乳杆菌菌株的组合及其在动物健康中的用途

技术领域

本发明描述了乳杆菌(或乳酸菌)即罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)菌株和唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)菌株的组合，及其用于预防和/或治疗动物特别是鸡的坏死性肠炎的用途。

背景技术

2017年，世界肉类产量增长1.25％，达到3.23亿公吨(MT)，预计到2027年将进一步增长近15％(经济合作与发展组织(OECD)/粮食及农业组织(FAO)，2018)。肉类产品需求的增长主要是由于发展中国家的人口增长、城市化和收入增加。

家禽肉生产代表肉类产品行业的主要部门。

“家禽”被理解为是指属于鹑鸡类或掌足类的家养鸟类，它们被饲养以获取它们的肉、蛋和羽毛。术语“家禽”涵盖范围广泛的鸟类，从本土和商业母鸡品种到番鸭、绿头鸭、火鸡、珍珠鸡、鹅、鹌鹑、鸽子、鸵鸟或雉鸡。消耗最多的家禽肉是鸡肉。

家禽肉主要是在规模化集约化动物养殖的背景下生产的。世界家禽业已成为一个产生巨额利润的部门，其成功与动物的健康密切相关，更准确地说，与它们健康的胃肠道密切相关，健康的胃肠道确保了给予家禽的饲料的有效吸收。

事实上，禽类疾病，即影响鸟类的疾病，由于高死亡率和低饲料效率，会造成重大经济损失。这些感染可能是细菌、真菌、病毒或寄生虫引起的。因此，鸟类最常见的细菌感染是由于大肠杆菌、沙门氏菌属(Salmonellaspp)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、鸟分枝杆菌(Mycobacteriumavium)、鸡毒支原体(Mycoplasmagallisepticum)、滑液囊支原体(Mycoplasmasynoviae)、火鸡支原体(Mycoplasmameleagridis)、衣阿华支原体(Mycoplasmaiowae)、索氏梭菌(Clostridiumsordellii)或败血症梭菌(Clostridiumsepticum)。这些菌株引起多种疾病，例如家禽的慢性呼吸道疾病、禽霍乱、坏疽性皮炎、坏死性肠炎或禽结核病。

大肠杆菌和梭菌属的细菌是家禽肠道疾病最重要的病原体之一。

梭菌属的细菌(或梭状芽胞杆菌)是产生内生孢子的革兰氏阳性厌氧杆菌。它们无处不在，也就是说它们可以在环境和动物的胃肠道中存在。应该注意的是，这些细菌大部分是非致病性的。这些细菌中有许多被广泛用于工业发酵，例如，用于醋酸盐、丁酸盐、乳酸盐、乙醇、二氧化碳或溶剂等化合物的合成。

尽管如此，梭菌属(C.)的某些细菌以其致病力而闻名。他们特别是肉毒梭菌(C.botulinum)、破伤风梭菌(C.tetani)、艰难梭菌(C.difficile)、产气荚膜梭菌(C.perfringens)、诺维梭菌(C.novyi)和败血症梭菌(C.septicum)。梭菌引起多种疾病，包括由肠梭菌(C.colinum)引起的溃疡性肠炎或由产气荚膜梭菌引起的坏死性肠炎。

坏死性肠炎或坏死化肠炎是一种影响世界所有家禽区动物养殖场的疾病。这种病变在肉鸡中更为常见，但蛋鸡和火鸡也会受到影响。

产气荚膜梭菌引起这种病变的能力取决于某些会导致肠细胞降解的细胞外毒素和酶的产生，例如卵磷脂酶或坏死毒素。

例如，产气荚膜梭菌产生和分泌alpha-毒素(α-毒素)，一种引起溶血和组织坏死的卵磷脂酶；或β-毒素(或B样坏死性肠炎毒素或NetB)，其导致肠细胞膜中内生孢子的形成。

