与HPV33型衣壳蛋白L1特异性结合的抗体或其抗原结合片段及其应用

技术领域

本发明涉及抗体技术领域，尤其是涉及一种与HPV33型衣壳蛋白L1特异性结合的抗体或其抗原结合片段及其应用。

背景技术

人乳头状瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)是一种无包膜的小DNA病毒，目前约有200多种，HPV主要感染皮肤和粘膜组织，其中有40多种HPV感染可以导致人类疾病，根据HPV感染与癌症发生的关系，HPV可以分为高危型和低危型，其中HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58及59等为高危型，高危型HPV持续性感染可引发宫颈癌、肛门癌和阴道癌等恶性肿瘤。世界范围内，宫颈癌在女性高发恶性肿瘤中排名第三，全球每年约有60万女性新发宫颈癌，超过30万的女性死于宫颈癌。其他的HPV亚型为低危型，主要引起皮肤黏膜的疣状增生，表现为尖锐湿疣、扁平疣等病变，目前在临床上还没有很好的治疗方法。

预防HPV感染最有效的方法是接种HPV疫苗，目前国内外已上市的5个宫颈癌疫苗均以HPV主要衣壳蛋白L1为有效抗原，通过基因重组技术在一定条件下组装为病毒样颗粒(Virus-like particles，VLPs)，再辅以不同的佐剂配制成疫苗。基于重组HPV L1 VLPs疫苗的成功上市及广泛应用，充分表明了L1 VLPs高度还原了天然HPV的结构，保留了天然病毒的关键中和表位，具有与野生同型病毒相同或相似的抗原性和免疫原性，可诱导高滴度的中和抗体，进而很好地预防HPV持续感染、宫颈癌、及其他相关疾病。目前已上市的HPV疫苗，Merck公司的四价疫苗“Gardasil”和九价疫苗“Gardasil 9”以及国内外研制的超过两价次的HPV疫苗多数包含HPV 33型的疫苗成分。

在HPV疫苗生产的全程，保持正确的中和表位和稳定的VLPs结构，是保证疫苗质量和有效性的前提。在疫苗生产工艺的各个环节建立准确、灵敏、特异的检测方法对抗原结构和定量进行全程监控既是技术的需要，也是法规的指导原则。利用经典的抗原抗体反应原理，采用中和抗体对抗原中和表位进行鉴定是疫苗质控的有效手段，通过Western-blot、ELISA、和IVRP等技术手段对HPV疫苗原液、半成品及成品中的抗原成分进行鉴别实验、抗原含量检测、抗原体外效力测定，可为疫苗的检测放行提供依据。因此单克隆中和抗体作为是疫苗抗原质控的重要反应试剂，并且同时具有特异性和中和活性的单克隆抗体在疫苗质控过程中具有不可替代的作用。另外，疫苗效力检测是疫苗成品放行的重要指标，目前HPV疫苗效力是通过疫苗免疫动物后采集血清，采用假病毒中和实验来检测血清的中和效价来进行评价，虽然该方法能够较好地反映疫苗成品的中和抗体水平，但也同时存在着动物用量较多，检测值波动较大，检测周期长，成本较高的缺点，同时也违背动物实验的3R原则，国内外一些企业已在响应国际组织的倡导，在逐渐淘汰动物实验检测疫苗成品效力的方法。目前已被认同和用于部分实践的，基于中和抗体针对疫苗抗原的中和表位和体外活性的质控和表征，已经是一种高效、经济、和可行的替代方法，例如美国默克公司的HPV疫苗，中国的甲肝和乙肝疫苗，都已经部分或全部使用中和抗体而非动物实验放行疫苗产品。因此，提供更多的能够结合HPV的中和性单克隆抗体是目前市场需要的。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与HPV33型衣壳蛋白L1特异性结合的抗体或其抗原结合片段，通过以HPV33为抗原筛选获得一株单克隆抗体，通过克隆、鉴定与基因结构的分析，确定了其CDR区序列，本发明的另一目的是提供关于该抗体或其抗原结合片段的生物材料和它们的应用。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

