一种川明参药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱构建方法

技术领域

本发明涉及分析检测技术领域，尤其是涉及一种川明参药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱构建方法。

背景技术

伞形科(Umbelliferae)植物川明参Chuanminshen violaceum Sheh et Shan的干燥根，具有滋阴解热，归于肝、肺经，肝热上犯头目功效。标准汤剂是由药材经炮制后按固定的制备工艺而成的冻干粉。

为了确保川明参药材、饮片及其标准汤剂质量的均一、稳定，本文建立一种新的特征图谱方法对其质量进行把控。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种川明参药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱构建方法，本发明构建的川明参药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱方法稳定，可靠，可以对川明参药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒的质量进行控制。

本发明提供了一种川明参药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱构建方法，包括：

A)将川明参原料采用溶剂提取，得到待测液；

B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到川明参原料的HPLC特征图谱；

所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸，梯度洗脱。

本发明提供的一种川明参药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱构建方法首先取川明参原料，溶剂提取，得到待测液。所述溶剂优选为50％甲醇。

按照本发明，所述川明参原料为川明参药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒。

按照本发明，川明参药材/饮片待测液制备具体为：将川明参药材/饮片采用水煎煮20～30min，而后加入50％甲醇超声提取；所述超声功率为600W，频率为40kHz；所述提取时间为20～40min；更优选为30min。

按照本发明，川明参标准汤剂/配方颗粒待测液制备具体为：将川明参标准汤剂/配方颗粒采用50％甲醇超声提取，放冷，摇匀，滤过，即得。所述超声功率为600W，频率为40kHz；所述提取时间为20～40min；更优选为30min。

所述川明参原料的质量g和溶剂的体积mL的比为(0.5～2)：(25～50)。最优选为药材、饮片1.5：50、标汤0.5：25、配方颗粒0.5：25。

本发明采用上述提取溶剂色谱峰信息量大，效果好。

所述川明参原料为川明参药材、川明参饮片或汤剂。本发明对其不进行限定，上述原料皆可通过本发明的方法进行质量控制和定性检测。

本发明还包括制备参照物溶液：分别取补骨脂素，采用50％甲醇溶解，得到对照品参照物溶液；

取对照药材加水煎煮，而后采用50％甲醇超声提取，得到对照药材参照物溶液；

将所述对照品和对照药材参照物溶液采用高效液相色谱法测定，分别得到对照品和对照药材参照物的色谱图；并根据对照品和对照药材参照物的色谱图对川明参川明参药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱的成分进行定性测定。

本发明所述流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸溶液，梯度洗脱。

本发明所述梯度洗脱优选具体为：

0～3min，A相：10～14％、B相：90～86％；

3～15min，A相：14％～17％、B相：86％～83％；

15～30min，A相：17％～40％、B相：83％～60％；

30～40min，A相：40％～80％、B相：60％～20％。

本发明在上述洗脱梯度下基线分离好，各个峰分离度好，基线平稳。

C18柱，规格为2.7μm，3.0×150mm；柱温25℃。

本发明色谱柱在上述25℃条件下色谱峰对称、分离度好。

流动相流速优选为0.3ml/min。

本发明发现流速0.3ml/min下各色谱峰分离较好，峰形较对称，作为最优选方案。

本发明检测波长优选为335nm。

本发明人发现，在335nm处色谱信息丰富，各成分均有较好吸收，响应值适中，各峰分离度较好，基线平稳。

本发明进样量优选为10μL。

本发明的有益效果是，一个液相色谱条件下，以指纹图谱控制川明参川明参药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒的物质群，以补骨脂素对指纹图谱进行定位；能够大大降低检测的成本，实现定性检测。

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对川明参川明参药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱的相似度进行评价，得到由10个特征峰构成的川明参川明参药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC标准特征图谱，其中峰3：咖啡酸峰，峰7(S)：补骨脂素峰，峰8：5，8-二甲氧基补骨脂素峰。

在所述川明参标准汤剂特征图谱中，以补骨脂素为参照峰S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，所述相对保留时间在规定值的±10％之内，所述规定值分别为：0.22(峰1)、0.24(峰2)、0.30(峰3)、0.45(峰4)、0.84(峰5)、0.88(峰6)、1.11(峰8)、1.20(峰9)、1.22(峰10)。

质量判断标准：取川明参川明参药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒样品，按上述同法操作，得到川明参川明参药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒特征图谱，采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012版对川明参川明参药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒标准特征图谱和样品特征图谱进行分析，相似度大于0.90。

采用本发明所提供的方法能有效的监控不同批次川明参川明参药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒的质量，使其质量稳定，方法具有精密度高、重现性好等特点，有利于全面监控产品的质量。

本发明建立的川明参药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒特征图谱以补骨脂素，为参照物，注重各个特征峰的顺序和与药材及中间产品的相关性，能全面评价产品的整体质量面貌特征，方法科学可靠。