细菌产气荚膜梭菌天然存在于肠道中。作为一种机会性细菌，它需要破坏肠道平衡才能定植、增殖和表达其毒素，从而引起坏死性肠炎。研究显著表明，单纯的仅被产气荚膜梭菌感染不足以诱发病变。坏死性肠炎的触发需要存在被称为诱发因素的条件，所述诱发因素例如球虫病，一种由艾美球虫属(Eimeriaspp)寄生虫引起的疾病、饲料或动物的免疫抑制或应激。

坏死性肠炎对养殖动物的饲料转化率有负面影响，也就是说，动物必须消耗更多的饲料才能获得相同的增重。这种类型的坏死性肠炎成为问题，因为它对生产力和盈利能力有负面影响，导致动物体型和体重下降。

能够检测坏死性肠炎的最常见病征是动物出现嗜睡、情绪低落和食欲不振、腹泻、脱水或食欲不振。鸡通常在症状出现后1至2小时内死亡。与坏死性肠炎相关的死亡率通常在2％到10％之间，但有时可达50％。这种病症的特征在于牲畜死亡率突然增加，鸟类通常在没有先兆的情况下死亡。

因此，坏死性肠炎每年在世界范围内造成巨大的经济损失，2015年估计超过60亿美元。这些损失归因于疾病控制措施的成本以及动物养殖场中与动物体重和死亡率相关的产量下降。

这就是为什么在养殖动物中必须采取坏死性肠炎预防和/或治疗策略。

对抗坏死性肠炎的方法之一是预防，因为如上所述，感染后，疾病的发展非常迅速并且死亡率高。

施用低浓度抗生素，即施用生长促进剂(或AGP,即抗生素生长促进剂)如阿伏霉素、杆菌肽和维吉尼亚霉素，对预防和控制坏死性肠炎非常有效。这些AGP促进动物的生长并提高饲料转化效率。应该注意的是，这些化合物也以更高的浓度用于人类医学。

然而，这些抗生素的滥用，特别是在人类和兽医医学中的滥用，造成了选择性压力，这加速了耐药细菌的进化和繁殖。因此，它们被禁止作为AGP使用，并且仅保留在人类医学中，尤其是在欧洲。

在限制使用AGP之后，开发了预防和/或治疗坏死性肠炎的替代方案，例如使用NetB毒素，或接种艾美球虫(一种单细胞寄生虫)，以减少被认为是坏死性肠炎的重要诱发因素的球虫病的流行。

然而，为了克服与在动物饲料中禁止抗生素相关的死亡率和发病率的增加，仍然存在开发在预防和/或治疗坏死性肠炎方面具有与用抗生素获得的性能相似的性能的替代品的明显需要。

由于其特性，乳酸菌在农业食品工业中被广泛用作生物食品防腐剂或在工业化动物养殖场中用于预防传染病和人畜共患疾病。这些细菌还用于通过产生参与增加营养物质的消化率和提高饲料转化率的消化酶、挥发性脂肪酸和/或维生素来提高动物农场的效能。这些乳酸菌特别地以益生菌的名称出现。

因此，使用抗生素或AGP的替代方法在于给予动物饲料添加剂或产品，特别是益生菌。

一般来说，益生菌被定义为活的微生物，其当以足够的浓度食用时对宿主的健康有益。它们可以与宿主相互作用以提高免疫力、肠道稳态，刺激新陈代谢或降低机会性病原体感染的风险。

某些益生菌干扰甚至消灭致病微生物剂的致病性，例如，通过消除或抑制肠腔中致病菌的生长。这些益生菌中的一些产生能够与病原体竞争营养、生长因子和肠上皮结合位点的抗菌物质。它们还可以通过调节宿主的免疫反应来发挥免疫功能，从而使宿主能够更好地抵抗感染。

大多数益生菌属于乳酸菌。这组细菌的主要特征之一是它们能够通过葡萄糖的同型或异型发酵以菌株依赖性方式产生乳酸。

乳酸菌属于厚壁菌(Firmicutes)门的芽孢杆菌(Bacilli)纲和乳杆菌(Lactobacillales)目.称为乳酸菌的分类单元将G+C百分比小于50％的革兰氏阳性的、不形成孢子的、兼性厌氧或好氧的球菌、杆菌或球杆菌归为一组。这些细菌是嗜酸菌，其最佳生长pH值在3.5和6.5之间。大多数菌株都有营养需求且需要丰富的培养基才能发育。该组包括10个属，最著名的是乳杆菌属(Lactobacillus)、片球菌属(Pediococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)和肉杆菌属(Carnobacterium)。

