一种微流控共培养芯片及基于微流控芯片的细胞迁移实时监测方法

技术领域

本发明涉及微流控芯片技术领域，具体而言，尤其涉及一种微流控芯片及基于微流控芯片的细胞迁移实时监测方法。

背景技术

恶性肿瘤是当前全球人类主要死因之一，多种恶性肿瘤会发生转移即恶性肿瘤细胞从原发部位经由血管、淋巴道等途径迁移至患者体内其他部位继续生长的这一过程，恶性肿瘤的转移也是多种癌症疗法失效的主要原因，因此研究肿瘤转移机制以及测试不同共培养条件与刺激因素对肿瘤细胞的影响对开发有效的肿瘤治疗手段意义重大，也是长期以来肿瘤研究热点领域。

目前，传统的肿瘤相关研究很大程度上依赖于以啮齿类动物方法为代表的动物方法，但这类动物方法不仅有着昂贵、复杂、不利于实时观测等缺陷，更重要的是啮齿类动物等与人类自身种属差异很大，即动物方法与人的生理相关性有十分有限，动物方法很大程度上无法忠实地模拟人体的生理病理相关特性，故相关研究受到极大限制。基于微流控芯片的共培养技术由于完全采用人源的原代细胞或细胞系，因此相较动物方法更具生理相关性，且兼具易于操作、便于观察等优势，能够直观的探究单一类型共培养体系及刺激因素的靶细胞的影响。随着微尺度加工技术的不断发展，微流控芯片体系的加工精度也在不断提高，借此研究者得以以更精细的结构探究单个细胞水平的反应，能有助于解析肿瘤相关的发生机制以及揭示可能存在的治疗手段开发方向。目前以高精度的微流控芯片在单细胞水平上研究肿瘤细胞的迁移的影响因素的相关工作于国内外现有报道。

发明内容

根据上述背景技术中提到的技术问题，而提供一种微流控芯片及基于微流控芯片的细胞迁移实时监测方法。本发明采用的技术手段如下：

一种微流控共培养芯片，包括：两条等大的左右平行排列的主通道I和主通道II；

所述主通道间设置有多条等间隔排列的完全一致的微通道连接；所述微通道与所述主通道垂直；

在主通道I的两端设置有孔I和孔II，主通道II的两端设置有孔III和孔IV，所述孔I和所述孔II作为向主通道内灌注细胞和培养基的进样口，所述孔III和孔IV作为向主通道内灌注细胞和培养基的出口。

所述主通道I和所述主通道II通过若干微通道分隔开阻止接种时细胞自由扩散穿越微通道，但允许贴壁细胞主动迁移穿越微通道。

本发明还包含一种基于微流控芯片的细胞迁移实时监测方法，其特征在于，包括以下步骤；

步骤1：构建芯片模板；根据实验需求，确定芯片整体尺寸、微通道阵列的长度和数量，构建芯片模板；

步骤2：制作芯片模板；通过光刻法使用SU-8光刻胶在硅片基材上制作所述芯片模板；

步骤3：通过PDMS制作芯片；裁剪PDMS芯片为合适尺寸使其能够适应实验体系放入合适的孔板或平皿中，将所述芯片扣在盖玻片上，按压挤出存在的气泡，将结合了玻片的芯片放入准备好的孔板或平皿内；

步骤4：在所述步骤3中获取的所述芯片的主通道接种待测细胞；所述待测细胞贴壁生长后，在对侧主通道接种不与所述待测细胞直接接触的共培养细胞或在同一主通道中接种直接接触的共培养细胞；

步骤5：待接种在所述芯片上的细胞贴壁生长至近微通道处细胞达80％以上细胞密度后，开始在显微镜下观察细胞通过连通主通道的微通道的迁移情况，具体方法可采用在连接有成像系统的显微镜上通过实时成像记录若干条微通道中每一个迁移中的细胞位置，通过对细胞位置的实时记录，测量出一定时间内细胞迁移距离，据此定量计算细胞迁移速度，并可监测细胞迁移速率的变化情况。

较现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明提供的基于微流控芯片的细胞迁移实时监测新技术，可采用生物学上常用的手段对分布于两侧主通道以及在主通道间微通道内迁移的细胞进行检测，包括光学显微镜直接成像观察、细胞免疫染色，细胞死活染色、基因表达检测、蛋白质检测等。可以直接观察细胞形态、迁移及共培养条件下发生的改变，可以通过生化手段检测基因、蛋白水平的差异。本方法利用微流控芯片技术，以具有良好生物相容性且透光性理想的的PDMS作为微流控芯片材质，利用高精度的软光刻技术制作了具有高精度的芯片结构，对处于微通道中的单个细胞可以实时成像追踪观察，可以用于对多种肿瘤细胞等待测细胞对共培养细胞或其他刺激因素响应的检测，探究不同类型细胞及刺激因素可能对肿瘤转移等细胞迁移行为的影响。该芯片操作简便，功能完备，兼容分子生物学的各项信号及指标检测，如细胞蛋白表达、细胞因子分泌、细胞增殖及细胞活性检测等等。

该微流控芯片由具有微流控芯片结构的PDMS芯片及作为基底的盖玻片组成，PDMS芯片包含两条平行主通道、联通两条主通道的15-30条微通道及主通道两端的进样口。PDMS芯片与盖玻片利用静电引力贴合在一起或通过氧等离子体处理使其形成硅-氧键合封接在一起。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图做以简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明微流控芯片整体结构示意图；

图2为本发明在芯片上培养U251细胞24h后，在光学显微镜下观察到细胞主动迁移进入微通道中示意图。比例尺为100μm。

图中，1为主通道I；2为主通道II；3为联通主通道的若干微通道；4为向主通道I内灌注细胞和培养基的进样口；5为向主通道II内灌注细胞和培养基的进样口；6为向主通道I内灌注的细胞和培养基的出口；7为向主通道II内灌注的细胞和培养基的出口。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

