、6.25、1.25、0.25、0.05、0.01μg/mL，用于MCF-7细胞以的毒性试验。DOX原料药、PAB先用少量的DMSO溶解，然后用RPMI-1640培养液配制成与上述DOX浓度含量相同的浓度，PAB与DOX物理混合溶液剂(D+P)的配置是将两者以物质的量摩尔比1:1混合，用RPMI-1640培养液稀释成12.5、6.25、1.25、0.25、0.05、0.01μg/mL(以DOX含量计算)，确保最终溶液含DMSO的量小于0.1％。

(2)MTT实验检测毒性

取对数生长期的MCF-7细胞，吸除旧培养液并用pH为7.4的PBS缓冲液润洗细胞2～3次，胰酶消化后用含10％胎牛血清RPMI-1640培养液终止消化，将吹打后细胞悬浮液置于离心机上以转速1000r/min，离心5min，然后加入适量的培养液吹打均匀。用血球计数板对稀释后的细胞悬浮液进行计数，然后MCF-7以4×10

表1各组对MCF-7细胞的生长抑制效果(n＝4)

由细胞毒性实验结果显示，DP-M毒性强于DOX，推测其中的载体材料TPGS起到了抗耐药作用，同时tLyp-1-DP-M对MCF-7细胞的毒性最大，推测可能是由于tLyp-1-DP-M表面的正电荷和细胞表面负电荷吸附作用，更有利于细胞的摄取，也可能与tLyp-1能主动识别MCF-7细胞表面的受体，从而也提高了细胞的摄取。

试验例3本发明阿霉素-土荆皮乙酸复合肿瘤靶向胶束肿瘤细胞摄取实验

通过流式细胞仪来定量考察肿瘤细胞对DOX、DOX和PAB的物理混合物(D+P)、DP-M及tLyp-1-DP-M的摄取情况。将对数生长期MCF-7细胞用胰酶消化并计数，调整细胞混悬液以3×10

以未加药物处理的细胞作为空白对照荧光强度峰，各组样品处理后得到相应的荧光强度峰如图3所示。从图中可以看出在2h摄取时间内，DOX、D+P两组中的细胞摄取阿霉素的量无统计学差异(p＞0.05)。DP-M组与D+P组具有显著性差异(p＜0.05)，推测DP-M组含有TPGS1000，有抑制外排的作用，能提高阿霉素的摄取。MCF-7细胞对tLyp-1-DP-M组的摄取荧光显著高于DP-M组(p＜0.01)，证明了tLyp-1的加入，能够特异性地靶向MCF-7细胞，进一步提高MCF-7细胞对阿霉素的摄取。

试验例4阿霉素-土荆皮乙酸复合肿瘤靶向胶束体内靶向性及药效研究

采用活体成像技术，探究了tLyp-1-DP-M在MCF-7荷瘤小鼠体内组织分布靶向性。然后进行体内药效学研究，采用尾静脉注射给药，分别考察DOX，D+P，DP-M和tLyp-1-DP-M对裸鼠肿瘤的抑制效果。以裸鼠肿瘤体积变化和体重变化为指标，并根据免疫组化以及裸鼠组织病理切片分析，评价制剂的疗效及毒副作用。

荷瘤小鼠肿瘤模型的建立：MCF-7细胞接种前一天晚上换新鲜的培养基过夜。当培养皿中的细胞密度长至80％～90％时，吸除培养基并用pH为7.4的PBS缓冲液润洗细胞2～3次，然后加入0.25％的胰酶消化并计数，离心，离心后倒去上清液并加入4℃的PBS溶液重悬细胞，调整细胞密度到达5×10

胶束体内靶向性的考察：

(1)活体成像

采用活体成像技术来证明tLyp-1-DP-M胶束的靶向性，即将造模成功的MCF-7荷瘤裸鼠分为3组，即DOX、DP-M、tLyp-1-DP-M组。各组分别通过尾静脉注射200μL含DOX浓度均为5mg/Kg溶液，并且分别于1、3、6、8、24h这5个时间点进行活体成像。在成像前2min，用易氟烷将裸鼠快速麻醉然后在发射波长为593nm条件下上机检测。在给药1h后，DOX组即可在肿瘤部位观察到其自身荧光，在3h时药物出现全身分布的情况，24h荧光强度明显减弱，且荧光强度随着时间表现出无规则变化，阿霉素在肿瘤部位聚集的量不多，时间停留也不长，随着血液循环，又分散于其他组织或者被代谢排出体外，这也证实了阿霉素溶液的组织分布较差。在DP-M组和tLyp-1-DP-M组中，静脉注射胶束溶液后，裸鼠肿瘤部位的荧光强度先增强后缓慢减弱。DP-M组在6h时肿瘤部位的荧光强度达到最强，24h后逐渐减弱，然而tLyp-1-DP-M组肿瘤部位的荧光强度在24h仍然很强。以上结果说明tLyp-1-DP-M胶束进入体内具备靶向性，能有效的聚集于肿瘤部位，且该胶束在肿瘤内部可以缓慢释放药物，即使经过24h，药物仍然可以作用于肿瘤部位。