在乳酸菌中，最具代表性的属是乳杆菌属(Lb.)，迄今已描述超过253个物种(http://www.bacterio.net/lactobacillus.html)。

乳杆菌被广泛用于益生菌的生产，特别是因为它们在胃肠道遇到的极端条件下存活的能力、它们良好的与肠道细胞粘附的能力，这可以增加益生菌在肠道中的保留、消除或抑制肠腔中致病菌生长的特性。

文献EP2287286特别描述了乳杆菌的分离株(清酒乳杆菌(Lb.sakei)或者罗伊氏乳杆菌(Lb.reuteri))具有抗炎和益生菌特性。

文献CN105861399还描述了特定的植物乳杆菌(Lb.plantarum)菌株通过抑制产气荚膜梭菌的生长用于预防养殖鸡的坏死性肠炎的用途。

文献WO2006/133472描述了5种抑制产气荚膜梭菌的微生物的复杂混合物，其由屎肠球菌(E.faecium)DSM16211、罗伊氏乳杆菌DSM16350、唾液乳杆菌DSM16351、嗜酸片球菌(P.acidilactici)DSM16210和动物双歧杆菌(B.animalis)DSM16284组成。该文献详述了罗伊氏乳杆菌和唾液乳杆菌的这些特定菌株与产气荚膜梭菌相比更有效地抑制大肠杆菌。

文献WO2016/170280建议使用多形拟杆菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)，其可能与罗伊氏乳杆菌和/或唾液乳杆菌结合，特别是用于治疗肠炎。KLOSE等人(VeterinaryMicrobiology,2010,144(3-4):515-21)评估了不同肠道细菌，包括罗伊氏乳杆菌和唾液乳杆菌，对产气荚膜梭菌的拮抗活性，报告了所述物种之间的巨大异质性。

REN等人(Microorganisms,2019,7(12):684)报道了益生菌(敏捷乳杆菌(L.agilis)或唾液乳杆菌)和植物生素对幼龄养殖鸡的肠道微生物群的协同作用。

然而，出于健康和经济原因，鉴于对抗导致肉鸡坏死性肠炎的产气荚膜梭菌，存在开发新的有效解决方案的明显需要，所述方案具有简单的配方并包含最少的活性物质。

发明内容

定义

下面的定义对应于在本发明的背景中通常使用的含义并且应该被考虑在内，除非明确指出另一个定义。

在本发明的意义上，冠词“一个(a)”和“一种(an)”用于指冠词的语法对象的一个或多个(例如，至少一个)单元。例如，“一个元素”指的是至少一个元素，也就是说一个或多个元素。

与可测量值(例如数量、持续时间和其他类似值)相关的术语“大约”或“大约”必须理解为包括规定值的±20％或±10％、优选±5％、甚至更优选±1％并且特别优选±0.1％的测量不确定性。

区间：在整个本说明书中，本发明的不同特征可以以值的区间的形式呈现。应当理解，以区间形式描述数值只是为了便于阅读，不应理解为对本发明范围的严格限制。因此，对值的区间的描述应被视为是具体公开所有可能的中间区间以及该区间内的每个值。例如，应该将从1至6的区间的描述视为具体描述了它包括的每个区间，例如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及该区间内的每个值，例如1；2；2.7；3；4；5；5.3和6。该定义独立于区间范围而有效。

在本发明的背景中，术语“分离的”应理解为与从其环境或自然状态中移除或提取的同义。例如，分离的细菌菌株或肽是从通常发现它的自然环境中，例如，无论是从植物还是活体动物中提取的细菌菌株或肽。因此，天然存在于活体动物中的细菌菌株或肽不是本发明意义上的分离的细菌菌株或肽，而部分或完全独立于其自然背景中存在的其他元素的相同的细菌菌株或肽在本发明的意义上本身是“分离的”。分离的细菌菌株或肽可以以基本上纯化的形式存在或存在于非天然环境例如宿主细胞中。

