一种L-谷氨酰胺及其代谢中间产物在改善鸡肉香味品质中应用

技术领域

本发明属于家禽饲料添加生产技术领域，具体涉及一种改善鸡肉香味品质的技术及其应用。

背景技术

鸡肉是消费者获取肉类蛋白质的第二大来源。风味是衡量鸡肉品质的一个重要指标，也是消费者评价鸡肉品质质量的常用指标。风味是由香味和滋味组成的。肉的香味是挥发性有机物质随着气流进入人的鼻腔产生的，挥发性有机物质是由肉类中香味前体物通过复杂化学变化产生的，主要包括脂质氧化、美拉德反应和硫胺素降解反应。肉的滋味主要由肌苷酸、氨基酸、乳酸和肽类等滋味呈味物质共同构成甜味、咸味、苦味、酸味和鲜味5种基本味道。关于肉类滋味的研究有很多，但是由于挥发性香味物质的含量甚微，种类繁多且稳定性很差，有一定的研究难度。因此，关于提升鸡肉香味品质的研究不够系统和深入，提升鸡肉香味品质的营养调控技术更是缺乏。

有研究表明L-谷氨酰胺是影响鸡肉滋味的重要物质。例如现有技术《日粮中添加谷氨酞胺对肉仔鸡肉品质和抗氧化指标的影响》(动物营养学报2009，21(2)：245-250)中公开了：谷氨酰胺在肉鸡上研究结果表明，日粮中添加谷氨酰胺有提高肉仔鸡肌肉中肌苷酸含量的趋势，显著提高必需氨基酸和鲜味氨基酸的含量，进而改进鸡肉的滋味品质。但是，对本领域技术人员而言，鸡肉的滋味和香味是完全不同的概念，主要体现在：1.指标的差别：风味是由香味和滋味组成的。肉的香味是挥发性有机物质随着气流进入人的鼻腔产生的，挥发性有机物质是由肉类中香味前体物通过复杂化学变化产生的，主要包括脂质氧化、美拉德反应和硫胺素降解反应。肉的滋味主要由肌苷酸、氨基酸、乳酸和肽类等滋味呈味物质共同构成甜味、咸味、苦味、酸味和鲜味5种基本味道。上述研究的是添加谷氨酰胺对氨基酸和肌苷酸等滋味物质的影响，但并没有研究上述操作对挥发性香味物质的影响，而上述指标不管是形成还是测定方法都是有很大差别的。2.目的的差别：现有技术中只对添加谷氨酰胺后的一些滋味指标进行测定，目的是明确添加谷氨酰胺后，滋味物质含量的变化；并没有其他的深入研究。由此可见，还缺乏关于L-谷氨酰胺影响鸡肉挥发性香味物质形成的机理及营养调控技术的研究。因此，我们提出一种添加L-谷氨酰胺来改善鸡肉香味以提升鸡肉品质质量的技术。

发明内容

针对现有技术的不足，本申请的发明人提出一种改善鸡肉挥发性风味的技术，从而实现提升鸡肉特征性香味，改善鸡肉品质质量。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明的目的之一在于提供一种改善鸡肉香味品质的物质，该物质原料易得、效果明显，配合后应用于鸡的饲料中，可以提升鸡肉特征性香味，改善鸡肉品质质量。

本发明的第二个目的在于优化改善鸡肉香味品质的物质的添加量。

本发明的第三个目的在于提供上述改善鸡肉香味品质在鸡饲料中的应用，将其应用于鸡饲料中能有效地改善鸡肉香味品质。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