(2)组织器官荧光成像

活体成像24h结束后，将DOX、DP-M和tLyp-1-DP-M组的裸鼠以脱颈椎方式处死，并快速的在超净台中进行解剖，取出其心、肝、脾、肺、肾组织和肿瘤。然后将取出组织器官和肿瘤放在生理盐水中洗净后，放置于滤纸上将水吸干，按顺序依次摆放于黑色塑料板上，上机成像，曝光时间为400ms，保证每个时间的曝光时间均一致。结果显示，DOX组在肝脏中分布明显，肿瘤部分并没有荧光出现。DP-M胶束组经给药24h后可见，荧光主要出现在肝脏中，在肿瘤部位也有小部分荧光被检测到，其他器官未见荧光信号，说明DP-M组对肝脏也是具有毒副作用。然而在tLyp-1-DP-M胶束组中，荧光全部聚集在肿瘤部位，其他器官并未检测到荧光信号，这一现象进一步证实了该胶束可以高效靶向于肿瘤部位。

体内药效学考察：

(1)肿瘤生长抑制

将上述造模成功的MCF-7荷瘤裸鼠随机分成5组：Saline、DOX、D+P、DP-M、tLyp-1-DP-M组，每组5只。以药物浓度DOX10 mg/kg，PAB7.5 mg/kg每隔三天给一次药，连续给药四次。同时，隔天给每只裸鼠称重，并使用游标卡尺测量肿瘤的最长直径(A)和最短直径(B)。最后一天给药2h后，采用颈椎脱臼法处死裸鼠，剥离皮下完整的肿瘤并称重。绘制出裸鼠肿瘤体积-时间和体重-时间变化曲线。肿瘤体积和肿瘤抑制率的计算公式如下：

式中，V：肿瘤体积

A：肿瘤最大直径

B：肿瘤最小直径

从图4可以看出，生理盐水组的裸鼠肿瘤相对体积变化最为明显，肿瘤生长速度不受影响，在接种后的第21天肿瘤体积已经长至第11天的6.2倍。胶束组肿瘤的生长速度较慢，tLyp-1-DP-M相对体积变化最小，其抑制肿瘤效果最强。实验最后一次给药结束后，将各组裸鼠处死，然后取出肿瘤组织并称重，计算DOX组、D+P组、DP-M组和tLyp-1-DP-M组的抑瘤率，各组的抑瘤率分别为18.8％、36.0％、52.8％、76.2％。从图5中可以直观的看出生理盐水组肿瘤体积最大，tLyp-1-DP-M组的肿瘤体积最小，抑制效果最为明显。接种后的第21天，即给药后的第11天，tLyp-1-DP-M组瘤重分别为生理盐水组的23.7％(P＜0.001)，为DOX组的29.3％(P＜0.01)，为D+P组的35.3％(P＜0.001)，为DP-M组的50.4％(P＜0.05)。DOX组，D+P组、DP-M组的肿瘤生长也受到一定程度的抑制，分别为生理盐水组的81.2％(P＞0.05)、67.3％(P＜0.01)、47.2％(P＜0.01)，说明tLyp-1-DP-M组对裸鼠肿瘤的生长抑制效果最为明显。D+P组和DOX组比，肿瘤的大小也有显著性差异(P＜0.05)，说明阿霉素和土荆皮乙酸具有联合抗肿瘤作用。

(2)组织学考察

通过HE染色切片观察肿瘤组织学特征病理，石蜡切片制作方法如下：裸鼠处死后解剖出完整的心、肝、脾、肺、肾组织及肿瘤，放入50mL离心管内，加入4％多聚甲醛内浸泡固定。第二天将其取出，放入脱水盒内，并把脱水盒放入脱水机内进行梯度酒精脱水，然后将上述处理后的肿瘤和组织放入包埋机内进行包埋。包埋后将其切成厚为4μm的切片，最后用苏木素-伊红染色，用中性树胶封片。将制成的肿瘤组织切片置于显微镜下，观察各组织部位情况并拍照记录。从图6中可以看出，生理盐水组肿瘤细胞核大深染，细胞密度大，胞浆较少。而在DOX组和D+P组可见视野中肿瘤组织的细胞核开始皱缩，胞浆也开始增多，DP-M组和tLyp-1-DP-M同样可以看见这种现象，且更为明显，特别是tLyp-1-DP-M组细胞核进一步皱缩，视野中细胞核几乎看不到，并出现较大间隙。以上结果均说明，tLyp-1-DP-M抗肿瘤效果最强。