根据本发明的一个方面，提供了一种与HPV33型衣壳蛋白L1特异性结合的抗体或其抗原结合片段，包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区包含氨基酸序列如SEQID NO.1～3所示的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3；所述轻链可变区包含氨基酸序列如SEQ IDNO.4～6所示的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。

根据本发明的另一个方面，还提供了一种生物材料，该生物材料选自(ⅰ)～(ⅲ)中任一项：

(ⅰ)多核苷酸，包括编码上述与HPV33型衣壳蛋白L1特异性结合的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列；

(ⅱ)载体，所述载体携带前述(ⅰ)多核苷酸；

(ⅲ)细胞，所述细胞携带(ⅰ)中多核苷酸，或含有(ⅱ)中载体，或表达权上述与HPV33型衣壳蛋白L1特异性结合的抗体或其抗原结合片段。

根据本发明的另一个方面，还提供了一种分泌与HPV33型衣壳蛋白L1特异性结合的单克隆抗体的杂交瘤细胞，是保藏号为CGMCC NO：45705的鼠源杂交瘤细胞株12E1。

根据本发明的另一个方面，还提供了一种上述与HPV33型衣壳蛋白L1特异性结合的抗体或其抗原结合片段，上述的生物材料，或上述的杂交瘤细胞在非诊断和治疗目的的检测HPV33型衣壳蛋白L1，或在制备用于检测HPV33型衣壳蛋白L1的产品中的应用。

根据本发明的另一个方面，还提供了上述的与HPV33型衣壳蛋白L1特异性结合的抗体或其抗原结合片段，或上述的生物材料，或上述的杂交瘤细胞在疫苗生产或质控中的应用。

根据本发明的另一个方面，还提供了一种用于检测HPV33型衣壳蛋白L1的试剂或试剂盒，该试剂或试剂盒包含上述的与HPV33型衣壳蛋白L1特异性结合的抗体或其抗原结合片段。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过杂交瘤技术筛选获得针对33型HPV的鼠源单克隆抗体及杂交瘤细胞，该抗体对HPV33 L1 VLPs和假病毒具有高度的特异性和中和活性，表明该抗体是一个针对HPV33 L1蛋白中和表位的抗体。通过直接ELISA法检测该单抗的特异性，发现该抗体与HPV6、HPV11、HPV 16、HPV 18、HPV 31、HPV 45、HPV 52、HPV 58等抗原均无交叉反应，特异性良好。通过ELISPOT假病毒中和实验法检测该抗体的中和活性，显示对HPV33型假病毒具有高度的中和活性。同时对该抗体的重链可变区及轻链可变区基因进行测序，并对其CDR区进行分析，对该抗体进行了全面表征，得到了具有该CDR区域的与HPV33型衣壳蛋白L1特异性结合的抗体或其抗原结合片段。

基于该抗体或其抗原结合片段，本发明还建立了检测HPV33型衣壳蛋白L1抗原含量的方法，结果显示，该方法具有良好的特异性、灵敏度、线性和准确度，可以特异性快速鉴别并定量HPV33型衣壳蛋白L1抗原，对疫苗有效抗原成分的含量及活性进行评价，广泛应用于HPV疫苗的生产质控、临床病原学检测及流行病调查，对HPV疫苗的生产和宫颈癌的防控具有重要价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为HPV33型多抗和鼠单克隆抗体分别稀释500和8000倍后检测抗原的标准曲线。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。

在本文中“抗体或其抗原结合片段”是指结合特定抗原的蛋白，其泛指包含互补决定区(CDR区)的一切蛋白及蛋白片段。此外，“抗体或其抗原结合片段”也包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体。在本文中“抗原结合片段”是包含抗体CDR的物质，其缺乏至少一些存在于全长链中的氨基酸但仍能够特异性结合至抗原。此类片段具生物活性，因为其结合至靶抗原，且可与其他抗原结合分子(包括完整抗体)竞争结合至给定表位。本发明中抗原结合片段具有特异性识别并结合HPV33型衣壳蛋白L1能力。

