结直肠癌或腺瘤的诊断试剂盒
文献发布时间：2023-06-19 16:11:11
技术领域
本发明涉及肿瘤诊断技术领域，具体而言，涉及一种结直肠癌或腺瘤的诊断试剂盒。
背景技术
结直肠癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，若早期发现，其五年生存率可高达90％，若发现较晚，其五年生存率则不足10％。结直肠癌通常是由良性的癌前息肉变化发展而来，这些息肉是局部生长或肠粘膜内异常细胞的聚集突入肠腔。随着时间流逝，这些息肉中的分裂细胞可能积累足够多的遗传变化，从而获得入侵肠壁的能力，这便是结直肠癌开始形成的标志，最终它们可能会扩散到局部淋巴结和远处的转移部位。幸运的是，只有一小部分息肉最终能演变成癌症，对于那些已经演变成癌症的，其发展过程也通常需要几年甚至十年，因此可以早期检测降低结直肠癌的发病率。
潜在的恶性息肉主要有两种类型：腺瘤和无柄锯齿状息肉，这两种类型与发展为结直肠癌的风险不同。通常，大多数腺瘤具有小而圆形的非典型腺体的管状组织学特征，但是随着腺瘤的生长，通常会形成长丝状结构的区域，在病理报告中被描述为绒毛状或微管性。顾名思义，腺瘤的特征在于发育异常(纤维化程度低和结构异型)。肾小管腺和绒毛腺瘤，尤其是绒毛含量为25％的腺瘤，通常尺寸较大，具有更大的隐窝性癌细胞的潜力，相反，无蒂锯齿状息肉是平坦的，像地毯一样。无蒂锯齿状息肉包括无柄锯齿腺瘤，传统的锯齿状腺瘤和混合性息肉，所有这些都与结直肠癌的发展有关。随着息肉大小的增加，腺瘤发展成结直肠癌的风险也增加了，其中60％–70％的结直肠癌从腺瘤发展而来。其余的25％至35％的CRC从无蒂锯齿状息肉发育而来。
从上述内容可以得知，提高腺瘤的检出率对于降低结直肠癌的发病率和死亡率极为重要，现有技术中公开的检测标记物大多对结直肠癌和腺瘤的检出率不高，灵敏度和特异性都比较低。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种结直肠癌或腺瘤的诊断试剂盒。本发明提供的试剂盒以C9orf50基因作为标志物，通过检测其甲基化对结直肠癌或腺瘤进行诊断或辅助诊断，具有较高的灵敏度和特异性；本发明为结直肠癌或腺瘤的诊断提供一种新的思路。
本发明是这样实现的：
一方面，本发明提供一种用于结直肠癌或腺瘤的诊断或辅助诊断的试剂盒，其含有检测目标基因甲基化的试剂，所述目标基因为C9orf50基因。
以GRCh38.p13为参考基因组，C9orf50基因位于人9号染色体的负义链上，具体位置为129,612,225bp-129,622,275bp，本文中提到的位点或区域的位置均是以GRCh38.p13为参考。
本发明发现，以C9orf50基因作为标志物，通过检测其甲基化的发生可以对结直肠癌或腺瘤进行诊断或辅助诊断，具有较高的灵敏度和特异性，有效地提高结直肠癌或腺瘤的检出率。
在可选的实施方案中，所述试剂所检测的目标区域为C9orf50基因的chr9:129619882-129620879的全长区域或其中的部分区域。
以C9orf50基因上不同区域的甲基化进行诊断，具有不同的灵敏度和特异性，以chr9:129619882-129620879的全长区域或其中的部分区域进行结直肠癌或腺瘤诊断，可以提高灵敏度和特异性。
在可选的实施方案中，所述目标区域选自如下区域(1)-(5)中任意一种或几种的组合；
区域(1)：chr9:129620154-129620400的全长或其部分区域；
区域(2)：Chr9:129620272-129620431的全长或其部分区域；
区域(3)：Chr9:129620551-129620722的全长或其部分区域；
区域(4)：Chr9:129620328-129620513的全长或其部分区域；
区域(5)：Chr9:129620018-129620103的全长或其部分区域。
以上述区域(1)-(5)或其部分区域作为甲基化的检测区域，具有更高的灵敏性和特异性，有利于提高诊断结果的准确性。
在可选的实施方案中，所述目标区域为chr9:129620154-129620400区域的正链、Chr9:129620272-129620431区域的正链、Chr9:129620551-129620722区域的正链、Chr9:129620328-129620513区域的负链或Chr9:129620018-129620103区域的负链。
在可选的实施方案中，所述目标区域为chr9:129620154-129620400区域正链上的Chr9:129620154、Chr9:129620166、Chr9:129620184、Chr9:129620186、Chr9:129620192、Chr9:129620386、Chr9:129620395、Chr9:129620397和Chr9:129620400位点。
在可选的实施方案中，所述目标区域为Chr9:129620272-129620431区域正链上的Chr9:129620282、Chr9:129620294、Chr9:129620355、Chr9:129620358、Chr9:129620367、Chr9:129620410和Chr9:129620427位点。
