一种提取外泌体的捕获探针和方法

技术领域

本发明涉及外泌体提取技术领域，特别是涉及一种提取外泌体的捕获探针和方法。

背景技术

外泌体是一种纳米大小的小囊泡，通过多种生物分子(如蛋白质、RNA和DNA)以及细胞的遗传和表观遗传机制，在细胞之间运输生物活性分子，调节微环境和免疫系统。肿瘤细胞源性外泌体(Tumor-derived exosome，TDE)作为癌细胞与其它细胞之间的通讯工具，在癌症免疫中发挥了关键作用，可以影响其受体细胞的表型和功能属性，甚至使其重编程以促进肿瘤生长、转移和免疫抑制。外泌体膜上携带有亲代细胞来源的表面蛋白，反映其来源细胞的生理、病理及功能状态，可能在肿瘤从原发肿瘤向转移部位的扩散中起关键作用，有望成为生物组织学的组织特异性生物标志物。

外泌体的储存稳定性差、产率低、纯度低、靶向性弱等缺点限制了其临床应用。外泌体在大小，组成，功能和来源上均有明显差异造成提取困难。此外，目前的大多数分离技术不能完全将外泌体与具有相似生物物理特性的脂蛋白和非胞内体途径的胞外小泡分离，从而导致外泌体纯度较低。因此，如何有效地丰富外泌体是当前的一个主要问题，这是外泌体下游分析的关键。根据不同的目的和应用，选择了不同的分离方法，其中超速离心法、粒度分离法、聚合物沉淀法、免疫亲和力捕获法等较为常用。超速离心法是目前应用最广泛的分离技术，也是外泌体提取和分离的黄金标准。但由于其耗时、成本高、结构破坏、聚集成块和脂蛋白共分离，不利于下游分析。大量的样本及长时间的分离检测，在有限的液体活检样本中检测纳米级肿瘤来源的外泌体上相对稀有的表面蛋白非常困难。因此外泌体高效特异分离是解决肿瘤外泌体“液体活检”的关键问题之一，开发一个特异性及灵敏度高和操作时间短的即时检测平台来分离检测肿瘤来源外泌体表达的稀有表面蛋白亟待解决。

发明内容

本发明的目的是提供一种提取外泌体的捕获探针和方法，以解决上述现有技术存在的问题，本发明通过捕获探针表面修饰的CD63抗体与外泌体膜表面蛋白CD63特异识别，在5-10min内即可提取约75％外泌体，远高于传统高速离心法的20％提取率，本发明提供的提取方法更具推广应用价值。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种提取外泌体的捕获探针，所述捕获探针以金属有机骨架为基底，表面修饰外泌体膜表面蛋白CD63抗体。

进一步地，所述金属有机骨架为UIO-66-NH2。

本发明还提供一种上述捕获探针的制备方法，包括：

金属有机骨架超声分散获得均匀溶液，将获得的均匀溶液与活化后的CD63抗体混合孵育，收获捕获探针。

进一步地，所述CD63抗体的活化处理为：将稀释后的CD63抗体与活化制剂等量混合，在37℃恒温条件下孵育30min；其中，所述活化制剂为2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶解1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺配制的混合溶液。

进一步地，所述混合孵育的条件为：4-100℃孵育1-48h；所述活化后的CD63抗体的浓度为0.1-10mg/L。

本发明还提供一种利用上述捕获探针提取外泌体的方法，包括将所述捕获探针与样本混合孵育的步骤。

进一步地，所述混合孵育的温度为30-40℃，时间为1-30min。

进一步地，还包括在混合孵育结束后，离心收集沉淀的步骤。

进一步地，所述捕获探针的浓度为0.05mg/mL；所述样本包含胰腺癌细胞。

本发明公开了以下技术效果：

本发明制备了CD63包被修饰MOFs材料的捕获探针UIO-66-NH2-antiCD63，通过捕获探针表面修饰的CD63抗体与外泌体膜表面蛋白CD63特异识别，在5-10min内即可提取约75％外泌体，远高于传统高速离心法的20％提取率。同时，本发明的提取方法操作简便，在常温下即可完成，无需特殊仪器以及操作处理，且对外泌体结构损伤小，有利于下游分析和表面特殊结构检测，更具推广应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1本发明利用捕获探针UIO-66-NH2-antiCD63吸附提取外泌体的原理图；

图2为捕获探针与Alexa Fluor 488标记的荧光二抗结合的荧光图；A：捕获探针；B：MOFs；

图3为不同孵育条件对捕获探针结合效率的影响；A：温度；B：时间；C：抗体浓度；

图4为不同孵育时间对UIO-66-NH2-antiCD63吸附提取外泌体的效率影响。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