令人惊讶地，申请人确认了一种特定的新型乳酸菌组合，其用于对抗坏死性肠炎，特别是在家养动物如鸡中。

因此，根据第一个方面，本发明涉及一种微生物混合物，其包含罗伊氏乳杆菌和唾液乳杆菌。

在本发明的意义上，“混合物”用于表示至少2种不同微生物物种的组合，有利地至少2种不同的细菌菌株，甚至更有利地至少2种不同的乳酸菌菌株(乳杆菌或乳杆菌属)。

因此，根据本发明的微生物混合物可以包含一种或多种罗伊氏乳杆菌菌株和一种或多种唾液乳杆菌菌株，和可能地其他微生物，特别是其他细菌。

根据另一个方面，本发明涉及一种乳酸菌混合物，其由至少一种罗伊氏乳杆菌菌株和至少一种唾液乳杆菌菌株组成。根据一个特定的实施方案，所述乳酸菌混合物由一种罗伊氏乳杆菌菌株和至少一种唾液乳杆菌菌株(可能两种唾液乳杆菌菌株)组成。根据另一个实施方案，所述乳酸菌的混合物由一种罗伊氏乳杆菌菌株和一种唾液乳杆菌菌株组成。

如本申请所示，根据本发明的特定混合物能够减少或抑制细菌产气荚膜梭菌的生长和/或活性。

在本发明的意义上，“细菌产气荚膜梭菌的生长”用于表示导致细菌干生物量增加的一组机制。这涉及细菌细胞在大小、重量和/或体积方面的生长，以及由细胞分裂导致的种群生长。

在本发明的意义上，“细菌产气荚膜梭菌的活性”用于表示该细菌的致病活性或致毒活性。这尤其涉及毒素(如NetB和α毒素)或酶的产生或分泌。这也可能涉及产气荚膜梭菌粘附于胃肠道或甚至定植于胃肠道的能力。

有利地，根据本发明的混合物能够减少或甚至抑制毒素NetB和α-毒素的产生和/或分泌。

根据一个特定的实施方案，根据本发明所述的混合物包含于2020年3月4日以编号I-5500保藏在CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes[国家微生物菌种保藏中心],Institut Pasteur[巴斯德研究所],25rue du Docteur Roux,75724Paris Cedex 15)的罗伊氏乳杆菌菌株。

根据另一个特定的实施方案，根据本发明所述的混合物包含于2020年3月4日以编号I-5501保藏在CNCM(国家微生物菌种保藏中心巴斯德研究所,25rue du Docteur Roux,75724Paris Cedex 15)的唾液乳杆菌菌株和/或于2020年3月4日以编号I-5502保藏在CNCM的唾液乳杆菌菌株。

根据一个具体实施方案，根据本发明所述的微生物混合物包含以下或由以下组成：

-罗伊氏乳杆菌菌株和唾液乳杆菌菌株，所述罗伊氏乳杆菌菌株是于2020年3月4日以编号I-5500保藏在CNCM(国家微生物菌种保藏中心巴斯德研究所,25rue du DocteurRoux,75724Paris Cedex 15)的菌株；或

-罗伊氏乳杆菌菌株和唾液乳杆菌菌株，所述唾液乳杆菌菌株是于2020年3月4日以编号I-5501保藏在CNCM(国家微生物菌种保藏中心巴斯德研究所,25rue du DocteurRoux,75724Paris Cedex 15)的菌株；和/或于2020年3月4日以编号I-5502保藏在CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes,Institut Pasteur,25ruedu Docteur Roux,75724Paris Cedex 15)的菌株；或