本发明新建的特征图谱方法，可以检测川明参及其标准汤剂中极性较大的成分。且供试品制备方法简单容易操作，指认特征峰相对较多。可对川明参及其制剂进行准确、可靠的特征图谱检测。对川明参及其制剂的真实性和质量的一致性以及稳定性均可有效地加以检测和控制。为有效控制和较全面评价川明参标准汤剂的质量提供依据。确保川明参及其标准汤剂质量的均一、稳定。

本发明提供了一种川明参药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱构建方法，包括：A)将川明参原料采用溶剂提取，得到待测液；B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到川明参原料的HPLC特征图谱；所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸，梯度洗脱。本发明采用高效液相色谱法，选用乙腈-0.1％磷酸为流动相进行梯度洗脱，以补骨脂素为参照物，建立了川明参川明参药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱，重复性、精密度好，方法稳定，可靠，可以对川明参药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒的质量进行控制。

附图说明

图1川明参标准汤剂3D图；

图2川明参标准汤剂不同波长色谱图；

图3为流速考察；

图4柱温考察；

图5提取溶剂考察结果；

图6提取方式考察；

图7提取时间考察；

图8色谱峰指认；

图9不同色谱柱考察；

图10为川明参标准汤剂特征图谱；

图11为川明参标准汤剂对照特征图谱；

图12为川明参药材3D图。

图13为流速考察结果；

图14为柱温考察结果；

图15为提取溶剂考察结果；

图16为提取方法考察；

图17为提取时间考察；

图18色谱峰指认；

图19色谱柱耐用性考察；

图20-1川明参药材特征图谱；

图20-2川明参药材特征图谱；

图21-1川明参药材对照特征图谱；

图21-2；川明参饮片对照特征图谱；

图22为川明参饮片特征图谱；

图23为川明参饮片特征图谱；

图24川明参成品紫外吸收光谱图；

图25川明参配方颗粒不同波长色谱图；

图26流速考察；

图27柱温考察色谱图；

图28提取溶剂考察；

图29提取方法考察；

图30提取时间考察；

图31为色谱峰指认；

图32不同色谱柱；

图33 3批川明参配方颗粒特征图谱验证图；

图34为川明参配方颗粒对照特征图谱；

图35为对比例1和对比例2不同梯度条件下的对比图；

图36不同流动相对比的结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种川明参药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱构建方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都属于本发明保护的范围。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种川明参药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱构建方法进行详细描述。

高效液相色谱仪：Agilent超高效液相色谱仪

电子天平：ME204E/02、MS205DU、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；

超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)；

超声波清洗器：KQ5200DB型(600W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司)；

色谱柱：为C18；优选为InfinityLab Poroshell 120EC-C18(柱长为150mm，内径为3.0mm，粒径为2.7μm)。

乙腈(色谱纯，西格玛奥德里奇上海贸易有限公司)、磷酸(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)、甲醇(分析纯、成都市科隆化学试剂有限公司)、流动相用水为实验室自制超纯水，其余均为实验室自制纯水。

补骨脂素对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110739-201617；纯度：99.7％)；

咖啡酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110885-201703，纯度：99.7％)；

5,8-二甲氧基补骨脂素对照品(成都普思生物科技股份有限公司，批号：PS010566，纯度：99.71％)；

川明参对照药材(上海鸿永生物科技有限公司，230100-202304)。

川明参标准汤剂冻干粉(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号：BT-1、BT-2、BT-3、BT-4、BT-5、BT-6、BT-7、BT-8、BT-9、BT-10、BT-11、BT-12、BT-13、BT-14、BT-15、BT-16、BT-17、BT-18、BT-19、BT-20、BT-21。)

川明参药材：YC-1、YC-2、YC-3、YC-4、YC-5、YC-6、YC-7、YC-8、YC-9、YC-10、YC-11、YC-12、YC-13、YC-14、YC-15、YC-16、YC-17、YC-18、YC-19、YC-20、YC-21。

川明参饮片：YP-1、YP-2、YP-3、YP-4、YP-5、YP-6、YP-7、YP-8、YP-9、YP-10、YP-11、YP-12、YP-13、YP-14、YP-15、YP-16、YP-17、YP-18、YP-19、YP-20、YP-21。

川明参配方颗粒KL-1、KL-2、KL-3。

实施例1川明参标准汤剂HPLC特征图谱

1.1色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为150mm，内径为30.mm，粒径为2.7μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为25℃；检测波长为335nm，理论板数按补骨脂素峰计算应不低于5000。

参照物溶液的制备取川明参对照药材约1.5g，置具塞锥形瓶中，加水50ml，煎煮30分钟，离心，取上清液，蒸干，残渣加入50％甲醇10ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取补骨脂素对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含10μg的溶液，作为对照品参照物溶液。