毒副作用评价：

给药11天内，观察对照组和给药各组裸鼠的体型及体重情况，并隔天对其进行称重，观察其排泄物和毛色情况，同时，利用HE染色实验来进一步评价tLyp-1-DP-M对各主要器官的毒性。

空白对照组与各个给药组裸鼠在给药期间的体重变化情况如图7所示。生理盐水组裸鼠体重变化最为明显，呈一直上升趋势，最终实验结束时裸鼠体重为第一天称量体重的1.23±0.06倍，而tLyp-1-DP-M组体重在前5天内先增加然后成微量下降趋势，总体体重呈微量上升趋势。同样，DP-M组在前5天内相对体重稍微增加，之后变化不明显。DOX组、D+P组的荷瘤鼠体重下降明显，且在给药期间裸鼠的毛色无光泽并有裸鼠死亡。以上结果均表明原料药阿霉素具有极大的毒副作用，而制备成tLyp-1-DP-M胶束能减小阿霉素的毒副作用。

各给药组与空白对照组裸鼠的组织病理学切片如图8。从图中可以看出，与生理盐水相比，DOX组和D+P组裸鼠心肌细胞出现损伤，心肌纤维断裂，肌间隙变宽，而DP-M、tLyp-1-DP-M组无明显的损伤。根据这一结果，可以推测出原料药DOX包载在胶束内能减少阿霉素的心脏毒性。在肝脏病理切片中，DOX组肝脏组织上有肉芽肿形成，说明其对肝脏的毒性很大，在D+P组也有少量肉芽肿形成，表明阿霉素和土荆皮乙酸联合给药能降低对肝脏的毒性。在脾脏的病理切片中，DP-M、tLyp-1-DP-M组与生理盐水组组织形态相近，组织结构清晰，红髓、白髓及边缘清晰，未显示出脾毒性，而DOX组和D+P组的组织切片颜色泛白，说明内有较多凋亡细胞，说明阿霉素对脾脏也有一定毒性。在肺脏切片中，DP-M、tLyp-1-DP-M组与生理盐水组切片外观一致，细胞完整，染色完全，未显示肺毒性，而DOX组和D+P组中组织受到损伤，染色不完全。给药组与空白组的肾脏病理学结果图差异不明显，未显示明显的肾脏毒性。

肿瘤组织免疫组化考察：

(1)实验方法和步骤

将肿瘤切片采用免疫组化SP法(链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法)常规操作处理，DAB显色。各级酒精脱水处理后，中性树脂封片，最后苏木素轻度复染，常规脱水，透明，干燥，封片。光学显微镜下对CD31蛋白的表达进行检查，以棕黄色的强弱程度为观察指标，结果见图9。

(2)微血管计数的方法

CD31又称为血小板-内皮细胞粘附分子，主要存在于血小板、中性粒细胞、单核细胞和某些类型的T细胞表面，以及内皮细胞间紧密连接处，其很可能参与白细胞的迁移、血管生成和整合素的激活。在免疫组化实验中，CD31是主要与血管内皮细胞上的CD31蛋白相结合，呈棕褐色，用来评估血管内皮组织中肿瘤血管生成。MVD的测定参照Weidner等校对计数方法，先在低倍镜下观察整个切片，寻找3个血管高密度区，即“热点”；然后在200倍的光镜下计数染色呈阳性的血管数，对于微血管的识别不需具备完整的管腔和红细胞，只要有明显的血管内皮细胞染色、并且能与相邻的血管、肿瘤细胞以及间质成分相分隔的，就可视为一个独立的血管，分辨不清以及具有较厚肌层的血管不纳入计数内；计数3个视野下血管数目平均值作为MVD值(个/HP)。结果见图10。

肿瘤血管生成是肿瘤生长、侵袭和转移的重要条件。目前，检测肿瘤新生血管微密度多采用CD31血管内皮标记物，从图9可以观察到CD31蛋白在生理盐水组肿瘤中的微血管和大血管上均有较强表达，呈棕黄色线条，MVD值为30.0±2.6。在DOX组肿瘤中大血管和微血管都有表达，MVD值为18.7±3.0，显著小于生理盐水组(P<0.05)。然而在D+P组与DOX组相比，肿瘤血管密度显著性减少(P<0.05)，而在D+P、DP-M、tLyp-1-DP-M三组肿瘤中的微血管密度没有显著性差异，并且只观察到微血管中有表达，大血管没有观察到明显的染色。从实验结果推测，PAB有抑制血管新生作用，从而抑制肿瘤的生长。

以上所述的实施例只是本发明的较佳方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。