在可选的实施方案中，所述目标区域为Chr9:129620551-129620722区域正链上的Chr9:129620555、Chr9:129620561、Chr9:129620564、Chr9:129620598、Chr9:129620609、Chr9:129620611、Chr9:129620613、Chr9:129620709、Chr9:129620714和Chr9:129620717位点。
在可选的实施方案中，所述目标区域为Chr9:129620328-129620513区域负链上的Chr9:129620512、Chr9:129620502、Chr9:129620499、Chr9:129620491、Chr9:129620486、Chr9:129620484、Chr9:129620465、Chr9:129620345、Chr9:129620342、Chr9:129620340和Chr9:129620332位点。
在可选的实施方案中，所述目标区域为Chr9:129620018-129620103区域负链上的Chr9:129620089、Chr9:129620086、Chr9:129620078、Chr9:129620057、Chr9:129620055、Chr9:129620035和Chr9:129620024位点。
基于本发明公开的内容，本领域技术人员可以采用任何本领域熟知的技术对上述位点中的一个或多个的组合的甲基化进行检测，以对结直肠癌或腺瘤进行诊断，无论采用何种技术，其都是属于本发明的保护范围。
在可选的实施方案中，所述试剂通过如下方法中的一种或几种实现对所述目标基因甲基化的检测：
甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量法。
基于本发明的公开内容，本领域技术人员容易想到采用多种方法和相应的试剂检测目标区域的甲基化。并不限于上述的检测方法，采用其他方法和相应的试剂检测也属于本发明的保护范围。
在可选的实施方案中，所述试剂通过甲基化特异性PCR检测所述目标基因的甲基化。
在可选的实施方案中，所述试剂包括如下核酸组合中的一种或几种的组合：
所述试剂包括如下核酸组合中的一种或几种的组合：
包括SEQ ID NO.4-6所示核苷酸的核酸组合；该核酸组合可检测上述区域(1)的甲基化。
包括SEQ ID NO.7-9所示核苷酸的核酸组合；该核酸组合可检测上述区域(2)的甲基化。
包括SEQ ID NO.13-15所示核苷酸的核酸组合；该核酸组合可检测上述区域(3)的甲基化。
包括SEQ ID NO.22-24所示核苷酸的核酸组合；该核酸组合可检测上述区域(4)的甲基化。
包括SEQ ID NO.28-30所示核苷酸的核酸组合；该核酸组合可检测上述区域(5)的甲基化。
在本发明公开了检测区域的前提下，本领域技术人员也可以设计出其他本发明未记载的检测目标区域甲基化的引物和探针，用于C9orf50基因的甲基化检测，以对结直肠癌或腺瘤进行诊断或辅助诊断，这类引物和/探针的设计不需要付出创造性的劳动，其也是属于本发明的保护范围。
在可选的实施方案中，所述试剂盒检测的样本选自血浆、血清、粪便和组织中任意一种。本发明提供的试剂盒可以检测包括但不限于从血浆、血清、粪便和组织等样本中提取的目标基因的甲基化情况。
另一方面，本发明提供检测目标基因甲基化的试剂在制备用于结直肠癌或腺瘤的诊断或辅助诊断的试剂盒中的应用，所述目标基因为C9orf50基因。
在可选的实施方案中，所述试剂所检测的目标区域为C9orf50基因的chr9:129619882-129620879的全长区域或其中的部分区域。
在可选的实施方案中，所述目标区域选自如下区域(1)-(5)中任意一种或几种的组合；
区域(1)：chr9:129620154-129620400的全长或其部分区域；
区域(2)：Chr9:129620272-129620431的全长或其部分区域；
区域(3)：Chr9:129620551-129620722的全长或其部分区域；
区域(4)：Chr9:129620328-129620513的全长或其部分区域；
区域(5)：Chr9:129620018-129620103的全长或其部分区域。
在可选的实施方案中，所述目标区域为chr9:129620154-129620400区域的正链、Chr9:129620272-129620431区域的正链、Chr9:129620551-129620722区域的正链、Chr9:129620328-129620513区域的负链或Chr9:129620018-129620103区域的负链。
在可选的实施方案中，所述目标区域为chr9:129620154-129620400区域正链上的Chr9:129620154、Chr9:129620166、Chr9:129620184、Chr9:129620186、Chr9:129620192、Chr9:129620386、Chr9:129620395、Chr9:129620397和Chr9:129620400位点。