供试品溶液的制备取本品粉末约0.5g，加50％甲醇25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法分别精密吸取对照药材参照物溶液和供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

1.2波长选择

在“色谱条件与系统适用性试验”基础上，利用二极管阵列检测器分别对供试品溶液进行全波段扫描，并分别提取供试品溶液在220nm、240nm、280nm、300nm、335nm、350nm波长下的色谱图，结果见图1、2。图1川明参标准汤剂3D图；

图2川明参标准汤剂不同波长色谱图；结果表明，在检测波长为335nm时色谱峰信息量较大，故川明参标准汤剂特征图谱方法的检测波长最确定为335nm。

1.3流速考察

在“色谱条件与系统适用性试验”基础上，分别对流速为0.2ml/min、0.3ml/min、0.4ml/min时进行考察，见图3。图3为流速考察。

结果表明，不同流速下各特征峰相对保留时间的RSD在0.3％-18.3％，表明该方法较可行。在流速为0.2ml/min、0.4ml/min时，色谱峰8分离度较差，流速为0.3ml/min时，色谱图峰形均对称，分离度均符合要求。故根据习惯选择流速0.3ml/min进行后续考察。

1.4柱温考察

在“色谱条件与系统适用性试验”基础上，分别对柱温为25℃、30℃、35℃时进行考察。见图4。图4柱温考察。

结果表明，在柱温为25℃时，色谱图峰形均对称，分离度均符合要求。故选择柱温25℃进行后续考察。

综上所述，川明参标准汤剂特征图谱色谱条件与系统适用性试验暂定为:色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为150mm，内径为30.mm，粒径为2.7μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为25℃；检测波长为335nm，理论板数按补骨脂素峰计算应不低于5000。

1.5供试品溶液的制备考察

1.5.1提取溶剂考察

取川明参标准汤剂冻干粉(BT-1)6份，约0.5g，分别加水、70％甲醇、甲醇、50％甲醇、乙醇各25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按“4色谱条件与系统适用性试验”结果进样测定，结果见图5。图5提取溶剂考察结果。

结果表明：50％甲醇提取的供试品溶液中色谱峰中峰型和分离度均较好，因此选择50％甲醇作为川明参药材特征图谱测定中供试品溶液制备的提取溶剂。

1.5.2提取方式考察

取川明参标准汤剂冻干粉(BT-1)2份，约0.5g，加50％甲醇25ml，分别超声处理(功率600W，频率40kHz)和回流处理各30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按“1.4色谱条件与系统适用性试验”结果进样测定，结果见图6。图6提取方式考察。

从图6中可以看出，回流提取和超声提取的最终效果无显著差异，故选择操作更加简便的超声作为川明参标准汤剂特征图谱测定中供试品溶液制备的提取方式。

1.5.3提取时间考察

取川明参标准汤剂冻干粉(BT-1)3份，约0.5g，置具塞锥形瓶中，加入50％甲醇25ml，分别超声(功率600W，频率40kHz)处理20分钟、30分钟、40分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按“1.4色谱条件与系统适用性试验”结果进样测定，结果见图7。图7提取时间考察。

从图7中可以看出，超声提取时间为20分钟、30分钟、40分钟时，色谱图中峰分离无明显差异，但为了保证溶液能充分提取。故选择提取时间30分钟作为川明参标准汤剂特征图谱测定中供试品溶液制备的提取时间。

综上所述，川明参标准汤剂特征图谱供试品溶液的制备方法确定为：取本品约0.5g，加50％甲醇25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.6方法学考察

1.6.1色谱峰指认

对照药材溶液的制备：取川明参对照药材1.5g，置于锥形瓶中，加水50ml，煎煮30分钟，离心，取上清液，蒸干，残渣加50％甲醇溶液10ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。

参照物溶液的制备：分别取咖啡酸、补骨脂素、5，8-二甲氧基补骨脂素对照品适量，精密称定，分别加50％甲醇各制成每1ml含10μg的溶液，作为对照品参照物溶液。

供试品溶液的制备：按“1.5供试品溶液的制备考察”结果制备川明参标准汤剂供试品溶液。

阴性对照溶液的制备：按“1.5供试品溶液的制备考察”结果制备缺川明参标准汤剂的阴性对照溶液。按“1.4色谱条件与系统适用性试验”结果进样测定，结果见图8。图8色谱峰指认。

1.6.2精密度试验

取川明参标准汤剂冻干粉(BT-1)6份，按“5供试品溶液的制备考察”结果制备供试品溶液，按“1.4色谱条件与系统适用性试验”连续进样6次结果进样测定，结果见表1。