-于2020年3月4日以编号I-5500保藏在CNCM(国家微生物菌种保藏中心巴斯德研究所,25rue du Docteur Roux,75724Paris Cedex 15)的罗伊氏乳杆菌菌株和于2020年3月4日以编号I-5501保藏在CNCM(国家微生物菌种保藏中心巴斯德研究所,25rue duDocteur Roux,75724Paris Cedex 15)的唾液乳杆菌菌株和/或于2020年3月4日以编号I-5502保藏在CNCM(国家微生物菌种保藏中心巴斯德研究所,25rue du Docteur Roux,75724Paris Cedex 15)的唾液乳杆菌菌株。

根据不同的实施方案，根据本发明所述的混合物包含以下或由以下组成：

-于2020年3月4日以编号I-5500保藏在CNCM(国家微生物菌种保藏中心巴斯德研究所,25rue du Docteur Roux,75724Paris Cedex 15)的罗伊氏乳杆菌菌株和于2020年3月4日以编号I-5501保藏在CNCM(国家微生物菌种保藏中心巴斯德研究所,25rue duDocteur Roux,75724Paris Cedex 15)的唾液乳杆菌菌株；或

-于2020年3月4日以编号I-5500保藏在CNCM(国家微生物菌种保藏中心巴斯德研究所,25rue du Docteur Roux,75724Paris Cedex 15)的罗伊氏乳杆菌菌株和于2020年3月4日以编号I-5502保藏在CNCM(国家微生物菌种保藏中心巴斯德研究所,25rue duDocteur Roux,75724Paris Cedex 15)的唾液乳杆菌菌株；或

-于2020年3月4日以编号I-5500保藏在CNCM(国家微生物菌种保藏中心巴斯德研究所,25rue du Docteur Roux,75724Paris Cedex 15)的罗伊氏乳杆菌菌株、于2020年3月4日以编号I-5501保藏在CNCM(国家微生物菌种保藏中心巴斯德研究所,25rue du DocteurRoux,75724Paris Cedex 15)的唾液乳杆菌菌株和于2020年3月4日以编号I-5502保藏在CNCM(国家微生物菌种保藏中心巴斯德研究所,25rue du Docteur Roux,75724ParisCedex 15)的唾液乳杆菌菌株。

根据一个特定的实施方案，所述混合物含有其他微生物，有利地是其他益生菌。优选地，所述混合物含有选自以下的其他微生物：乳杆菌属细菌、双歧杆菌属细菌、链球菌属细菌、肠球菌属细菌、片球菌属细菌、芽孢杆菌属细菌、酵母及其组合。

优选地，所述乳杆菌属细菌选自由以下组成的组：嗜酸乳杆菌、乳酸乳杆菌(Lb.lactis)、瑞士乳杆菌(Lb.helveticus)、短乳杆菌(Lb.brevis)、干酪乳杆菌(Lb.casei)、植物乳杆菌、唾液乳杆菌(有利地另一种唾液乳杆菌)、罗伊氏乳杆菌(有利地另一种罗伊氏乳杆菌)、双歧乳杆菌(Lb.bifidus)、保加利亚乳杆菌(Lb.bulgaricus)、高加索乳杆菌(Lb.caucasicus)、鼠李糖乳杆菌(Lb.rhamnosus)、格氏乳杆菌(Lb.gasseri)、清酒乳杆菌、发酵乳杆菌(Lb.fermentum)菌株，及其组合。

优选地，所述双歧杆菌属细菌选自由以下组成的组：两歧双歧杆菌(B.bifidum)、长双歧杆菌(B.longum)、婴儿双歧杆菌(B.infantis)、短双岐杆菌(B.breve)、青春双歧杆菌(B.adolescentis)、动物双歧杆菌(B.animalis)、乳酸双岐杆菌(B.lactis)，及其组合。

优选地，所述链球菌属细菌选自由以下组成的组：嗜热链球菌(S.thermophilus)、乳酸链球菌(S.lactis)、乳脂链球菌(S.cremoris)、二乙酰链球菌(S.diacetylcatis)，及其组合。

优选地，所述肠球菌属细菌选自由以下组成的组：屎肠球菌(E.faecium)、粪肠球菌(E.faecalis)，及其组合。

优选地，所述片球菌属细菌是嗜酸片球菌。

优选地，所述芽孢杆菌属细菌选自由以下组成的组：枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、贝莱斯芽胞杆菌(B.velezensis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)，及其组合。