在可选的实施方案中，所述目标区域为Chr9:129620272-129620431区域正链上的Chr9:129620282、Chr9:129620294、Chr9:129620355、Chr9:129620358、Chr9:129620367、Chr9:129620410和Chr9:129620427位点。
在可选的实施方案中，所述目标区域为Chr9:129620551-129620722区域正链上的Chr9:129620555、Chr9:129620561、Chr9:129620564、Chr9:129620598、Chr9:129620609、Chr9:129620611、Chr9:129620613、Chr9:129620709、Chr9:129620714和Chr9:129620717位点。
在可选的实施方案中，所述目标区域为Chr9:129620328-129620513区域负链上的Chr9:129620512、Chr9:129620502、Chr9:129620499、Chr9:129620491、Chr9:129620486、Chr9:129620484、Chr9:129620465、Chr9:129620345、Chr9:129620342、Chr9:129620340和Chr9:129620332位点。
在可选的实施方案中，所述目标区域为Chr9:129620018-129620103区域负链上的Chr9:129620089、Chr9:129620086、Chr9:129620078、Chr9:129620057、Chr9:129620055、Chr9:129620035和Chr9:129620024位点。
在可选的实施方案中，所述试剂通过如下方法中的一种或几种实现对所述目标基因甲基化的检测：
甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量法。
在可选的实施方案中，所述试剂通过甲基化特异性PCR检测所述目标基因的甲基化。
在可选的实施方案中，所述试剂包括如下核酸组合中的一种或几种的组合：
包括SEQ ID NO.4-6所示核苷酸的核酸组合；
包括SEQ ID NO.7-9所示核苷酸的核酸组合；
包括SEQ ID NO.13-15所示核苷酸的核酸组合；
包括SEQ ID NO.22-24所示核苷酸的核酸组合；
包括SEQ ID NO.28-30所示核苷酸的核酸组合。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为区域a、区域b、区域c、区域d、区域e和区域f区分结直肠腺瘤样本和正常样本的ROC曲线；
图2为区域g、区域h、区域i和区域j区分结直肠腺瘤样本和正常样本的ROC曲线；
图3为区域a、区域b、区域c、区域d、区域e和区域f区分结直肠癌症样本和正常样本的ROC曲线；
图4为区域g、区域h、区域i和区域j区分结直肠癌症样本和正常样本的ROC曲线。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供用于结直肠癌或腺瘤的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合1，核酸组合1包括SEQ ID NO.1-3所示的核苷酸，具体序列表1。该核苷酸组合1可检测C9orf50基因上chr9:129619882-129620048区域正链(区域a)的甲基化；
区域a正链碱基序列如下：
TAGTCATGTGGCCTCGGGGTGATGGCAGACCAGCCCTCAAGGACGGGTTGCGAGGGCTCTGAGATACTCAGCTAACATTAGCATCCTTCTAGCCTGGGTGGTGGGGTGGTGGGTGCGGGGACACAAGGGACCACCCCCCACCGGAAATGACTCGGGCCCGCCCCCCG。
SEQ ID NO.1-3所示的核苷酸可检测位于该区域正链上Chr9:129619896、Chr9:129619925、Chr9:129619932、Chr9:129620034、Chr9:129620040和Chr9:129620047位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例2
本实施例提供用于结直肠癌或腺瘤的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合2，核酸组合2包括SEQ ID NO.4-6所示的核苷酸，具体序列表1。该核苷酸组合2可检测C9orf50基因上chr9:129620154-129620400区域正链(区域b)的甲基化。
区域b正链的碱基序列如下：
CGCCCAAGAAGTCGGGGTCCTCCCTGGCCACGCGCCTCCGGGGGCGCTCGCGCTCTCCAGGCCCTGGCTGCCTGGGCGCCGATTCCCGGGACGCGCCGGCCGACAGCAGGGGAGGCGGCAGCAGGGACCGCAGCAGCCCCCGCTTCCGCACGGCCCGCCGGGTCGCGGTGAGCAAGGCGGGCAGGCGCGGCGGGAGGCGTCCGACGCCCACCCCGGGCTTGGCGTCCCCTTCCGGCCACCACGCGGC。