表1 精密度考察—特征峰保留时间

结果表明，各特征峰保留时间RSD值在0.1％-0.2％之间，表明该仪器精密度良好。

1.6.3重复性考察

取川明参标准汤剂冻干粉(BT-1)6份，按“1.5供试品溶液的制备考察”结果制备供试品溶液，按“1.4色谱条件与系统适用性试验”结果进样测定。结果见表2。

表2为重复性考察—特征峰相对保留时间比值

结果表明，各特征峰相对保留时间RSD值在0.1％-0.2％之间表明该方法重复性较好。

1.6.4中间精密度考察

取同一供试品(批号：BT1)由不同人员(A、B)在不同时间(Ⅰ、Ⅱ)下按“5供试品溶液的制备考察”结果制备供试品溶液，并按“1.4色谱条件与系统适用性试验”结果分别在仪器a、b上进样测定，结果见表3。

表3中间精密度-相对保留时间

由表3可知，不同供试品溶液制备人员和不同供试品溶液制备时间下，各特征峰相对保留时间的RSD在0.4％-6.2％，说明本方法适用性较好。

1.6.5色谱柱耐用性考察

在以上拟定的实验条件基础上，分别对三根不同编号InfinityLab Poroshell120EC-C18(柱长为150mm，内径为3.0mm，粒径为2.7μm))的色谱柱进行考察。进行考察。结果见图9和表4。图9不同色谱柱考察。

表4 色谱柱耐用性考察—特征峰相对保留时间

结果表明，用上述3种色谱柱对样品进行检测，特征峰相对保留时间的RSD在0.1％～1.2％，表明该方法色谱柱耐用性良好。

1.6.6稳定性

按“5供试品溶液的制备考察”结果制备供试品溶液一份，并按“1.4色谱条件与系统适用性试验”结果，分别于0h，2h、4h，8h，16h，24h时进样测定。结果见表5。

表5 24小时稳定性考察—特征峰保留时间

结果表明，其相对应的特征峰保留时间的RSD在0.1％～0.2％，样品溶液在24小时内较稳定。

1.6.7特征峰的确定及对照图谱的建立

1.6.7.1 21批川明参标准汤剂验证结果

按“5供试品溶液的制备考察”结果制备21批标准汤剂的供试品溶液，并按“4色谱条件与系统适用性试验”结果进样测定分析，计算相对保留时间和相对峰面积比值。结果见图10，表6。图10为川明参标准汤剂特征图谱。

(从下到上批号依次为：BT-1、BT-2、BT-3、BT-4、BT-5、BT-6、BT-7、BT-8、BT-9、BT-10、BT-11、BT-12、BT-13、BT-14、BT-15、BT-16、BT-17、BT-18、BT-19、BT-20、BT-21)

表6 21批川明参标准汤剂相对保留时间

根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了10个重复性较好的峰作为特征峰。计算各特征峰与S峰的相对保留时间。最终规定：供试品特征图谱中应呈现10个特征峰，与补骨脂素参照物峰相对应的峰为S峰，计算峰1、峰2、峰3、峰4、峰5、峰6、峰7、峰8、峰9、峰10与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内。规定值为：0.22(峰1)、0.24(峰2)、0.30(峰3)、0.45(峰4)、0.84(峰5)、0.88(峰6)、1.11(峰8)、1.20(峰9)、1.22(峰10)。

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对21批川明参标准汤剂进行合成，建立了川明参标准汤剂特征图谱的对照图谱，见图11。图11为川明参标准汤剂对照特征图谱；峰3：咖啡酸峰，峰7(S)：补骨脂素峰，：峰8：5，8—二甲氧基补骨脂素峰。

实施例2川明参药材、饮片HPLC特征图谱

2.1拟定的色谱条件

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为150mm，内径为3.0mm，粒径为2.7μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为25℃；检测波长为335nm，理论板数按补骨脂素峰计算应不低于5000。

参照物溶液的制备取川明参对照药材约1.5g，置具塞锥形瓶中，加水50ml，煎煮30分钟，离心，取上清液，蒸干，残渣加入50％甲醇10ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取补骨脂素对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含10μg的溶液，作为对照品参照物溶液。

供试品溶液的制备取本品粉末(过三号筛)适量，取约1.5g，加水50ml，煎煮30分钟，离心，取上清液，蒸干，残渣加入50％甲醇10ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.2色谱条件与系统适用性试验

2.2.1波长选择

在“2.1拟定的色谱条件”基础上，利用二极管阵列检测器分别对供试品溶液进行全波段扫描，并分别提取供试品溶液在220nm、250nm、270nm、300nm波长下的色谱图，见图12。图12为川明参药材3D图。

结果表明，在检测波长为335nm时色谱峰信息量较大，故川明参药材特征图谱方法的检测波长最终确定为335nm。

2.2.2流速考察

在“2.1拟定的色谱条件”基础上，分别考察0.2ml/min、0.3ml/min、0.4ml/min三种流速对供试品溶液中色谱峰的分离效果，结果见图13、表7。图13为流速考察结果。