如图1-2所示，本发明提供了一种微流控共培养芯片，包括：两条等大的左右平行排列的主通道I和主通道II；所述主通道间设置有多条等间隔排列的完全一致的微通道连接；所述微通道与所述主通道垂直；在主通道I的两端设置有孔I和孔II，主通道II的两端设置有孔III和孔IV，所述孔I和所述孔II作为向主通道内灌注细胞和培养基的进样口，所述孔III和孔IV作为向主通道内灌注细胞和培养基的出口。

所述主通道I和所述主通道II通过若干微通道分隔开阻止接种时细胞自由扩散穿越微通道，但允许贴壁细胞主动迁移穿越微通道。分隔开两条主通道的若干微通道的横截面足够狭小，在接种细胞时进入主通道的细胞无法通过自由扩散进入微通道内乃至进入对侧主通道中。细胞贴壁后，主动迁移的细胞可通过主动的形变使自身得以进入微通道中并进一步主动迁移到对侧主通道中。

作为一种优选的实施方式，在本申请中，任意一条所述主通道接种有迁移能力待测的靶细胞，与待测靶细胞直接接触的共培养细胞可接种于与靶细胞同侧的主通道中；不直接接触靶细胞的共培养细胞接种于与待测靶细胞对侧主通道中；非细胞刺激因素根据直接实验需要选择所加主通道，对直接促进或抑制靶细胞生理活动的刺激因素可加入与靶细胞同侧主通道中，对影响靶细胞生理活动的趋化因素可加入靶细胞对侧主通道中。

作为优选的实施方式，所述微流控共培养芯片为PDMS材质；将PDMS材质芯片直接扣在玻璃盖玻片上以静电引力使其贴合，也可将PDMS芯片与玻璃盖玻片同时进行氧等离子体处理后将芯片与玻片封接，通过形成硅-氧键使PDMS芯片与玻片结合为起来。

本发明还包含一种基于微流控芯片的细胞迁移实时监测方法，包括以下步骤；

步骤1：构建芯片模板；根据实验需求，确定芯片整体尺寸、微通道阵列的长度和数量(以适应实验体系、细胞迁移能力等)，构建芯片模板；

步骤2：制作芯片模板；通过光刻法使用SU-8光刻胶在硅片基材上制作所述芯片模板；

步骤3：通过PDMS制作芯片；裁剪PDMS芯片为合适尺寸使其能够适应实验体系放入合适的孔板或平皿中，将所述芯片扣在盖玻片上，按压挤出存在的气泡，将结合了玻片的芯片放入准备好的孔板或平皿内；

步骤4：在所述步骤3中获取的所述芯片的主通道接种待测细胞；所述待测细胞贴壁生长后，在对侧主通道接种不与所述待测细胞直接接触的共培养细胞或在同一主通道中接种直接接触的共培养细胞；

步骤5：待接种在所述芯片上的细胞贴壁生长至近微通道处细胞达80％以上细胞密度后，开始在显微镜下观察细胞通过连通主通道的微通道的迁移情况，具体方法可采用在连接有成像系统的显微镜上通过实时成像记录若干条微通道中每一个迁移中的细胞位置，通过对细胞位置的实时记录，测量出一定时间内细胞迁移距离，据此定量计算细胞迁移速度，并可监测细胞迁移速率的变化情况。

优选地，在待测细胞密度达到80％后，在连接有成像系统的显微镜上观察所述芯片，通过实时成像记录若干条微通道中每一个迁移中的细胞位置，通过对细胞位置的实时记录，测量出一定时间内细胞迁移距离，进一步定量计算出该时间段内细胞迁移速率，并可监测细胞迁移速率的变化情况，从而实现对待测细胞迁移能力的实时监测。本发明方法基于微流控共培养芯片，该芯片可模拟构建多种细胞以接触或非接触式的方法共培养体系，并构建适当细胞生长微环境，检测不同类型的细胞共培养条件及刺激因素对细胞迁移能力的影响，能用于探究肿瘤细胞的转移趋势以及影响因素。细胞包含待测试迁移能力的靶细胞，以及根据需要加入的共培养细胞。

实施例1

通过本申请所述的微流控芯片，构型如图1。该微流控芯PDMS芯片与作为底部的盖玻片结合而成，包括：1主通道I，2主通道II，3联通主通道的若干微通道，4向主通道I内灌注细胞和培养基的进样口，5向主通道II内灌注细胞和培养基的进样口，6向主通道I内灌注的细胞和培养基的出口，7向主通道II内灌注的细胞和培养基的出口。

本发明提供的微流控芯片，所述主通道高度为150-250μm，微通道高度为5-10μm。

实施例2

一种基于微流控芯片的细胞迁移实时监测新技术，采用上述微流控芯片，按照以下步骤进行：消化U251人胶质瘤细胞，细胞悬液的细胞密度调整为2×10^6个/mL，取25μL细胞悬液由微流控芯片主通道1的进样口加入主通道1中，芯片置于培养皿内放入37℃培养箱中培养3h后U251细胞贴壁，在芯片主通道1和主通道2中各补加50μL培养基，置于37℃培养箱中培养24h，在显微镜下观察微通道中细胞迁移状态，成像实时记录细胞位置，如图2所示，连接主通道的大部分微通道中均有U251细胞主动迁移进入，在多个时间点对芯片进行成像观察，记录细胞位置，计算细胞迁移速率。

上述本发明实施例序号仅仅为了描述，不代表实施例的优劣。在本发明的上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述的部分，可以参见其他实施例的相关描述。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。