SEQ ID NO.4-6所示的核苷酸可检测位于该区域正链上Chr9:129620154、Chr9:129620166、Chr9:129620184、Chr9:129620186、Chr9:129620192、Chr9:129620386、Chr9:129620395、Chr9:129620397和Chr9:129620400位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例3
本实施例提供用于结直肠癌或腺瘤的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合3，核酸组合3包括SEQ ID NO.7-9所示的核苷酸，具体序列表1。该核苷酸组合3可检测C9orf50基因上Chr9:129620272-129620431区域正链(区域c)的甲基化。
区域c正链的碱基序列如下：
CAGCAGGGACCGCAGCAGCCCCCGCTTCCGCACGGCCCGCCGGGTCGCGGTGAGCAAGGCGGGCAGGCGCGGCGGGAGGCGTCCGACGCCCACCCCGGGCTTGGCGTCCCCTTCCGGCCACCACGCGGCGCCGCCCCCCGGGATCCTCCAGTCCCCGGAG。
SEQ ID NO.7-9所示的核苷酸可检测位于该区域正链上Chr9:129620282、Chr9:129620294、Chr9:129620355、Chr9:129620358、Chr9:129620367、Chr9:129620410和Chr9:129620427位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例4
本实施例提供用于结直肠癌或腺瘤的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合4，核酸组合4包括SEQ ID NO.10-12所示的核苷酸，具体序列表1。该核苷酸组合4可检测C9orf50基因上Chr9:129620469-129620541区域正链(区域d)的甲基化。
区域d正链的碱基序列如下：
TCAGCTTGGGCAGCCGCGGGTCGCTGCTGCGTCGGAAGTCTCCGTCGCCAGGGAGCCCCTTGGGCGCCAGGTC。
SEQ ID NO.10-12所示的核苷酸可检测位于该区域正链上Chr9:129620483、Chr9:129620485、Chr9:129620498、Chr9:129620501、Chr9:129620511、Chr9:129620514和Chr9:129620533位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例5
本实施例提供用于结直肠癌或腺瘤的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合5，核酸组合5包括SEQ ID NO.13-15所示的核苷酸，具体序列表1。该核苷酸组合5可检测C9orf50基因上Chr9:129620551-129620722区域正链(区域e)的甲基化。
区域e正链的碱基序列如下：
TGGGCGAAGTCGACGCCAGAACATGCTTGGCCCCGCACTCAGCTCACCGCACCCTCAGCGCGCGTGGGTGGGGGGCGCCGGCTGAGGTGGGGAGGGCATAGTCCAGCCCCAGGCCATAGTGCCCCGGGCGGGGCAGCGCGGTGCGGGGTGAACGCCACCGGCCCGGCGGACA。
SEQ ID NO.13-15所示的核苷酸可检测位于该区域正链上Chr9:129620555、Chr9:129620561、Chr9:129620564、Chr9:129620598、Chr9:129620609、Chr9:129620611、Chr9:129620613、Chr9:129620709、Chr9:129620714和Chr9:129620717位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例6
本实施例提供用于结直肠癌或腺瘤的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合6，核酸组合6包括SEQ ID NO.16-18所示的核苷酸，具体序列表1。该核苷酸组合6可检测C9orf50基因上Chr9:129620729-129620879区域正链(区域f)的甲基化。
区域f正链的碱基序列如下：
GGCTTCAGGCGAGAGCTCCCAGAGCCTCTGTTTCCTCACCTGAAAAATGGTGACAGCAAGAGTAGCCAACTTTGGGGGTTGCTGTGACGTTTAAATGAGCAAGTACATGCCAGTCTTAGAACAGCAAGCTCGGTACAGTGCCAGGCACGCTGG。