表7流速考察-相对保留时间

结果表明，当流速为0.3ml/min时，色谱峰峰型对称，分离度较好，故流速为0.3ml/min进行后续考察。

2.2.3柱温考察

在“2.1拟定的色谱条件”基础上，分别考察25℃、30℃、35℃三种柱温对供试品溶液中色谱峰的分离效果，结果见图14，表8。图14为柱温考察结果。

表8柱温考察-相对保留时间

图14表明：在25℃的柱温下，色谱峰峰型对称，分离度较好，故选择25℃作为川明参药材特征图谱的测定柱温。

综上所述，川明参药材特征图谱色谱条件与系统适用性试验暂定为:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为150mm，内径为3.0mm，粒径为2.7μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为25℃；检测波长为335nm，理论板数按补骨脂素峰计算应不低于5000。

2.3供试品溶液的制备考察

2.3.1提取溶剂考察

取川明参药材(YC-1)6份，每份约1.0g，置置具塞锥形瓶中，加水50ml，煎煮30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣分别加入甲醇、乙醇、30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、水各10ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按“4色谱条件与系统适用性试验”结果进样测定，结果见图15。图15为提取溶剂考察结果。

结果表明：50％甲醇提取的供试品溶液中色谱峰中峰型和分离度均较好，因此选择50％甲醇作为川明参药材特征图谱测定中供试品溶液制备的提取溶剂。

2.3.2提取方式考察

取川明参药材(YC-1)3份，其中一份加水50ml，煎煮30分钟，滤过，滤液蒸干，加入50％甲醇10ml，分别超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，另外两份分别加入50％甲醇10ml，分别超声处理(功率600W，频率40kHz)和煎煮30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按“2.2色谱条件与系统适用性试验”结果进样测定，结果见图16。图16为提取方法考察。

结果得知，回流提取和超声提取的最终效果无显著差异，但煎煮中出现的峰较多，故选择煎煮作为川明参药材特征图谱测定中供试品溶液制备的提取方式。

2.3.3提取时间考察

取川明参药材(YC-1)3份，每份约1.5g，置具塞锥形瓶中，加水50ml，煎煮30分钟，滤过，滤液蒸干，加入50％甲醇10ml，分别超声(功率600W，频率40kHz)处理20分钟、30分钟、40分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按“2.2色谱条件与系统适用性试验”结果进样测定，结果见图17。图17为提取时间考察。

从图17中可以看出，超声提取时间为20分钟、30分钟、40分钟时，色谱图中峰分离无明显差异，为保证提取充分，故选择提取时间为30分钟作为川明参药材特征图谱测定中供试品溶液制备的提取时间。

综上所述，川明参药材特征图谱供试品溶液的制备方法确定为：取本品粉末(过三号筛)适量，取约1.5g，置具塞锥形瓶中，加水50ml，煎煮30分钟，离心，取上清液，蒸干，残渣加入50％甲醇10ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4方法学考察

2.4.1色谱峰指认

照品溶液的制备：取咖啡酸、补骨脂素、5，8-二甲氧基补骨脂素对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含10μg的溶液，作为对照品溶液。

对照药材溶液的制备：取川明参对照药材约1.5g，置具塞锥形瓶中，加水50ml，煎煮30分钟，离心，取上清液，蒸干，残渣加入50％甲醇10ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。

供试品溶液的制备：按“2.3供试品溶液的制备考察”结果制备川明参药材供试品溶液。

阴性对照溶液的制备：按“2.3供试品溶液的制备考察”结果制备缺川明参药材的阴性对照溶液。按“2.2色谱条件与系统适用性试验”结果进样测定，结果见图18。图18色谱峰指认。由图18可知，共指出10个特征峰，其中与峰3相对应的峰为咖啡酸峰，与峰7相对应的峰为补骨脂素峰，与峰8相对应的峰为5，8—二甲氧基补骨脂素峰。

2.4.2精密度试验

取川明参药材(YC-1)按“2.3供试品溶液的制备考察”结果制备供试品溶液，按“2.2色谱条件与系统适用性试验”结果进样测定，连续6次，每次5μl，计算各特征峰的相对保留时间及相对峰面积。结果见表9。

表9精密度考察-保留时间

结果表明，各特征峰保留时间的RSD在0.02％-0.16％，说明该仪器精密度良好。

2.4.3重复性考察

取川明参药材(YC-1)6份，按“2.3供试品溶液的制备考察”结果制备供试品溶液，按“2.2色谱条件与系统适用性试验”结果进样测定。结果见表10。

表10重复性考察-相对保留时间

结果表明，各特征峰相对保留时间的RSD在0.0％-0.1％，说明该方法重复性良好。

2.4.4中间精密度考察

取同一供试品(批号：YC-1)由不同人员(A、B)在不同时间(Ⅰ、Ⅱ)下按“5供试品溶液的制备考察”结果制备供试品溶液，并按“2.2色谱条件与系统适用性试验”结果分别在仪器a、b上进样测定，结果见表11。

