一种间充质干细胞类外泌体的制备方法

技术领域

本发明属于牙髓间充质干细胞治疗技术领域，具体涉及一种间充质干细胞类外泌体的制备方法。

背景技术

间充质干细胞在再生医学中有着重要地位，尤其是治疗慢性炎症性全身性疾病和免疫性疾病方面。随着细胞外囊泡技术的快速发展，间充质干细胞在越来越多的疾病中成为崭露头角的亮点。越来越多的研究支持间充质干细胞的治疗效果是由于旁分泌作用，而不仅仅是通过植入和分化效应进行修复。

外泌体临床应用的所面临的主要问题是产能不足。差速超离法是用于外泌体分离的第一种方法，至今仍是外泌体分离的金标准，但是长时间的高速离心会造成外泌体的机械损伤，差速超离耗时长，提取率不高，使其难以在短时间内处理多个生物样品。聚合物沉淀法操作简单，所需时间短，适用于处理大量样品，但纯度不高且回收率较低，可能产生假阳性结果，产生的聚合物难以去除。超滤和排阻色谱法是根据外泌体与其他组分的尺寸差异进行分离，免疫亲和法是通过标记外泌体的特异性蛋白来分离，以上两种方法都存在提取效率较低的问题。基于以上原理也出现多个商业化的试剂盒，极大地简化了提取流程，但不同厂商的试剂盒提取效果差异较大。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种间充质干细胞类外泌体的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种间充质干细胞类外泌体的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：提取牙髓间充质干细胞，牙髓间充质干细胞是间充质干细胞的一种；

步骤2：将牙髓间充质干细胞应用人血小板裂解液的α-MEM培养基培养；

步骤3：将步骤2培养得到的牙髓间充质干细胞应用超纯水重悬，于2～8℃孵育10～30min,存放入-80℃冰箱中，8～24h后取出，于2～8℃解冻，重复上述过程3～5次；

步骤4：将步骤3反复冻融得到的细胞悬液在2～8℃以2000～6000g的转速低温离心20～60min，离心后取上清，弃去沉淀，即可得到牙髓间充质干细胞裂解液；

步骤5：将步骤4得到的牙髓间充质干细胞裂解液在2～8℃以80000～120000g的转速低温超速离心30～90min，离心后去除上清，以PBS重选沉淀得到外泌体溶液。

优选的，在步骤1中，将取出的牙髓组织切成1mm

优选的，添加的中性酶的质量浓度为0.1％～1％，Ⅰ型胶原酶的的质量浓度为0.1～0.8％；添加双抗为50～100U/mL青霉素和50～150ug/mL链霉素。

优选的，在步骤2中，牙髓间充质干细胞在添加有人血小板裂解液的α-MEM培养基中培养36～72h后，更换添加有人血小板裂解液的α-MEM培养基继续培养，并且在后续培养过程中每36～72小时更换一次培养基。

优选的，所述添加有人血小板裂解液的α-MEM培养基中人血小板裂解液的体积浓度为2～10％，这样就避免了传统的胎牛血清中所含的异种抗原成分。

优选的，在步骤4中，得到的牙髓间充质干细胞裂解液蛋白浓度为0.8～1.5mg/ml。

优选的，在步骤5中，重悬牙髓间充质干细胞外泌体于PBS中的蛋白浓度为0.8～1.5mg/ml。

与现有技术相比，本发明提供了一种间充质干细胞类外泌体的制备方法，具备以下有益效果：

1、该方法从牙髓间充质干细胞裂解液中提取外泌体，极大地提高了获得效率，同时获得外泌体中不含有任何动物源性物质，安全可靠。

2、本发明中获得的类外泌体和内泌体与传统方法提取外泌体通过多种检测相比较，在成分、功能等外面均相同；通过该提取方法获得的外泌体，无论在质还是量上均可以很好地满足临床需求，方便推广应用。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制，在附图中：

图1为本发明实施例中提取的类外泌体和内泌体与传统方法提取的外泌体的电镜对比图；

其中；A：本发明提取的类外泌体和内泌体；B：传统方法提取的外泌体；

图2为本发明实施例中提取的类外泌体和内泌体与传统方法提取的外泌体，外泌体特异性标记蛋白WesternBlot对比图；

其中；A：本发明提取的类外泌体和内泌体；B：传统方法提取的外泌体；

图3为本发明实施例中提取的类外泌体和内泌体与传统方法提取的外泌体的粒径对比图；

其中；A：本发明提取的类外泌体和内泌体；B：传统方法提取的外泌体；

图4为本发明实施例中提取的类外泌体和内泌体与传统方法提取的外泌体的蛋白芯片对比图；

图5为本发明实施例中提取的类外泌体和内泌体与传统方法提取的外泌体，在体外条件下对小鼠成纤维细胞的迁徙性影响的检测示意图；

图6为本发明实施例中提取的类外泌体和内泌体与传统方法提取的外泌体，在体内条件下对小鼠伤口愈合影响的检测示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1-6，本发明提供一种技术方案：一种间充质干细胞类外泌体的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：提取牙髓间充质干细胞，牙髓间充质干细胞是间充质干细胞的一种；