优选地，所述酵母选自由以下组成的组：乳酒假丝酵母(Candida Kefyr)、弗氏酵母(Saccharomyces florentinus)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、酿酒酵母布拉迪(Saccharomyces cerevisiae var.boulardii)，及其组合。

根据另一个方面，本发明涉及包含如上所定义的微生物混合物的组合物。

此外，根据本发明所述的组合物可以包含在相关领域中使用的常用佐剂或赋形剂，例如亲水性或亲脂性增稠剂或胶凝剂、增味剂、亲水性或亲脂性添加剂、防腐剂、抗氧化剂、稀释剂、维生素、矿物质、混悬剂、纤维素衍生物、吸收剂、冷冻保护剂或染料。

自然地，本领域技术人员将确保选择这种佐剂或赋形剂或这些佐剂或赋形剂并以使得所考虑的添加不改变或基本上不改变本发明的组合物的有利性质的方式调整其量。

根据一个实施方案，根据本发明的组合物包含可用作支持物的营养物质和/或益生元物质,其有利地选自低聚果糖、菊糖、低聚异麦芽糖、乳糖醇、乳蔗糖、乳果糖、焦糊精、大豆低聚糖、转半乳低聚糖、低聚木糖、维生素，尤其是维生素E。

根据另一个实施方案，根据本发明所述的组合物包含至少一种选自以下组的化合物：沸石、碳酸钙、硫酸钙、碳酸镁、滑石粉、海藻糖、壳聚糖、虫胶、白蛋白、淀粉、脱脂乳粉、乳清、乳清粉、麦芽糖糊精、乳糖、菊糖、葡萄糖、纤维素、粘土包括海泡石、酵母和谷物衍生物、植物油或选自水或生理盐水溶液的溶剂。

根据一个具体实施方案，根据本发明所述的组合物包含包衣材料，其有利地选自麦芽糖糊精、瓜尔豆籽粉、阿拉伯树胶、藻酸盐、改性淀粉和淀粉衍生物、糊精、纤维素衍生物如纤维素酯和纤维素醚、蛋白质例如如明胶、白蛋白、酪蛋白、谷蛋白、阿拉伯树胶、黄芪胶、脂类如蜡、石蜡、硬脂酸、甘油单酯和甘油二酯。

根据本发明所述的混合物或组合物可以是粉末、胶囊、喷雾剂、溶液、乳液、悬浮液或分散液的形式。

有利地，根据本发明所述的混合物或组合物是干燥或液体形式，特别是冻干、干燥、压制、液体或深度冷冻形式，有利地是冻干形式。

根据一个优选的实施方案，根据本发明所述的混合物或组合物旨在口服施用。为此目的，所述混合物或组合物可以是不同的合适的盖仑制剂形式，例如，待倒入并溶解在饮水中的冻干物形式、待倒在饲料上或倒到饮用水中的液体形式、片剂、包装在胶囊中的粉末或任何其他合适的形式。有利地，它是倒入并溶解在动物的饮用水中的粉末或冻干物。

根据一个特定的实施方案，根据本发明的混合物或组合物包含最终浓度为10

该浓度可以理解为存在于所述混合物或组合物中、有利地存在于动物的饮用水中的每种微生物，有利地是每种细菌，甚至更有利地是每种乳杆菌的浓度。优选地，它是存在于混合物或组合物中的所有微生物，有利地是所有细菌，甚至更有利地是所有乳杆菌的浓度。因此，作为实例，对于最终浓度为10

根据另一方面，本发明涉及根据本发明所述的混合物或组合物作为动物的添加剂或饲料产品的用途。

在本发明的意义上，“添加剂或饲料产品”用于表示旨在补充传统饲料膳食并包括营养物或具有营养或生理作用的其他物质的组合物。如前所述，它可以是饮用水或饲料的添加剂，所述饲料例如谷物和/或豆类，例如大豆。按照惯例，术语“饮水”用于液体形式的摄入产品，而术语“饲料”用于固体形式的摄入产品。