表11中间精密度-相对保留时间

结果可知，不同供试品溶液制备人员和不同供试品溶液制备时间下，各特征峰相对保留时间的RSD在0.4％-6.3％，说明本方法适用性较好。

2.4.5色谱柱耐用性考察

在以上实验条件基础上，分别对三根不同编号Agilent InfinityLab Poroshell120EC-C18(柱长为150mm，内径为3.0mm，粒径为2.7μm)的色谱柱进行考察，结果见图19、表12。图19色谱柱耐用性考察。

表12 色谱柱耐用性考察-相对保留时间比值

结果表明，用上述3根色谱柱对样品进行检测时，各特征峰相对保留时间的RSD为0.1％-1.2％，说明本方法对不同色谱柱耐用性较好。

2.4.6稳定性

按“2.3供试品溶液的制备考察”结果制备供试品溶液一份，并按“2.2色谱条件与系统适用性试验”结果，分别于0h，2h，4h，8h，16h，24h时进样测定。结果见表13。

表13 稳定性考察-保留时间

结果表明，各特征峰保留时间的RSD在0.01％～0.19％，说明供试品溶液的稳定性良好，在24小时内可供检测。

2.4.7特征峰的确定及对照图谱的建立

2.4.7.1 21批川明参药材验证结果

按“5供试品溶液的制备考察”结果制备21批药材的供试品溶液，并按“4色谱条件与系统适用性试验”结果进样测定分析，计算相对保留时间和相对峰面积比值。结果见图20，表14。图20-1川明参药材特征图谱(从下到上批号依次为：YC-1、YC-2、YC-3、YC-4、YC-5、YC-6、YC-7、YC-8、YC-9、YC-10、对照药材)；图20-2川明参药材特征图谱(从下到上批号依次为：YC-11、YC-12、YC-13、YC-14、YC-15、YC-16、YC-17、YC-18、YC-19、YC-20、YC-21、对照药材)。

表14 21批川明参药材相对保留时间

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根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出共有峰相对较高的原则，共选择了10个重复性较好的峰作为特征峰。21批次川明参药材10个特征峰相对保留时间RSD在0.0％～0.1％，均小于10％。

最终规定：供试品特征图谱中应呈现10个特征峰，并应与对照药材参照物中的10个特征峰保留时间相对应，其中与补骨脂素参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内。规定值为：0.22(峰1)、0.24(峰2)、0.30(峰3)、0.45(峰4)、0.84(峰5)、0.88(峰6)、1.11(峰8)、1.20(峰9)1.22(峰10)。

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对21批川明参药材进行合成，建立了川明参药材特征图谱的对照图谱。见图21-1。图21-1川明参药材对照特征图谱；峰3：咖啡酸峰，峰7(S)：补骨脂素峰，峰8：5，8—二甲氧基补骨脂素峰。建立了川明参饮片特征图谱的对照图谱。如图21-2；川明参饮片对照特征图谱；峰3：咖啡酸峰，峰7(S)：补骨脂素峰，峰8：5，8—二甲氧基补骨脂素峰。

2.4.7.2 21批川明参饮片验证结果

按“2.3供试品溶液的制备考察”结果制备21批药材的供试品溶液，并按“2.2色谱条件与系统适用性试验”结果进样测定分析，计算相对保留时间和相对峰面积比值。结果见图22、23，表15。图22为川明参饮片特征图谱。

(从下到上批号依次为：YP-1、YP-2、YP-3、YP-4、YP-5、YP-6、YP-7、YP-8、YP-9、YP-10、对照药材)；图23为川明参饮片特征图谱；从下到上批号依次为：YP-11、YP-12、YP-13、YP-14、YP-15、YP-16、YP-17、YP-18、YP-19、YP-20、YP-21、对照药材)。

表15 21批川明参饮片相对保留时间

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根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出共有峰峰相对较高的原则，共选择了10个重复性较好的峰作为特征峰。结果表明，21批次川明参饮片10个特征峰相对保留时间RSD在0.1％～1.4％，均小于2.0％。

最终规定：供试品特征图谱中应呈现10个特征峰，并应与对照药材参照物中的10个特征峰保留时间相对应，其中与补骨脂素峰参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内。规定值为：0.22(峰1)、0.24(峰2)、0.30(峰3)、0.45(峰4)、0.84(峰5)、0.88(峰6)、1.11(峰8)、1.20(峰9)、1.22(峰10)。

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对21批川明参饮片进行合成，建立了川明参饮片特征图谱的对照图谱。

2.5川明参药材、饮片特征图谱方法确定

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为150mm，内径为3.0mm，粒径为2.7μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为25℃；检测波长为335nm，理论板数按补骨脂素峰计算应不低于5000。

参照物溶液的制备取川明参对照药材约1.5g，置具塞锥形瓶中，加水50ml，煎煮30分钟，离心，取上清液，蒸干，残渣加入50％甲醇10ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取补骨脂素对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含10μg的溶液，作为对照品参照物溶液。