为实现本发明的目的之一，本发明提供了一种改善鸡肉香味品质的物质，将L-谷氨酰胺与基础饲料混合以形成干颗粒形式的混合饲料。

为实现第二目的，本发明通过对不同添加量组的香味品质指标进行比较，优化了L-谷氨酰胺的添加量。

为实现第三目的，本发明提供了一种改善鸡肉香味品质的物质的应用，其特征在于，该物质添加至鸡基础日粮中。

具体的，该物质在鸡基础日粮中的含量为0。

具体的，当该物质添加至鸡基础日粮中时，添加量为5g/kg或10g/kg L-谷氨酰胺。

具体的，对不同添加量进行比较，鸡饲料中优化的L-谷氨酰胺含量为每千克基础饲粮中添加5克L-谷氨酰胺。

本发明提供了一种改善鸡肉香味品质的优化L-谷氨酰胺添加量的方案。本发明对基础饲料进行改良，通过在饲料中添加适宜剂量的L-谷氨酰胺，进一步，通过合理调整饲料配比，获得改善鸡肉香味品质的最适L-谷氨酰胺添加量。通过在饲料中添加2种不同浓度的L-谷氨酰胺(5g/kg和10g/kg)，目的改善鸡肉香味品质等。

本发明实施方式中涉及的添加不同浓度L-谷氨酰胺，在基础饲料基础上，饲料中额外添加所述浓度的L-谷氨酰胺，分别为5g/kg和10g/kg。

L-谷氨酰胺是影响鸡肉鲜味的重要物质，作为一种条件性必需氨基酸，是动物血液及其他组织含量最丰富的游离氨基酸之一，也是谷胱甘肽合成的前体。在肉鸡日粮中添加谷氨酰胺可以提高肉仔鸡日采食量和日增重，提高其生长性能。此外，谷氨酰胺具有改善机体代谢、氮平衡、促进蛋白质合成、减少应激、提高机体抗氧化能力的作用，进而对动物的肉质产生影响。

本发明通过外源添加L-谷氨酰胺定向提高关键挥发性香味物质的含量，集成了调控鸡肉香味品质的技术；另外，该发明还利用代谢组学的多重分析，明确了L-谷氨酰胺作用于挥发性香味物质的代谢机理，为后续通过营养添加调控鸡肉的品质提供了更多的添加物选择，比如：添加物还可以选择L-谷氨酰胺代谢机理中的中间产物：L-谷氨酸、2-酮戊二酸和D-葡糖胺-6-磷酸、脯氨酸、精氨酸和赖氨酸。

有益效果

本发明为了改善鸡肉品质质量，提供了一种改善鸡肉挥发性风味的技术，该技术为添加L-谷氨酰胺以改善鸡肉挥发性风味，通过研究发现，L-谷氨酰胺通过精氨酸生物合成通路、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢通路两个通路对鸡肉特征性香味物质产生影响。这为鸡肉风味的改善和鸡肉品质质量的提升提供了理论基础和参考数据。本申请除了明确对挥发性香味物质含量的影响之外，还基于代谢组学明确添加L-谷氨酰胺后的代谢差异，进而阐明L-谷氨酰胺影响挥发性香味物质沉积的代谢机理，为后续通过营养添加调控鸡肉的品质提供更多的添加物选择。本发明同时确定了鸡饲料中最优的L-谷氨酰胺含量为每千克基础饲粮中添加5克L-谷氨酰胺。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1快大型白羽肉鸡与黄羽肉鸡GC-O和OAV鉴定到的物质的比较。(a)W42、BY140和JXY140中VOCs的韦恩图。(b)W42、BY140和JXY140中有气味物质的气味强度。(c)W42、BY140和JXY140中特征香味化合物的韦恩图。(d)W42、BY140和JXY140中特征香味化合物的OAV值。其中W42表示42日龄的白羽肉鸡，BY140表示140日龄的北京油鸡，JXY140表示140日龄的京星黄鸡。

图2鸡肉中的8种特征性香味物质与代谢物的WGCNA分析。

图3快速生长型肉鸡和黄羽肉鸡的代谢组的OPLS-DA分析,其中W42表示42日龄的白羽肉鸡，BY140表示140日龄的北京油鸡，JXY140表示140日龄的京星黄鸡。