步骤2：将牙髓间充质干细胞应用人血小板裂解液的α-MEM培养基培养；

步骤3：将步骤2培养得到的牙髓间充质干细胞应用超纯水重悬，于2～8℃孵育10～30min,存放入-80℃冰箱中，8～24h后取出，于2～8℃解冻，重复上述过程3～5次；

步骤4：将步骤3反复冻融得到的细胞悬液在2～8℃以2000～6000g的转速低温离心20～60min，离心后取上清，弃去沉淀，即可得到牙髓间充质干细胞裂解液；

步骤5：将步骤4得到的牙髓间充质干细胞裂解液在2～8℃以80000～120000g的转速低温超速离心30～90min，离心后去除上清，以PBS重选沉淀得到外泌体溶液。

本发明中，优选的，在步骤1中，将取出的牙髓组织切成1mm

本发明中，优选的，添加的中性酶的质量浓度为0.1％～1％，Ⅰ型胶原酶的的质量浓度为0.1～0.8％；添加双抗为50～100U/mL青霉素和50～150ug/mL链霉素。

本发明中，优选的，在步骤2中，牙髓间充质干细胞在添加有人血小板裂解液的α-MEM培养基中培养36～72h后，更换添加有人血小板裂解液的α-MEM培养基继续培养，并且在后续培养过程中每36～72小时更换一次培养基。

本发明中，优选的，所述添加有人血小板裂解液的α-MEM培养基中人血小板裂解液的体积浓度为2～10％，这样就避免了传统的胎牛血清中所含的异种抗原成分。

本发明中，优选的，在步骤4中，得到的牙髓间充质干细胞裂解液蛋白浓度为0.8～1.5mg/ml。

本发明中，优选的，在步骤5中，重悬牙髓间充质干细胞外泌体于PBS中的蛋白浓度为0.8～1.5mg/ml。

实施例

一种新的间充质干细胞类外泌体和内泌体获取方法，包括以下步骤：

步骤1：准备牙髓间充质干细胞；

将牙髓组织分割成1mm

步骤2：将牙髓间充质干细胞应用人血小板裂解液的α-MEM培养基培养；

步骤3：将步骤2培养得到的牙髓间充质干细胞应用超纯水重悬，于2～8℃孵育10～30min，存放入-80℃冰箱中，8～24h后取出，于2～8℃解冻，重复上述过程3～5次；

步骤4：将步骤3反复冻融得到的细胞悬液在2～8℃以2000～6000g的转速低温离心20～60min，离心后弃去沉淀取上清，即可得到牙髓间充质干细胞裂解液；

步骤5：将步骤4得到的牙髓间充质干细胞裂解液在2～8℃以80000～120000g的转速低温超速离心30～90min，离心后去除上清，以PBS重悬沉淀得到外泌体溶液。

在步骤2中，牙髓间充质干细胞每间隔36～72h更换一次培添加有人血小板裂解液的α-MEM培养基。所述添加有人血小板裂解液的α-MEM培养基中人血小板裂解液的体积浓度为2～10％。最佳体积浓度为5％。

在步骤1中，添加的中性酶的质量浓度为0.1％～1％，最佳质量浓度为0.4％，Ⅰ型胶原酶的的质量浓度为0.1～0.8％，最佳质量浓度为0.3％；添加双抗为100U/mL青霉素和100ug/mL链霉素。

在步骤4中，得到的牙髓间充质干细胞裂解液蛋白浓度为0.8～1.5mg/ml。

本发明提供一种间充质干细胞类外泌体和内泌体获取方法，极大简化了外泌体提取流程，提高了外泌体获得效率；该方法无须收集饥饿处理后细胞培养上清，尽可能减少了外泌体在分泌出来之后于培养基中的降解，可以较为快捷且高效地获得间充质干细胞类细胞外泌体。该提取方法获得的牙髓间充质干细胞外泌体，经过检测，表达外泌体标志性蛋白，电镜下呈典型“杯口”状形态，粒径大小位于30-200nm之间，富含多种生长因子。本发明通过体外实验发现，该提取方法获得牙髓间充质干细胞类外泌体和内泌体和传统方法提取的外泌体一样可以小鼠成纤维细胞的增殖和迁徙，同时还能促进小鼠烧伤创面的愈合，为临床上大规模应用牙髓间充质干细胞外泌体的来源提供了关键技术。通过从牙髓间充质干裂解液中提取外泌体，该方法在操作过程中简便易行，便于标准化操作，并且提取效率极高，无论在时间成本还是细胞成本均远高于传统外泌体的提取方法。该培养体系获得的类外泌体和内泌体，经过检测，在形态、外泌体标记物、细胞因子含量方面，与传统方法获得的外泌体均无明显差异。通过体内实验和体外实验对比，我们也发现二种方法获得的外泌体均能够促进成纤维细胞的增殖迁徙，同时还能够促进小鼠伤口愈合。通过该提取方法获得的外泌体，无论在质还是量上均可以很好地满足临床需求，方便推广应用，为临床上应用外泌体提供了关键技术。