抗体或其抗原结合片段的“可变区(variable region)”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基端识别并结合抗原的结构域，该区段氨基酸的组成和排列决定了抗体识别抗原的特异性。重链可变区可以被称为“VH”。轻链可变区可以被称为“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分，并含有抗原结合位点。重链和轻链的可变区各自由通过4个框架(framework region，FR)连接的3个互补性决定区(complementarity-determiningregion，CDR)(也被称作高变区)组成。框架和CDR的范围已被精确定义，例如在Kabat(参见《免疫重要的蛋白质的序列》((Sequences of Proteins of Immunological Interest)，E.Kabat等)和Chothia中，本领域众所周知的任何CDR确定方法，包括方法的组合，可以鉴别可变结构域的CDR。每个链中的CDR通过FR保持紧密靠在一起构成可变区，通常情况下，重链和轻链的可变区VL/VH可由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

本文中术语“多核苷酸”指的是任何长度的核苷酸的聚合物形式，多核苷酸包括核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸。多核苷酸的实例包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合体或者包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然、化学或生化修饰、非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物。多核苷酸包含编码上述抗体或其抗原结合片段的部分，编码可选地为编码正义链或反义链。多核苷酸可以是天然存在的、合成的、重组的或它们的任意组合。

术语“载体(vector)”是指，可将多核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。

所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒。在一些实施方式中，本发明所述载体中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等)。

本文使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这类名称都包括后代。后代可以由于天然的、偶然的或故意的突变不一定与原代细胞完全相同，例如在形态学上和/或在基因组DNA上与原代细胞存在差异。

本文中“检测HPV33型衣壳蛋白L1”中HPV33型衣壳蛋白L1可以是天然的、通过基因工程重组表达的、化学和/或生化修饰的、非天然或衍生的蛋白或多肽或它们的任意组合。也包括检测HPV33型病毒、含有HPV33型衣壳蛋白L1的VLPs和假病毒。本文中“HPV33型衣壳蛋白L1”、“HPV33 L1”或它们的类似表述可以互相替换使用。

除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

根据本发明的一个方面，提供了一种与HPV33型衣壳蛋白L1特异性结合的抗体或其抗原结合片段。本发明通过杂交瘤技术筛选获得针对33型HPV的鼠源单克隆抗体，该抗体对HPV33 L1 VLPs和假病毒具有高度的特异性和中和活性，表明该抗体是针对HPV33型衣壳蛋白L1中和表位的抗体。本发明根据该鼠源单克隆抗体得到对HPV33型衣壳蛋白L1具有良好结合能力的CDR区域。

抗体与抗原的表位是一一对应的关系，一个抗原表位对应一个相应的抗体，抗原表位分线性表位和空间表位，中和表位多数为空间表位，抗原的中和表位是产生中和抗体的结构基础，也是作为疫苗候选抗原激发有效免疫应答的前提。由于抗体产生的异质性和多样性，即使针对同一抗原也会产生具有不同CDR区的抗体，而筛选获得具有中和活性的优质抗体概率很低，该抗体具有唯一性。

本发明提供的抗体或其抗原结合片段包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中重链可变区包含如下VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3：

VHCDR1：SDYAWN(SEQ ID NO.1)；

VHCDR2：YINYSGFTSYNPSLKS(SEQ ID NO.2)；

VHCDR3：GGATTAYDWYFDV(SEQ ID NO.3)。

轻链可变区包含如下VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3：

VLCDR1：ITSTDIDDMN(SEQ ID NO.4)；

VLCDR2：EGNTLRP(SEQ ID NO.5)；

VLCDR3：LQSDNMPFT(SEQ ID NO.6)。

重链可变区含有如下结构：VHFR1-VHCDR1-VHFR2-VHCDR2-VHFR3-VHCDR3-VHFR4。可选的实施方式中，重链可变区的任意一骨架区选自氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示重链可变区的骨架区，即VHFR1、VHFR2、VHFR3和VHFR4中一个或多个选自SEQ ID NO.7所示重链可变区的对应的骨架区。

轻链可变区含有如下结构：VLFR1-VLCDR1-VLFR2-VLCDR2-VLFR3-VLCDR3-VLFR4。可选的实施方式中，轻链可变区的任意一骨架区选自氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示轻链可变区的骨架区，即VLFR1、VLFR2、VLFR3和VLFR4中一个或多个选自SEQ ID NO.8所示轻链可变区的对应的骨架区。