供试品溶液的制备取本品粉末(过三号筛)适量，取约1.5g，加水50ml，煎煮30分钟，离心，取上清液，蒸干，残渣加入50％甲醇10ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

实施例3川明参配方颗粒HPLC特征图谱

3.1拟定的色谱条件

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为150mm，内径为3.0mm，粒径为2.7μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3ml；柱温为25℃；检测波长为335nm。

参照物溶液的制备取川明参对照药材1.5g，置于锥形瓶中，加水50ml，煎煮30分钟，离心，取上清液，蒸干，残渣加50％甲醇溶液10ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取补骨脂素对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含10μg的溶液，作为对照品参照物溶液。

供试品溶液的制备取本品适量，研细，取0.5g，加50％甲醇25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

3.2色谱条件与系统适用性试验

3.2.1波长选择

在“3.1拟定的色谱条件”基础上，利用二极管阵列检测器分别对供试品溶液进行全波段扫描，并分别提取供试品溶液在240nm、280nm、330nm、335nm、350nm波长下的色谱图。见图24、25。图24川明参成品紫外吸收光谱图；图25川明参配方颗粒不同波长色谱图；结果表明，在检测波长为335nm时色谱峰信息量较大、分离度较好，色谱图基线更平稳，故检测波长确定为335nm。

3.2.2流速考察

在“3.1拟定的色谱条件”基础上，分别考察0.2ml/min、0.3ml/min、0.4ml/min三种流速对供试品溶液中色谱峰的分离效果，结果见图26。图26流速考察；结果表明，流速在0.3ml/min时，色谱图峰形较好，各个特征峰分布适中。故流速确定为0.3ml/min。

3.2.3柱温考察

在“3.1拟定的色谱条件”基础上，分别考察25℃、30℃、35℃四种柱温对供试品溶液中色谱峰的分离效果，结果见图27。图27柱温考察色谱图。

柱温考察结果表明，当柱温为25℃时，色谱图峰形均较为对称，分离度均好，故最终确定25℃作为川明参配方颗粒特征图谱方法的柱温。

综上所述，川明参配方颗粒特征图谱色谱条件与系统适应性试验确定为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为150mm，内径为3.0mm，粒径为2.7μm)以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱：柱温为25℃；流速为每分钟0.3ml；检测波长为335nm。

3.3供试品溶液的制备考察

3.3.1提取溶剂考察

取川明参配方颗粒(KL-1)适量，研细，取约0.5g，分别加入水、乙醇、甲醇、70％甲醇、50％甲醇、30％甲醇各25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按“3.2色谱条件与系统适用性试验”结果进样测定，结果见图28。图28提取溶剂考察；结果表明，当50％甲醇作为提取溶剂所得的色谱峰信息量大，分离度好，故选用50％甲醇作为提取溶剂。

3.3.2提取方式考察

取川明参配方颗粒(KL-1)适量，研细，约0.5g，加入50％甲醇25ml进行提取，分别回流、超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得按“3.2色谱条件与系统适用性试验”结果进样测定，结果见图29。图29提取方法考察；结果表明，对供试品分别进行超声提取与回流提取时色谱峰信息量无较大差异。因超声提取操作更为简便，故供试品提取方法确定为超声提取。

3.3.3提取时间考察

取川明参配方颗粒(KL-1)适量，研细，取3份，每份约0.5g，加入50％甲醇25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)，分别对供试品提取时间为20分钟、30分钟、40分钟时进行考察，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按“3.2色谱条件与系统适用性试验”结果进样测定，结果见图30。图30提取时间考察；结果表明，在提取时间为20分钟时，即可提取完成，但为了保证能提取更加充分，故供试品提取时间确定为30分钟。

综上所述，川明参配方颗粒特征图谱供试品溶液的制备方法确定为：取本品适量，研细，取0.5g，加50％甲醇25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3.4方法学考察

3.4.1色谱峰指认

对照药材溶液的制备：取川明参对照药材1.5g，置于锥形瓶中，加水50ml，煎煮30分钟，离心，取上清液，蒸干，残渣加50％甲醇溶液10ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。

参照物溶液的制备：分别取咖啡酸、补骨脂素、5，8-二甲氧基补骨脂素对照品适量，精密称定，分别加50％甲醇各制成每1ml含10μg的溶液，作为对照品参照物溶液。

供试品溶液的制备：按“3.3供试品溶液的制备考察”结果制备川明参配方颗粒供试品溶液。

阴性对照溶液的制备：按“3.3供试品溶液的制备考察”结果制备缺川明参配方颗粒的阴性对照溶液。按“3.2色谱条件与系统适用性试验”结果进样测定，结果见图31。图31为色谱峰指认。