图4不同品种的鸡肉中L-谷氨酰胺的含量比较。其中W42表示42日龄的白羽肉鸡，JXY140表示140日龄的京星黄鸡。

图5添加组和对照组香味差异分析。(a)公鸡的电子鼻结果。(b)母鸡的电子鼻结果。(c)添加5g/kg的L-谷氨酰胺后对公鸡饱和醛和1-辛烯-3-醇的影响。(d)添加5g/kg的L-谷氨酰胺后对母鸡饱和醛和1-辛烯-3-醇的影响。其中C1-1为对照组公鸡，C1-2为对照组母鸡，G1-1为添加5g/kg L-谷氨酰胺的公鸡，G1-2为添加5g/kg L-谷氨酰胺的母鸡，G2-1为添加10g/kg L-谷氨酰胺的公鸡，G2-2为添加10g/kg L-谷氨酰胺的母鸡。

图6L-谷氨酰胺促进壬醛、己醛、庚醛、辛醛和1-辛烯-3-醇合成的潜在代谢机理。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下属实施例中所使用的试验方法若无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，若无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

下面通过具体实施例，来进一步说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围并不受到任何形式上的限制：

实施例1鸡肉特征性香味物质的代谢标志物的鉴定

主要包括以下步骤

(1)实验设计

选取快大型白羽肉鸡(广明2号)和黄羽肉鸡(北京油鸡和京星黄鸡)各60只，在环境可控条件下饲养，饲养方式为笼养，试验期按照我国《鸡饲养标准》(NY/T 33-2004)肉鸡营养需要，购买全价饲料。

在白羽肉鸡42日龄(White feather broiler，W42)，北京油鸡140日龄(BeijingYou chicken，BY140)，京星黄鸡140日龄时(Jingxing Yellow chicken，JXY140)时，各选取30只体重相近的鸡进行屠宰，屠宰后快速用生理盐水冲洗胴体和体腔并立即剥离出两侧胸肌，剔除其中可见脂肪和结缔组织，搅碎混合均匀后放入-80℃冰箱保存以用于测定指标的含量。

(2)挥发性香味物质的测定

基于GC-MS对鸡肉挥发性香味物质进行测定。使用安捷伦7890B气相色谱仪配备安捷伦7200质谱仪进行鸡肉挥发性香味物质的测定。通过将流出物的RI与美国国家标准与技术研究所标准库(NIST17)的数据进行比较，对肉类中的挥发性香味物质进行定性。所有挥发性化合物均采用内标法(以2-甲基-3-庚酮为内标，将10μl浓度为0.05μg/uL的内标加入肉样品中)进行相对定量。采用OAV法测定各挥发性有机化合物对鸡肉的整体香气的贡献。

(3)代谢物的测定

从-80℃冰箱中取出样本在冰上解冻；准确称取20mg到离心管(EP)中，加入70％甲醇水内标提取液400ul，1500r/min振荡5min，冰上静置15min；在4℃条件下，12000r/min离心10min，移取上清液300uL到另一EP管中，-20℃冰箱中静置30min；在4℃条件下，12000r/min再离心3min，移取上清液200uL到对应进样瓶内衬管中，用于上机分析。利用超高液相色谱(UPLC)和串联质谱(MS/MS)进行数据采集。

过三重四级杆质谱的多反应监测模式(MRM)进行定量分析，第一重四级杆对目标物质的前体离子进行筛选，然后前体离子在第二重四级杆中经碰撞诱导电离后被打碎，碎片离子再经过第三重四级杆过滤选择出一个典型的特征碎片离子，排除非目标离子的干扰。

(4)数据分析

将鸡肉的8种特征性香味物质与代谢组数据进行WGCNA分析。对特征性香味物质的蓝色或蓝绿色模块里的显著相关代谢物(|MM|>0.5，P<0.05)和(|GS|>0.5，P<0.05)进行KEGG分析以明确特征性香味物质产生的相关潜在代谢通路。

利用软件Analyst 1.6.3处理质谱数据。正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)在原始数据进行log2转换后，再进行中心化处理。利用R软件中的MetaboAnalystR包OPLSR.Anal函数进行分析。基于OPLS-DA结果，从获取的多变量分析OPLS-DA模型的变量重要性投影(VIP)，和c差异倍数值(FC)来筛选差异代谢物。满足VIP≥1和FC≥2或VIP≥1和FC≤0.5的代谢物为组间的差异代谢物，以这些代谢物进行分析。