可选的实施方式中，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

可选的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段还包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD任何其中之一的部分或全部恒定区的序列。

可选的实施方式中，所述抗原结合片段包括F(ab’)

可选的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段除去CDR区域，其余部分序列来源物种包括小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、雪貂、猫、狗、山羊、绵羊、奶牛、猪、马、猴和人中的一种或多种。

可选的实施方式中，所述抗体选自完整的抗体分子，还包括重链恒定区和轻链恒定区，且抗体为IgG1抗体，轻链为κ链。

可选的实施方式中，抗体为单克隆抗体，由保藏号为CGMCC NO：45705的杂交瘤细胞株12E1分泌。

根据本发明的另一个方面，还提供了一种生物材料，所述生物材料选自(ⅰ)～(ⅲ)中任一项：

(ⅰ)多核苷酸，包括编码前述抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列；可选的实施方式中，所述多核苷酸编码重链可变区，核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；可选的实施方式中，所述多核苷酸编码轻链可变区，核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

(ⅱ)载体，所述载体携带前述(ⅰ)多核苷酸。

(ⅲ)细胞，所述细胞携带所述(ⅰ)多核苷酸，或含有所述(ⅱ)载体，或表达前述与HPV33型衣壳蛋白L1特异性结合的抗体或其抗原结合片段。

根据本发明的另一个方面，还提供了一种分泌与HPV33型衣壳蛋白L1特异性结合的单克隆抗体的杂交瘤细胞，是保藏号为CGMCC NO：45705的鼠源杂交瘤细胞株12E1。交瘤细胞株12E1保藏编号为CGMCC NO：45705，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。保藏日期：2023-8-23.其分泌的单克隆抗体具有氨基酸序列如SEQ ID NO.1～3所示的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3和氨基酸序列如SEQ ID NO.4～6所示的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。

根据本发明的另一个方面，还提供了一种上述与HPV33型衣壳蛋白L1特异性结合的抗体或其抗原结合片段，或上述与HPV33型衣壳蛋白L1特异性结合的抗体或其抗原结合片段相关的生物材料，或上述的杂交瘤细胞在非诊断和治疗目的的检测HPV33型衣壳蛋白L1，或在制备用于检测HPV33型衣壳蛋白L1的产品中的应用。

可选的实施方式中，在非诊断和治疗目的的检测抗原时，可选择本领域已知的、常规的手段进行检测，例如利用免疫检测技术，使用上述抗体或其抗原结合片段作为与固相载体结合的用于捕获抗原的固相载体，或者作为与捕获的抗原结合的抗体。所述抗体或其抗原结合片段还任选的连接有标记物以提供可被检测的信号，包括但不限于酶、荧光分子标记、荧光微球、彩色微球、胶体金、生物素或链霉亲和素中的一种或多种。具体的检测手段包括但不限于免疫印迹、免疫组化、免疫层析或ELISA等，本发明对此不做限制。

根据本发明的另一个方面，还提供了一种上述与HPV33型衣壳蛋白L1特异性结合的抗体或其抗原结合片段，或上述与HPV33型衣壳蛋白L1特异性结合的抗体或其抗原结合片段相关的生物材料，或上述的杂交瘤细胞在疫苗生产或质控中的应用。

根据本发明的另一个方面，还提供了一种用于检测HPV33型衣壳蛋白L1的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包含上述抗体或其抗原结合片段。

可选的实施方式中，所述试剂或试剂盒包括标记物，所述标记物与上述抗体或其抗原结合片段连接或分别独立的包装。所述标记物包括但不限于酶、荧光分子标记、荧光微球、彩色微球、胶体金、生物素或链霉亲和素中的一种或多种。

可选的实施方式中，所述试剂或试剂盒包括用于免疫检测的试剂或试剂盒。所述试剂或试剂盒包括但不限于免疫层析检测试剂或试剂盒、ELISA检测试剂或试剂盒、免疫磁微粒检测试剂或试剂盒、免疫荧光检测试剂或试剂盒或免疫印记检测试剂或试剂盒。本领域技术人员可以根据试剂或试剂盒具体的检测手段选择相应的试剂组成，本发明对此不做限制。