根据本发明所述的混合物或组合物可以临时添加到饮水或饲料中，或者它可以特别地在它们生产时被引入饲料中，例如通过混合或包衣。

根据一个特定的实施方案，将根据本发明所述的混合物或组合物添加到饮水或饲料中，添加方式为使得乳杆菌代表10

根据另一个方面，本发明涉及如上所述的混合物或组合物以及含有它们的饮水和饲料用于对抗动物的坏死性肠炎的用途，即用于预防和/或治疗这种病变。

以已知的方式并如示例中所述，可以通过确定动物的肠道损伤评分来评估抗坏死性肠炎的功效：

-评分0对应于健康的肠道；

-评分1对应于薄而易碎的肠道；

-评分2对应于具有小尺寸坏死点外观的薄而易碎的肠道；和

-评分3对应于具有透过肠道外壁可见的大损伤的肠道。

也可以通过监测动物的体重来评估坏死性肠炎的预防和/或治疗。如上所述，肠道损伤会降低饲料的转化率，从而导致动物体重减轻。

根据一个优选的实施方案，本发明涉及的动物是家禽动物，有利地是鸡，优选地是肉鸡(或养殖鸡)。

如前所述并且优选地，根据本发明所述的混合物或组合物，可能是掺入饮水或饲料中的混合物或组合物，经口服施用或摄入。

摄入可以是所有动物从出生开始的系统性摄入，也可以在动物养殖场出现症状或死亡时决定。有利地，预防性地进行治疗，也就是说在任何症状出现之前，从动物出生几天或几天之后。甚至更有利的是，治疗一直持续到动物死亡，这对于家禽通常发生在40天之后。

此外，所述摄入可以每日一次，或者甚至每次摄取饮水或饲料时摄入，或者可以间隔几日。有利地，每日摄入。

优选的剂量对应于在动物的整个生命期间以饲料补充剂的形式以10

根据另一个方面，本发明涉及下面列出的乳杆菌菌株，其由于它们对产气荚膜梭菌的生长和/或活性的抑制活性而引起人们的兴趣：

-于2020年3月4日以编号I-5500保藏在CNCM(国家微生物菌种保藏中心巴斯德研究所,25rue du Docteur Roux,75724Paris Cedex 15)的罗伊氏乳杆菌菌株；

-于2020年3月4日以编号I-5501保藏在CNCM(国家微生物菌种保藏中心巴斯德研究所,25rue du Docteur Roux,75724Paris Cedex 15)的唾液乳杆菌菌株；

-于2020年3月4日以编号I-5502保藏在CNCM(国家微生物菌种保藏中心巴斯德研究所,25rue du Docteur Roux,75724Paris Cedex 15)的唾液乳杆菌菌株。

附图说明

基于附图，实施本发明的方式和从中获得的优点将从以下为提供信息且以非限制性方式给出的实施例示例中变得明显。

图1表示根据本发明所述的细菌混合物在鸡体重方面的功效。字母(a、b、c)表示统计上显著的差异。

图2表示根据本发明所述的细菌混合物在鸡的损伤评分方面的功效。字母(a、b、c)表示统计上显著的差异。

具体实施方式

根据本发明所述的细菌混合物对抗坏死性肠炎的作用的证明

使用于2020年3月4日以编号I-5500保藏在CNCM(国家微生物菌种保藏中心巴斯德研究所,25rue du Docteur Roux,75724Paris Cedex 15)的罗伊氏乳杆菌菌株和于2020年3月4日以编号I-5501保藏在CNCM(国家微生物菌种保藏中心巴斯德研究所,25rue duDocteur Roux,75724Paris Cedex 15)的唾液乳杆菌菌株进行试验。

实施例中使用的产气荚膜梭菌菌株是从患有坏死性肠炎的鸡中分离出来的产气荚膜梭菌菌株。

1/材料和方法：

在来自Cobb500(雌性)品种和HubbardM99(雄性)品种杂交的肉鸡上，体内评估了根据本发明所述的罗伊氏乳杆菌和唾液乳杆菌的组合预防坏死性肠炎的能力。

体内实验在150只鸡(每种实验条件下30只)上进行了17天。测试从孵化当天开始。在测试期间，在第1天和第2天，然后从第10天到第13天，每天一次通过强制饲喂将乳杆菌单独施用(罗伊氏乳杆菌、唾液乳杆菌)或组合施用(罗伊氏乳杆菌+唾液乳杆菌)。