实验部分；

一、所用到的试剂及其设备；

1.DPSC(牙髓间充质干细胞)：选择宁波一棵芽生物科技有限公司构建的3系人牙髓间充质干细胞；

2.细胞培养试剂；

人血小板裂解液(STEMERY，RC-002-100，即STEMERY公司，货号RC-002-100，以下同理)，α-MEM(Gbico，12571063)，Ⅰ型胶原酶(Sigma，SCR103)，中性蛋白酶(Roche，04942078001)，DPBS(Gbico，14190144)，无血清冻存液(Sigma，D2650)，青霉素(Sigma，I9532)，链霉素(Sigma，85886)；

二、具体的培养及其鉴定过程；

1.人牙髓间充质干细胞的准备；

标本来源：18～30岁的废弃第三磨牙牙髓组织，该实验样品来自于武汉大学人民医院，本实施例的研究通过了武汉大学人民医院伦理委员会的讨论通过，并且取得了患者本人的同意，由武汉大学人民医院再生医学中心根据宁波一棵芽生物科技有限公司的要求进行提取培养。可理解，在其他实施例中，该牙髓组织或者其他人类细胞样本也可以取自一些样本冻存库或者治疗机构等；

2.本方法制备外泌体与传统方法外泌体对比；

2.1传统方法外泌体的制备；

将牙髓间充质干细胞在无血清条件下培养48h，收集培养瓶中的细胞上清于离心管中，依次在4℃以300g离心15min，再以3000g离心15min，最后以10000g离心30min，以去除死细胞，细胞碎片等沉淀并除菌。收集的细胞上清使用10KDaMWCO的超滤管以4000g离心30min进行浓缩，浓缩好的上清以100000g在4℃，离心60min，获得外泌体；

2.2电镜检测；

将样本稀释100倍后，用移液枪吸取10μl滴在封口膜上形成一个液滴，将铜网有碳膜的一面倒扣在液滴上孵育5min，再用吸取10μl的2％磷钨酸滴在封口膜上形成一个液滴，将铜网具有碳膜的一面倒扣在液滴上负染2min，用PBS液滴清洗2次后，在室温下晾干，上机拍照；

如图1所示，本实施例获得的类外泌体和内泌体与传统方法获得的外泌体均为负染显示为150-200nm杯状膜泡，在外观上无任何差别。

2.3外泌体标志蛋白检测；

将外泌体样本加入蛋白裂解液后，行SDS-PAGE凝胶电泳，行ECL显影和凝胶成像分析，使用扫描仪将上述胶片进行扫描，选择TSG101、Alix作为检测指标；

如图2所示，本实施例获得的类外泌体和内泌体与传统方法获得的外泌体均表达外泌体的标志物TSG101和Alix；

2.4外泌体粒径检测；

将PBS通过针头过滤器过后，将外泌体样品稀释3000倍，使其浓度约为10

如图3所示，本实施例获得的类外泌体和内泌体与传统方法获得的外泌体均表达外泌体的粒径均在30-200nm之间；

2.5外泌体蛋白芯片检测；

应用Raybiotech的GSH-GF-1检测俩种外泌体样品中bFGF、HGF、VEGF等40种细胞生子因子的含量，如图4所示，本实施例获得的类外泌体中的bFGF、HGF明显高于传统方法获得的外泌体组，只有VEGF-A的含量略低于传统方法获得的外泌体组，其他细胞因子的水平基本于传统方法获得的外泌体组持平。

2.6外泌体体外功能实验；

选取P2-4代的小鼠成纤维细胞，PBS清洗三次，加入胰蛋白酶消化细胞2min，吸出胰蛋白酶，加入含血清中和培养基，把细胞吹打下来后吸入离心管，以1000rpm离心5min，弃去上清后，再用PBS清洗2次，用不含血清的DMEM重悬计数；24孔板下层分别加入700μl含有外泌体样品的DMEM培养基；

Transwell培养小室放入24孔板中，小室内则加入300μlDMEM培养基含1×10

如图5所示，本实施例获得的类外泌体和内泌体与传统方法获得的外泌体均表现出对小鼠成纤维细胞有促进迁徙的作用；

2.7外泌体体内功能实验；

将购置的6-8周龄BALB/c雄性小鼠适应性饲养一周；开始建模之前，先用剃毛刀对小鼠背部皮肤进行剃毛，再用脱毛膏将皮肤细毛脱干净；将10mm的铝合金棒在沸水中加热5min，待小鼠麻醉后至于背部皮肤10s；三天后对小鼠创面进行清痂皮处理，术后涂抹外泌体进行治疗，设置空白对照组，不做任何治疗；

如图6所示，本实施例获得的类外泌体和内泌体与传统方法获得的外泌体均表现出对小鼠的烧伤创面具有促进愈合作用，且明显快于对照组。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。