可选的实施方式中，所述试剂盒包括双抗夹心间接ELISA检测试剂盒。

可选的实施方式中，所述双抗夹心间接ELISA检测试剂盒包括固相抗体、与固相抗体捕获的抗原结合的检测抗体和标记的二抗，所述标记的二抗与检测抗体特异性结合；所述标记的二抗提供检测信号；其中固相抗体选自HPV33多克隆抗体；固相抗体选自上述与HPV33型衣壳蛋白L1特异性结合的抗体或其抗原结合片段；可选的实施方式中，所述固相抗体选自杂交瘤细胞株12E1分泌的单克隆抗体。

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

实施例1单克隆抗体的制备

1.小鼠免疫

HPV 33型原液分别与佐剂CFA和AD11.15混合，免疫Balb/c小鼠，第14天取小鼠尾血，使用间接ELISA方法进行尾血中抗体效价的评价。采用HPV 33型原液包被酶标板(1：100稀释)，每孔加入100μL，4℃过夜反应；使用PBS溶液洗板3次，使用5％milk-PBS在室温封闭1hr；然后使用PBS溶液洗板1次后，加入梯度稀释的小鼠尾血，室温反应1hr；然后使用PBS溶液洗板3次，拍干后，加入1:2000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠Fc二抗，室温反应1hr，PBS溶液洗板5次后，拍干，加入等体积的底物A液和B液，避光、室温条件下反应，20min；然后加入50μL终止液，混匀后在酶标仪上读取OD

2.细胞融合及单克隆筛选

处死小鼠取脾细胞分别与SP2/0细胞融合，在选择培养基中培养为单克隆细胞株后挑克隆，共挑取9个96孔板的克隆。使用HPV 33型原液包被酶标板(1：100稀释)，进行单克隆筛选，方法同上。从12个96孔板共1128个克隆中初筛共保留94个OD≥1.0的阳性克隆。将初筛阳性克隆从96孔板中扩大培养至48孔板，培养2-3天后，进行复筛，保留复筛OD≥1.0强阳性克隆34株。

3.克隆特异性筛选

对34株阳性克隆细胞上清进行特异性检测，其中8F10、11A4、11F8、12E1、13A4、13B11、13E5、14E1、16F4、18A9、19D4共11株为特异识别HPV 33的阳性克隆，检测结果见表1。方法如下：分别将HPV 6、HPV11、HPV 16、HPV 18、HPV 31、HPV 33、HPV 45、HPV 52、HPV 58共9种亚型HPV的VLP抗原稀释至1μg/mL，每孔加入100μL，4℃过夜反应；使用PBS溶液洗板3次，使用5％milk-PBS在室温封闭1hr；然后使用PBS溶液洗板1次后，加入20倍稀释后的不同克隆的杂交瘤细胞上清，室温反应1hr；然后使用PBS溶液洗板3次，拍干后，加入1:10000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠Fc二抗，室温反应1hr，PBS溶液洗板5次后，拍干，加入等体积的底物A液和B液，避光、室温条件下反应，20min；然后加入50μL终止液，混匀后在酶标仪上读取OD

表1.抗体的特异性ELISA检测(OD值*)

*所有数值均为复孔的平均值；Virus Like Particle：类似病毒样颗粒；NaN:表示OD>4.0。

4.中和活性检测

将11株特异识别HPV 33的阳性克隆的细胞上清进行中和活性检测，检测结果见表2。经假病毒中和实验验证，12E1共1株克隆的细胞上清具有较高的中和活性。方法如下：1)用DMEM完全培养基(含10％胎牛血清、1％双抗、1％L-Glu和1％G418)稀释293FT细胞并加入96孔细胞培养板中，37℃培养过夜；2)用DMEM完全培养基倍比稀释HPV33-GFP假病毒至所需浓度(每孔荧光斑点数约400)；3)用DEME完全培养基倍比稀释待检HPV33型杂交瘤细胞上清液；4)用DEME完全培养基倍比稀释商品化的HPV33型单克隆抗体；5)各取60μL稀释后的细胞上清液和假病毒进行混匀，然后放入4℃反应1小时；6)取100μL的混合液缓慢加入铺有293FT细胞的96孔细胞培养板中，37℃培养60-96小时；6)弃去细胞培养液，用ELSPOT(AID)进行读值。检测结果显示，接收到的HPV假病毒符合预期的要求，每个孔的荧光斑点数符合要求(约400个)，随着假病毒稀释倍数的提高荧光斑点数也降低，HPV33型细胞上清12E1都具有较高的中和活性，稀释1280倍后仍具有中和活性。