SEQ ID NO.16-18所示的核苷酸可检测位于该区域正链上Chr9:129620738、Chr9:129620816、Chr9:129620859和Chr9:129620876位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例7
本实施例提供用于结直肠癌或腺瘤的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合7，核酸组合7包括SEQ ID NO.19-21所示的核苷酸，具体序列表1。该核苷酸组合7可检测C9orf50基因上Chr9:129620550-129620735区域负链(区域g)的甲基化。
区域g负链的碱基序列如下：
TGAAGCCACTCGCTGTCCGCCGGGCCGGTGGCGTTCACCCCGCACCGCGCTGCCCCGCCCGGGGCACTATGGCCTGGGGCTGGACTATGCCCTCCCCACCTCAGCCGGCGCCCCCCACCCACGCGCGCTGAGGGTGCGGTGAGCTGAGTGCGGGGCCAAGCATGTTCTGGCGTCGACTTCGCCCAG。
SEQ ID NO.19-21所示的核苷酸可检测位于该区域负链上Chr9:129620725、Chr9:129620718、Chr9:129620715、Chr9:129620695、Chr9:129620690、Chr9:129620688、Chr9:129620680、Chr9:129620565、Chr9:129620562和Chr9:129620556位置的胞嘧啶的甲基化。
实施例8
本实施例提供用于结直肠癌或腺瘤的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合8，核酸组合8包括SEQ ID NO.22-24所示的核苷酸，具体序列表1。该核苷酸组合8可检测C9orf50基因上Chr9:129620328-129620513区域负链(区域h)的甲基化。
区域h负链的碱基序列如下：
ACGGAGACTTCCGACGCAGCAGCGACCCGCGGCTGCCCAAGCTGACCCCGCCCGCGCTCCGAGCGGCTCTGGGCGCGCGGGGCTCCGGGGACTGGAGGATCCCGGGGGGCGGCGCCGCGTGGTGGCCGGAAGGGGACGCCAAGCCCGGGGTGGGCGTCGGACGCCTCCCGCCGCGCCTGCCCGCCT。
SEQ ID NO.22-24所示的核苷酸可检测位于该区域负链上Chr9:129620512、Chr9:129620502、Chr9:129620499、Chr9:129620491、Chr9:129620486、Chr9:129620484、Chr9:129620465、Chr9:129620345、Chr9:129620342、Chr9:129620340和Chr9:129620332位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例9
本实施例提供用于结直肠癌或腺瘤的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合9，核酸组合9包括SEQ ID NO.25-27所示的核苷酸，具体序列表1。该核苷酸组合9可检测C9orf50基因上Chr9:129620165-129620291区域负链(区域i)的甲基化。
区域i负链的碱基序列如下：
GGCTGCTGCGGTCCCTGCTGCCGCCTCCCCTGCTGTCGGCCGGCGCGTCCCGGGAATCGGCGCCCAGGCAGCCAGGGCCTGGAGAGCGCGAGCGCCCCCGGAGGCGCGTGGCCAGGGAGGACCCCGA。
SEQ ID NO.25-27所示的核苷酸可检测位于该区域负链上Chr9:129620283、Chr9:129620205、Chr9:129620185和Chr9:129620167位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例10
本实施例提供用于结直肠癌或腺瘤的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合10，核酸组合10包括SEQ ID NO.28-30所示的核苷酸，具体序列表1。该核苷酸组合10可检测C9orf50基因上Chr9:129620018-129620103区域负链(区域j)的甲基化。
区域j负链的碱基序列如下：
CTCCAGGAGAAGTGCGCCGAGGAGCCGGAGCCACTGAGTGAGGCCCCGCGGGGCCCGGGGGGCGGGCCCGAGTCATTTCCGGTGGG。
SEQ ID NO.28-30所示的核苷酸可检测位于该区域负链上Chr9:129620089、Chr9:129620086、Chr9:129620078、Chr9:129620057、Chr9:129620055、Chr9:129620035和Chr9:129620024位置上胞嘧啶的甲基化。