1-1/鸡的环境和饮食

鸡在笼子里饲养，每只鸡的平均表面积为432cm

前9天的饲料以玉米和大豆为主。第10天后，生长饮食包括小麦(表1和2)。这两种饮食以酱泥形式提供。

表1按成分示出了饮食组成(g/100g)

表2代表饮食的近似组成(g/100g)

1-2/疫苗接种

除了未受感染的组(未接受任何产气荚膜梭菌施用)外，鸡在第1天接种Advent@9X。该疫苗含有活的堆型艾美耳球虫(Eimeria acervulina)、巨型艾美耳球虫(E.maxima)和柔嫩艾美尔球虫(E.tenell)卵囊、作为防腐剂的庆大霉素和两性霉素B。目的是帮助预防由这些病原体引起的禽球虫病。在第9天，将鸡用含有活病毒的疫苗Intervet，BursalVac-G603眼内接种以对抗禽传染性滑囊炎。

1-3/不同批次的治疗

测试了五种不同的治疗。每种治疗重复六次，且每次重复包含5只鸡。

这些治疗概括如下：

-T-:对照组，未补充乳杆菌且未受到产气荚膜梭菌感染；

-T+:阳性对照组，未补充乳杆菌，但受到产气荚膜梭菌感染；

-罗伊氏乳杆菌：补充有罗伊氏乳杆菌并受到产气荚膜梭菌感染；

-唾液乳杆菌：补充有唾液乳杆菌并受到产气荚膜梭菌感染；

-罗伊氏乳杆菌+唾液乳杆菌：补充有罗伊氏乳杆菌和唾液乳杆菌的混合物并受到产气荚膜梭菌感染。

1-4/施用产气荚膜梭菌

将产气荚膜梭菌的野生菌株在巯基乙酸盐肉汤中于37℃培养过夜。然后从第14到第16日龄，使用20mL注射器和20号计量针，然后以10

1-5/施用乳酸菌

将乳酸菌菌株在MRS(Man-Rogosa-Sharpe)肉汤中于37℃培养过夜。在第1和第2日龄，给家禽口服250至500μL的10

1-6/对鸡进行的测量

研究在第17天结束。在实验期的第0、10、14和17天，通过记录鸡的体重(以克为单位)(图1)和每个笼子的饲料消耗量来衡量鸡的表现。在测试结束时，所有的鸡都通过用CO

实验方案概括于下表3中。X对应于产品的施用日期。

1-7/统计学分析

使用

2/结果

结果示于下表4中。

上标字母(a、b、c)表示显著的统计差异。具有相同字母的组没有显著差异。

图1的结果表明，相对于阳性对照组(T+)，用罗伊氏乳杆菌或唾液乳杆菌处理的鸡的体重没有显著增加(分别为709.79g和707.50g)。这种增加无法找到与阴性对照组(T-)相似的鸡体重。

相反，罗伊氏乳杆菌和唾液乳杆菌的混合物处理的组的鸡体重(753.13g)与未受感染的鸡的组(765g)相似，与受感染的组(699.58g)有显著差异。

关于由产气荚膜梭菌的施用引起的肠道损伤(图2)，从数据中可以明显看出，对于T+组，将罗伊氏乳杆菌或唾液乳杆菌单独施用于受感染的鸡的组不会显著降低损伤评分。

用罗伊氏乳杆菌和唾液乳杆菌混合物处理的鸡的肠道损伤显著减少，其损伤评分(1.00)与未受感染的鸡的组T-(0.88)相似，而与受感染的鸡的组T+(1.67)有显著差异。

总之，这些体内数据表明，补充罗伊氏乳杆菌和唾液乳杆菌组合产品在鸡中产生对抗坏死性肠炎的保护作用。