表2.中和活性检测

注：中和活性阳性判定：荧光斑点数值≤阳性荧光斑点数平均值/2。

5.腹水制备及抗体纯化

根据上清的亲和力、特异性、及中和活性结果选择克隆12E1进行腹水制备，取杂交瘤细胞分别接种4只Balb/c小鼠，在第10～14天收集腹水，用蛋白G纯化腹水，获得纯化抗体。

实施例2抗体灵敏度检测

根据上清的亲和力、特异性及中和活性结果选择克隆12E1进行腹水制备及抗体纯化，检测方法同实施例1中克隆特异性筛选步骤，检测抗原为HPV 33亚型的VLP抗原，抗体12E1灵敏度可达到0.0005μg/mL，见表3。

表3.抗体灵敏度检测

注：NC为阴性对照5％milk-PBS，阳性判断标准为OD值>NC值的2.1倍，NaN为超出最大检测限值。

实施例3抗体型别鉴定

用抗体亚型鉴定试剂盒对抗体12E1进行亚型鉴定，检测结果见表4。抗体12E1是IgG1亚型，轻链是κ型。

表4.抗体亚型鉴定

实施例4抗体基因测序及分析

提取12E1杂交瘤细胞株总RNA，经PrimeScriptTM 1st Strand cDNA SynthesisKit(Takara,Cat#6110A)反转录，经RT-PCR法扩增抗体VH及VL基因，克隆至pUC-19T载体，通过载体上M13通用引物进行测序，结果如下：

1.VH区-12E1(Variable Region)

(1)DNA序列:366bp

GATGTGCAGCTTCAGGAGTCGGGACCTGGCCTGGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCCCTCACCTGCACTGTCACTGGCTACTCAATCACCAGTGATTATGCCTGGAACTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAGTGGATGGGCTACATAAACTACAGTGGTTTCACTAGCTACAACCCATCTCTCAAAAGTCGAATCTCTATCACTCGAGACACATCCAAGAACCAGTTCTTCCTGCAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCCACATATTACTGTGCAAGTGGGGGGGCTACTACGGCGTACGACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ IDNO.9)。

(2)氨基酸序列：122aa

DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYINYSGFTSYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCASGGATTAYDWYFDVWGAGTTVTVSS(SEQ ID NO.7)。

VHCDR1：SDYAWN(SEQ ID NO.1)；

VHCDR2：YINYSGFTSYNPSLKS(SEQ ID NO.2)；

VHCDR3：GGATTAYDWYFDV(SEQ ID NO.3)。

2.VL区-12E1(Variable Region)

(1)DNA序列：321bp

GAAACAACTGTGACCCAGTCTCCAGCATCCCTGTCCGTGGCTACAGGAGAAAAAGTCACTATCAGATGCATAACCAGCACTGATATTGATGATGATATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGGAACCTCCTAAGCTCCTTATTTCAGAAGGCAATACTCTTCGTCCTGGAGTCCCATCCCGATTCTCCAGCAGTGGCTATGGCACAGATTTTGTTTTTACAATTGAATACACGCTCTCAGAAGATGTTGCAGATTACTACTGTTTGCAAAGTGATAACATGCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA(SEQ ID NO.10)。

(2)氨基酸序列：107aa

ETTVTQSPASLSVATGEKVTIRCITSTDIDDDMNWYQQKPGEPPKLLISEGNTLRPGVPSRFSSSGYGTDFVFTIEYTLSEDVADYYCLQSDNMPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO.8)。