表1
实施例11
本实施例提供使用实施例1-10任意一种试剂盒进行结直肠癌或腺瘤癌诊断的方法，其包括如下步骤：
1、DNA模板的提取：
所用样本是血液样本，采用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血清/血浆游离DNA提取试剂盒(DP709)进行血浆cfDNA提取，具体操作参见试剂盒说明书。
2、亚硫酸盐的转化
所用核酸转化试剂盒为ZYMO RESEARCH的EZ DNA Methylation-Gold TM Kit，具体实验操作参见试剂盒说明书。
3、PCR反应
以β-actin作为内参基因，以PCR反应体系如表2所示。β-actin作为内参基因，其中β-actin上游引物为：taggttagacgggggatatgtag(SEQ ID NO.31)；β-actin下游引物为：cacaataaatctaaacaaactcccc(SEQ ID NO.32)；β-actin探针为：gtgtgctggggtcttggga(SEQID NO.33)。
检测目标区域的探针5’端的报告基团为FAM，3’端猝灭基团为MGB，β-actin探针5’端的报告基团为VIC，3’端猝灭基团为BHQ1。
表2
PCR反应条件如下表7所示。
表3
Ct值读取：PCR完成后，调整基线，将阈值设置在扩增曲线的指数增长期，得到样本各个基因的Ct值。
质量控制：在每次检测时对阴性对照和阳性对照进行同步检测，阴性对照为纯化水，阳性对照为含有β-actin基因和目标基因序列的人工合成质粒，浓度为10
结果分析和判读方法：
用SPSS软件进行ROC分析以评价各个检测区域对结直肠癌症样本和正常样本及结直肠腺瘤样本和正常样本的诊断效能，在分析时，正常样本的状态变量记为“0”，癌症/腺瘤样本的状态变量记为“1”，取约登指数最大时的Ct值为cut-off值，并记录相应的灵敏度、特异性和平均AUC值。
对于病理状态未知的样本，PCR完成后，读取每个样本的检测Ct值，根据Ct值与阈值的比较进行判读，参考方法见下表：
阴性表示该样本主体不患有结直肠腺瘤/结直肠癌或患有二者的几率很低，阳性表示该样本主体患有结直肠腺瘤/结直肠癌或患有二者的几率很高。
实验例1
选取50例健康人血浆样本，94例结直肠腺瘤患者血浆样本，94例结直肠癌患者血浆样本样本，采用实施例11的方法对这238例样本进行检测，用健康人血浆样本(阴性样本)的结果计算这些标记物的特异性，用结直肠腺瘤和结直肠癌样本(阳性样本)的检测结果计算这些标记物对结直肠腺瘤和结直肠癌的检测灵敏性。用SPSS软件进行ROC分析以评价各个检测区域对结直肠癌症样本和正常样本及结直肠腺瘤样本和正常样本的诊断效能，取约登指数最大时的Ct值为cut-off值，并记录相应的灵敏度、特异性和平均AUC值。结果如下。
(1)C9orf50正链上区域a、区域b、区域c、区域d、区域e和区域f的检测灵敏性和特异性如表4所示，以及图1和图3。
表4
由上述结果可以看出，C9orf50基因正链上的区域b、区域c和区域e区分腺瘤和正常样本AUC值均显著高于区域a、区域d和区域f。C9orf50基因的区域b、区域c和区域e对于结直肠癌腺瘤的灵敏性均在80％以上，特异性均在90％以上，对结直肠癌的检测灵敏性和特异性均在85％以上，而区域a、区域d和区域f对于腺瘤的检测灵敏度不到70％，区域a和区域f的检测特异性只有不到80％；C9orf50基因正链上的区域b、区域c和区域e区分癌症和正常样本AUC值均显著高于区域a、区域d和区域f。区域d和区域对于癌症的检测灵敏性只有70％多，区域a和区域f对于癌症的检测特异性不超过80％。整体来看，C9orf50基因正链上的区域b、区域c和区域e的检测效果优于区域a、区域d和区域f。
(2)C9orf50负链上区域g、区域h、区域i和区域j的检测灵敏度和特异性如表5所示，以及图2和图4。
表5
由上述结果可以看出，C9orf50基因负链上区域h、区域i区分腺瘤和正常样本的AUC值均显著高于区域g和区域j。C9orf50基因的区域h和区域i对于结直肠癌腺瘤的灵敏性均在75％以上，特异性均在90％以上，区域g的腺瘤检测特异性只有77％，区域j对于腺瘤的检测灵敏性和特异性均不高(灵敏性不到70％，特异性不到90％)；C9orf50基因负链上区域h、区域i区分癌症和正常样本的AUC值均显著高于区域g和区域j，区域h和区域i对于癌症的检测灵敏性均大于80％，特异性均大于90％，而区域g和区域j虽然灵敏性超过了80％，但特异性均不超过80％，整体而言，C9orf50基因负链上的区域h和区域i的检测效果优于区域g和区域j。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉艾米森生命科技有限公司
<120> 结直肠癌或腺瘤的诊断试剂盒
<160> 33
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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