3.4.2精密度试验

取川明参配方颗粒(KL-1)按“3.3供试品溶液的制备考察”结果制备供试品溶液，按“3.2色谱条件与系统适用性试验”结果进样测定，连续6次，每次5μl，计算各特征峰的相对保留时间。结果见表16。

表16精密度考察-保留时间

结果表明，各特征峰保留时间RSD值在0.1％-0.2％之间，表明该仪器精密度良好。

3.4.3重复性考察

取川明参配方颗粒(KL-1)6份，按“3.3供试品溶液的制备考察”结果制备供试品溶液，按“3.2色谱条件与系统适用性试验”结果进样测定。结果见表17。

表17重复性考察-相对保留时间

结果表明，各特征峰相对保留时间RSD％值在0.1％-0.2％之间，表明该方法重复性良好。

3.4.4中间精密度考察

取同一供试品(批号：KL-1)由不同人员(A、B)在不同时间(Ⅰ、Ⅱ)下按“3.3供试品溶液的制备考察”结果制备供试品溶液，并按“3.2色谱条件与系统适用性试验”结果分别在仪器a、b上进样测定，结果见表18。

表18人员和时间考察-相对保留时间

结果表明，由不同的人员在不同的时间对同一个样品进行测定，各特征峰相对保留时间RSD％值在0.4％-6.2％之间表明该方法重复性好。

3.4.5色谱柱耐用性考察

在以上实验条件基础上，分别三根不同编号InfinityLab Poroshell 120EC-C18(柱长为150mm，内径为3.0mm，粒径为2.7μm))的色谱柱进行考察结果见表19，图32。图32不同色谱柱。

表19谱柱耐用性考察-相对保留时间比值

由上表可知，用上述3种色谱柱对样品进行检测，考察各特征峰相对保留时间RSD％值在0.1％-1.3％之间，表明该方法色谱柱耐用性较好。

3.4.6稳定性

按“3.3供试品溶液的制备考察”结果制备供试品溶液一份，并按“3.2色谱条件与系统适用性试验”结果，分别于0h，2h，4h，8h，12h，24h时进样测定。结果见表20。

表20稳定性考察-保留时间

结果表明，其相对应的特征峰保留时间的RSD为0.1～0.2％表明样品溶液在24小时内稳定。

3.5特征峰的确定及对照图谱的建立

3.5.1 3批川明参配方颗粒验证结果

按“3.3供试品溶液的制备考察”结果制备3批配方颗粒的供试品溶液，并按“3.2色谱条件与系统适用性试验”结果进样测定分析，计算相对保留时间。结果见图11，表21，图33。图33 3批川明参配方颗粒特征图谱验证图。

表213批川明参配方颗粒相对保留时间

根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了10个重复性较好的峰作为特征峰。与补骨脂素参照物峰相应的为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间。其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.22(峰1)、0.24(峰2)、0.30(峰3)、0.45(峰4)、0.84(峰5)、0.88(峰6)、1.11(峰8)、1.21(峰9)1.22(峰10)。

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对3批川明参配方颗粒进行合成，建立了川明参配方颗粒特征图谱的对照图谱。图34为川明参配方颗粒对照特征图谱，其中峰3：咖啡酸；峰7(S)：补骨脂素；峰8：5，8-二甲氧基补骨脂素。

3.6川明参配方颗粒特征图谱方法确定

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为150mm，内径为3.0mm，粒径为2.7μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3ml；柱温为25℃；检测波长为335nm。理论板数按补骨脂素峰计算应不低于5000。

参照物溶液的制备取川明参对照药材1.5g，加水50ml，煎煮30分钟，放冷，离心，取上清液，蒸干，残渣加50％甲醇10ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取补骨脂素对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含10μg的溶液，作为对照品参照物溶液。

供试品溶液的制备取本品适量，研细，取0.5g，加50％甲醇25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

对比例1

结果如图35所示，图35为当流动相均为乙腈-0.1％磷酸，对比例1、比例2的梯度改变条件下和本专利所确定的梯度的对比图，由图35可以看出对比例1中，所有物质在2分钟前全部堆积在一起，无明显特征峰。对比例2中出现了四个明显特征峰，但整体基线波动较大。本专利所选方法，基线较为平坦，有十个分离度较好的峰可以作为特征峰。

对比例3

在流动相梯度不改变的情况下，选择不同的流动相进行考察，分别选择乙腈-0.1％磷酸、乙腈-0.1％冰乙酸、甲醇-0.1％磷酸、甲醇-0.1％冰乙酸进行考察。结果如图36所示，由图可知，使用甲醇-0.1％磷酸、甲醇-0.1％冰乙酸作为流动相，10个特征峰中均有不同程度的丢失；乙腈-0.1％磷酸、乙腈-0.1％冰乙酸能够较好将10个特征峰分离，但由于冰乙酸易挥发，相较于磷酸的稳定性较差，所以最后选择乙腈-0.1％磷酸作为流动相。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。