VLCDR1：ITSTDIDDMN(SEQ ID NO.4)；

VLCDR2：EGNTLRP(SEQ ID NO.5)；

VLCDR3：LQSDNMPFT(SEQ ID NO.6)。

实施例5单克隆抗体的应用

双抗夹心间接ELISA方法的建立：

具体步骤如下：1)用包被液(碳酸盐缓冲液)稀释HPV33(R162)兔多抗500倍，100μL/孔，4℃，包被(碳酸盐缓冲液)，过夜；2)添加5％脱脂乳(PBS配)，200μL/孔，37℃封闭2h；3)2％脱脂乳稀释HPV33型原液(R621(33)180614P)至120μg/ml，然后3倍倍比稀释至11个梯度，100μL/孔，37℃，1h；4)用2％脱脂乳8000倍稀释对应HPV33(12E1)鼠单抗，100μL/孔，37℃，1h；5)2％脱脂乳10000倍稀释羊抗鼠lgG-HRP二抗(BIO-RAD，100μL/孔，37℃，1h；6)添加TMB显色液，100μL/ml，37℃显色10min；7)添加50μL/孔浓硫酸终止反应，酶标仪测定450nm、参比波长620nm读值，结果见表5。结果显示通过4参数曲线显示，如下抗体反应浓度条件下具有良好的线性关系，即HPV33型兔多抗和鼠单抗稀释倍数分别为500和8000，抗原起始稀释浓度120μg/ml，具体检测结果见图1，4参数曲线相关参数如表6所示。

表5.HPV33型兔多抗和鼠单抗检测抗原的OD值

注：行1为空白对照；行2和3为8000倍稀释单抗。

四参数拟合曲线公式：

表6四参数拟合曲线参数

综上，本发明通过杂交瘤技术筛选获得针对33型HPV的鼠源单克隆抗体，该抗体对HPV33 L1VLPs和假病毒具有高度的特异性和中和活性，表明该抗体是针对HPV33型衣壳蛋白L1中和表位的抗体。采用适合的中和抗体对疫苗抗原的中和表位进行鉴别和表征是疫苗行业质控和放行的重要内容，这就要求该抗体具有良好的特异性和中和活性。为了充分证明所获抗体的特异性，首先采用ELISA法进行HPV 6、HPV 31、HPV11、HPV 16、HPV 18、HPV33、HPV 45、HPV 52、HPV 58抗原的交叉反应验证，表明该抗体只与HPV33型抗原特异反应，表明其优异的特异性。为了证实该抗体的中和活性，采用假病毒中和实验进行了验证，证实该抗体的中和活性高达1280。

上述实施例中还建立了双抗夹心间接ELISA法检测HPV33 L1抗原含量的方法，HPV33 L1兔多抗包被，加入待检抗原孵育，加入杂交瘤细胞12E1分泌的单抗孵育，加入抗鼠IgG酶标复合物，进行显示检测。该方法具有良好的特异性、灵敏度、线性和准确度，可以快捷鉴别并定量HPV33 L1抗原，对疫苗有效抗原成分的含量及活性进行评价。由于所使用是检测抗体为中和性单抗，因此，该方法可以对疫苗抗原的中和表位进行很好的质控和表征，在一定程度上指征了疫苗成品的免疫原性，因此该方法具有取代动物实验评价疫苗中和活性的潜在优势，规避了动物实验导致的检测波动大、检测周期长、成本高昂的问题，也符合国际社会倡导的动物实验3R原则。该方法采用HPV33 L1兔多抗进行包板，可以最大限度地捕获待检抗原，提高灵敏度，加入待检抗原，再加入HPV33型单克隆抗体(12E1)，最后加入抗鼠IgG酶标抗体进行显色、读值。传统的双抗体夹心法需要对其中的一个单抗进行标记，尤其是应用于多价HPV疫苗时，需要对多个型别的HPV单抗分别进行标记，增大了工作量和成本，而上述实施例针对多价HPV疫苗不同价型的HPV抗原定量检测时，则采用抗鼠IgG酶标抗体为通用的显色抗体，大大提高了检测的便利性，降低了成本。。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。