主要试剂来源：

UIO-66-NH2(C

其余试剂如未表明，均为本领域常规试剂，也可商购获得。

金属有机骨架(Metal-organic frameworks，MOFs)是一种由金属中心与有机配体自组装而成的、具有三维网状有序孔结构的新型多孔晶体材料。由于MOFs具有纳米级的骨架结构、可调节的孔径、较大的比表面积和良好的化学稳定性，在生物传感器、生物医学、电催化、储能和转化等领域得到了广泛的应用。MOFs可用于构建高性能生物传感器，用于从医疗诊断、食品安全检查到环境监测等众多应用。由于其大的比表面积、简便的合成方法、丰富的官能团和化学稳定性，MOF可应用于各种领域，如分离、吸附、和催化。MOF的大比表面积和多孔结构为材料与分析物之间的相互作用提供了更多的界面和活性部位，允许各种各样的DNA、RNA和适体附着在它们上面。由于MOF的孔径可调，不同种类的核酸具有不同的特异性，可以固定在MOF的表面或内部。为此，本发明开发了一种CD63包被修饰MOFs材料的捕获探针UIO-66-NH2-antiCD63，通过优化工艺参数，制备出CD63和UIO-66-NH2结合效率最佳的捕获探针；利用该探针表面修饰的CD63抗体与外泌体膜表面蛋白CD63特异识别，实现外泌体的吸附提取。图1为本发明利用捕获探针UIO-66-NH2-antiCD63吸附提取外泌体的原理图。具体研究如下：

实施例1

MOFs结合CD63制备捕获探针：

1制备UIO-66-NH2-antiCD63捕获探针

先将0.5mg/mL的CD63抗体用抗体稀释液稀释1000倍，之后利用100μLMES(pH＝4.7)溶解EDC和NHS配制混合溶液(EDC和NHS浓度均为50mg/mL)，将稀释后的CD63抗体与混合溶液等量混合后，在37℃恒温金属浴内孵育30分钟以活化抗体。用超纯水溶解MOFs(UIO-66-NH2)材料，超声分散以获得乳白色均匀溶液。取100μL浓度为2mg/mL的UIO-66-NH2的乳白色均匀溶液与100μL活化抗体混合并在4℃下孵育过夜，将CD63抗体与MOFs材料表面-NH2共价连接修饰，形成UIO-66-NH2-antiCD63捕获探针。

2判断CD63和UIO-66-NH2的结合效率

将上述孵育过夜的混合溶液13000rpm离心，丢弃上清，用PBS冲洗三次以去除未结合的抗体。用100μL含1％BSA的PBS重悬制备好的捕获探针。抗体稀释液将功能化的山羊抗小鼠IgG H&L(Alexa

3制备捕获探针的工艺优化：

将MOFs材料和活化抗体分别以4℃、20℃、37℃、40℃、56℃、65℃、80℃、100℃的温度下孵育过夜，再将MOFs材料和活化抗体分别以56℃的温度下孵育1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时、48小时。将0.5mg/mL的CD63抗体用抗体稀释液分别按比例稀释至50、100、500、1000、2500、5000倍(即CD63抗体浓度为10mg/L、5mg/L、1mg/L、0.5mg/L、0.2mg/L、0.1mg/L)，其余捕获探针合成步骤同前，酶标仪以激发波长488nm，发射波长525nm测定不同抗体浓度合成的捕获探针中吸附二抗的荧光强度。结果如图3所示：MOFs材料与5mg/L的CD63抗体在56℃孵育8小时以制备捕获探针UIO-66-NH2-antiCD63时结合效率最佳。

4UIO-66-NH2-antiCD63捕获外泌体的效率检测：

50μL反应缓冲液中加入5μLPKH67标记染料，涡旋混匀并瞬时离心，再加入胰腺癌外泌体样品，并将混合物在37℃恒温金属浴、避光振荡孵育。经色谱柱洗脱，离心得到PKH67染料标记后的外泌体，且调整浓度为1×10

综合上述，本发明制备了一种CD63包被修饰MOFs材料的捕获探针，通过捕获探针表面修饰的CD63抗体与外泌体膜表面蛋白CD63特异识别，在5-10min内即可完成外泌体提取。其中，MOFs材料的多孔结构、大的比表面积进一步增大了体系中的吸附提取效率，结合CD63抗体的MOFs材料为外泌体的简便分离提供结构基础，实现在5-10min内吸附提取约75％外泌体，远高于传统高速离心法的20％提取率。同时，该提取过程操作简便，在常温下即可完成，无需特殊仪器以及操作处理，且对外泌体结构损伤小，有利于下游分析和表面特殊结构检测，更具推广应用价值。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。