(5)实验结果

如图1所示，在快大型白羽肉鸡和黄羽肉鸡中共鉴定出8种具有香味(GC-O)和对鸡肉香味品质有显著影响(OAV>1)的特征性香味挥发性化合物。对上述结果进行比较分析发现，在3个鸡品种都鉴定出壬醛、辛醛和二甲基四硫化物3种化合物，它们是影响鸡肉香味品质的基本特征香味化合物。此外，两种黄羽肉鸡的8种特征风味物质完全重叠(图1c)，其中5种化合物(己醛、1-辛烯-3-醇、(E)-2-壬烯醛、庚醛和(E,E)-2,4-癸二烯醛)为黄羽肉鸡的特征性香味物质，因此，上述8种物质对鸡肉的香味轮廓有特殊贡献。

WGCNA结果如图2所示，壬醛、辛醛、己醛、庚醛和1-辛烯-3-醇相关代谢物富集的模块相似，主要富集在蓝色和蓝绿色模块且呈负相关。因此对壬醛、辛醛、己醛、庚醛和1-辛烯-3-醇的显著相关通路进行比较发现，5种物质共有1条共同代谢通路(Aminoacyl-tRNAbiosynthesis)，其中代谢物DL-亮氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、色氨酸和L-谷氨酰胺通过Aminoacyl-tRNA biosynthesis通路作用于特征性香味物质的形成过程(表1)。

表1鸡肉中4种饱和醛和1-辛烯-3醇的共同富集通路和共同注释的代谢物

为了明确饱和醛和1-辛烯-3醇的关键代谢标志物，分两个比较组(W42 vs BY140，W42 vs JXY140)对白鸡和黄鸡的的代谢物进行多元统计分析分析，结果如图3所示，快大型白羽肉鸡与黄羽肉鸡的代谢物有明显差异。对快大型白羽肉鸡和黄羽肉鸡两个组的差异代谢物分别进行KEGG分析，发现关键香味前体物L-谷氨酰胺在两个组中都是差异代谢物，且在黄鸡中的含量较低，结果如图4所示。上述结果表明，L-谷氨酰胺是壬醛、辛醛、己醛、庚醛和1-辛烯-3-醇的代谢标志物。

实施例2

外源添加不同浓度L-谷氨酰胺提高香味物质含量。主要包括以下步骤：

(1)实验设计

选择1日龄体重相近的广西金陵花鸡600只(公母各半)，随机分为3个组(1个对照组，2个处理组)，每组200只鸡。具体的，C1组为对照组，G1组和G2组为实验组。对照组C1饲喂正常水平的基础饲粮，实验组G1组和G2组饲喂基础饲粮+L-谷氨酰胺，其中G1组饲喂基础饲粮+5g/kg的L-谷氨酰胺，G2组饲喂基础饲粮+10g/kg的L-谷氨酰胺。营养添加实验从1日龄饲喂到金陵花鸡的上市日龄56日龄。本发明在基础饲料中添加L-谷氨酰胺时，为了保证纯度为99％的L-谷氨酰胺的质量和应用效果，将L-谷氨酰胺与基础饲料混合以形成干颗粒形式的混合饲料。

在金陵花鸡56日龄，对照组和添加组各选取60只体重相近的鸡(公母各半)进行屠宰，屠宰后快速用生理盐水冲洗胴体和体腔并立即剥离出两侧胸肌，剔除其中可见脂肪和结缔组织，搅碎混合均匀后放入-80℃冰箱保存以用于测定指标的含量。

(2)养殖管理

本发明进一步提供了所述基础饲料的制备方法，包括：本发明进一步提供了所述基础饲料的制备方法，包括：将40.20％的玉米，25.00％的大麦，13.60％的46％豆粕，3.00％的发酵豆粕，4.00％的葵花仁粕，3.00％的大豆油，0.90％的磷酸氢钙，3.00％的石粉，5.00％的颗粒石粉，0.20％氯化胆碱(60％)，0.25％的蒙脱石，0.28％的液体蛋氨酸，0.17％的食盐，1.40％的添加剂，混合均匀后放入制粒机，即得。所述的基础日粮配方和营养水平详见表2。

表2黄羽种鸡基础饲料配方和营养水平

(3)E-nose分析

E-nose使用基于快速气相色谱的HERACLES II E-nose检测系统(法国Alpha MOS公司)，配备非极性MTX-5(5％二苯基)和中极性MXT1701(14％氰丙基苯基)，以及用于鸡肉样品香气分类的超灵敏火焰电离检测器。

(4)挥发性香味物质的测定，同实例1。

(5)代谢物的测定，同实例1。

(6)实验结果

结果如图5所示，电子鼻能区分开C1和G1，C1-母和G2-母，说明添加5g/kg的L-谷氨酰胺对公鸡母鸡的整体气味都有一定的影响，添加10g/kg的L-谷氨酰胺对母鸡的整体气味有影响。根据电子鼻的结果表明添加5g/kg的L-谷氨酰胺可能对鸡肉的香味品质影响更大，因此，为了明确添加L-谷氨酰胺对鸡肉挥发性风味物质的实际影响，对C1-公，G1-公，C1-母，G1-母的挥发性物质进行鉴定，G1-公组的庚醛、辛醛、壬醛、己醛和1-辛烯-3-醇的含量极显著地高于C1-公组(图5c)；G1-母组的辛醛的含量显著高于C1-母组(图5d)，说明外源添加5g/kg L-谷氨酰胺可以提高饱和醛和1-辛烯-3-醇的含量。上述结果表明，肉鸡饲料中改善鸡肉香味品质的最佳添加量为5g/kg。

实施例3L-谷氨酰胺促进饱和醛和1-辛烯-3醇形成的代谢机理。主要包括以下步骤：

(1)实验设计，同实施例2。

(2)养殖管理，同实施例2。

(3)代谢物的测定，同实施例1。

(4)多元统计分析

利用软件Analyst 1.6.3处理质谱数据。正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)在原始数据进行log2转换后，再进行中心化处理。利用R软件中的MetaboAnalystR包OPLSR.Anal函数进行分析。基于OPLS-DA结果，从获取的多变量分析OPLS-DA模型的变量重要性投影(VIP)，和c差异倍数值(FC)来筛选差异代谢物。满足VIP≥1和FC≥2或VIP≥1和FC≤0.5的代谢物为组间的差异代谢物，以这些代谢物进行分析。

(5)实验结果

根据KEGG分析结果可知，L-谷氨酰胺是通过Aminoacyl-tRNA biosynthesis和Alanine,aspartate and glutamate metabolism共同通路作用于饱和醛和1-辛烯-3-醇的。经过对这两个通路的结合分析，结果如图6所示，发现L-谷氨酰胺主要转化成三种主要的代谢物(L-谷氨酸、2-酮戊二酸和D-葡糖胺-6-磷酸)；之后L-谷氨酸还能直接转化成2-酮戊二酸，或通过4-氨基丁酸酯转化成琥珀酸，2-酮戊二酸通过三羧酸循环也能转化成琥珀酸，琥珀酸进而转化成草酰乙酸；草酰乙酸可转化成其他氨基酸(脯氨酸、精氨酸和赖氨酸)。D-葡糖胺-6-磷酸和氨基酸都是美拉德反应的主要原料，因此我们推测添加L-谷氨酰胺主要通过增强美拉德反应促进饱和醛和1-辛烯-3醇的合成。上述结果表明，L-谷氨酰胺可能是通过增加D-葡糖胺-6-磷酸的含量和诱导脯氨酸、精氨酸和赖氨酸的降解增强美拉德反应促进壬醛、辛醛、己醛、庚醛和1-辛烯-3-醇的形成，进而改善鸡肉的香味轮廓。

上述实施例虽然已对本发明以及其实施方式做了详尽的描述，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以对相应的条件等所做的改变：比如改变L-谷氨酰胺的添加浓度、外源添加潜在代谢机制里的中间产物(L-谷氨酸、2-酮戊二酸和D-葡糖胺-6-磷酸、脯氨酸、精氨酸和赖氨酸)均应视为等效的置换方式，这些改进也应视为本发明的保护范围。