一种利用沉香结香菌提升烤烟叶品质的加工方法

技术领域

本发明涉及烟草加工技术领域，特别涉及一种利用沉香结香菌提升烤烟叶品质的加工方法。

背景技术

烟草是一种重要的经济作物，是国家税收的重要来源之一。由于新采收烟叶存在青杂气重、刺激性大、烟气粗糙等不足，为了改善烟叶品质，必须对烟叶进行醇化处理。烟叶醇化即在贮存过程中使烟叶在微生物、酶及化学成分的共同作用下发生一系列生化反应，利于烟叶致香物质的积累，促进品质的提升。

考虑到自然发酵耗时较长、占地面积大、经济性差等不足，人工发酵进行烟叶醇化的研究日渐增多；通常使用由烟叶或种植土壤分离的蜡样芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、西姆芽孢杆菌、高地芽孢杆菌、产香酵母菌等进行人工发酵；而其他来源的微生物用于烟叶醇化品质鲜有报道，且对烤烟叶的香味的改善并不显著，尤其是低等烟叶。

沉香作为“众香之首，药中之王”，为瑞香科植物白木香含有树酯的木材，主要分布于越南、印度、印度尼西亚、马来西亚等地区；研究表明：沉香可降低香烟的辛辣味且具有润喉效果。公开号CN109512012A的中国专利，公开了一种沉香烟丝，包括92wt％至96wt％的烟丝和4wt％至8wt％的沉香丝，沉香丝的直径为0.8-1mm且内部呈海绵状，均匀混合于烟丝中，具有烟气饱满、香气平均自然等优点，但成本高昂。如何利用沉香结香菌来改善烟叶品质成为烟草生物科技工作中的热点方向。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提出一种利用沉香结香菌提升烤烟叶品质的加工方法，以进一步改善烟叶尤其是上部烟叶的感官评价。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种利用沉香结香菌提升烤烟叶品质的加工方法，包括如下步骤：S1、利用沉香树酯得到沉香结香复合菌，并分离培养沉香优势结香菌；S2、与新鲜加湿的烤烟叶混合，控制温度为25-35℃、相对湿度为70-90％下发酵，待新鲜烤烟叶表面布满菌丝后，将烤烟叶烘干至含水量为10％-13％；S3、将烟叶进行堆垛至高度100-120cm或悬挂加湿，在20-23℃、相对湿度为60％-65％下加速醇化5-7个月。所述烟叶采用悬挂后喷水保湿进行发酵处理具有相同的有益效果，在此不进行赘述。

需要说明的是，所述沉香结香菌包括沉香结香复合菌和沉香优势结香菌，其中所述沉香优势结香菌是从沉香结香复合菌中分离的单一或组合菌株。

优选的，步骤S1包括：S11、取培育结香或天然结香的沉香树酯，通过粉碎机粉碎到粒径为50-200μm；S12、将经预处理的烟叶混入粉碎后的沉香树酯粉末，混合均匀置入托盘中，置于35℃生化箱中培养；S13、保持温度35±0.5℃，湿度75％-90％，通风环境下静置放置2-3天后，待里面布满沉香菌丝，得到沉香结香复合菌，并分离培养沉香优势结香菌。

优选的，所述烟叶的预处理为：S121、将烟叶去梗除杂，在22±2℃、相对湿度55-60％条件下平衡48h，然后测定含水率；S122、将烟叶湿基揉捻、挤压使烟叶的汁液外溢，通过微波发生器处理3-5min。

优选的，所述烟叶为上部烟叶，包括上二棚叶和/或顶叶。

优选的，所述沉香结香复合菌中分离的沉香优势结香菌包含内生真菌和内生细菌，优选自毛色二孢属(Lasiodiplodia)菌、硬孔菌属(Rigidoporus)菌、毛双孢属(Lasiodiplodia sp.)菌、镰刀菌属(Fusarium)菌、黄绿墨耳菌(Melanotus flavolivens)、头孢霉属(Cephalosporium sp.)、红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)、单孢菌属(Pelomonas)、放线孢菌属(Actinomycetospora)中的至少一种。

优选的，所述沉香优势结香菌由镰刀菌属(Fusarium)菌、黄绿墨耳菌(Melanotusflavolivens)按照1-5:1-5组成。

优选的，所述步骤S2包括：将沉香优势结香菌菌液或发酵液按照0.5-1:1(W/W)喷洒在烤烟叶表面，堆垛至高度80-100cm或加湿悬挂，后控制温度25-28℃、相对湿度为90-95％下发酵2-3天；待垛芯温度升至35-38℃后进行翻堆；之后控制温度为28-32℃，相对湿度为80-85％下发酵3-4天，待新鲜烤烟叶表面布满菌丝后，将烤烟叶烘干至含水量为10％-13％。所述加湿悬挂操作为现有技术，在此不进行赘述。

优选的，所述沉香优势结香菌菌液采用下述方法制备：S21、取沉香优势结香菌的斜面菌株接种到已灭菌的种子培养基中，在160-180rpm、30-32℃的条件下恒温震荡培养36h，得到种子培养液；S22、将种子培养液置于6500-8000rpm离心15-20min，弃去清液，将不同种类的菌泥按比例混合后加入去离子水配置成5-10％混合菌液。

优选的，所述种子培养基中每1L含有的成分为：葡萄糖20.0g、马铃薯200.0g、蒸馏水余量，自然pH，121℃灭菌20min。

优选的，所述沉香优势结香菌发酵液采用下述方法制备：往发酵罐中装入40％(v/v)的液体培养基，将硬孔菌属种子液按照6％的接种量接种到发酵罐中，控制通气比为1:1.2，搅拌转速为80rpm，培养温度为32℃，培养16h；再按5-10％的接种量接种黄绿墨耳菌种子液，通气比1:1.7，搅拌转速130rpm、温度为35℃下继续培养12h，然后补加25％(v/v)第二液体培养基，继续培养42h，得到发酵液。

优选的，所述液体培养基为：硝酸钠3g，磷酸氢二钠1g，马铃薯浸出粉20g，氯化钠1.5g，藜麦粉30g，葡萄糖30g，加蒸馏水至1000ml，121℃高压灭菌20min，调pH6.2-6.8；所述第二液体培养基为：马铃薯浸出粉6g，葡萄糖20g，烤烟叶粉50g，葡聚六糖0.1g，加蒸馏水至1000ml，121℃高压灭菌20min，pH7.2-7.6。

相对于现有技术，本发明所述的提升烟叶品质的加工方法具有以下优势：

(1)本发明所述的提升烟叶品质的加工方法利用沉香结香复合菌或沉香优势结香菌对烟叶进行醇化来改善烟叶尤其是上部烟叶的感官评价；(2)利用上部烟叶提高选择压力以对沉香结香复合菌或沉香优势结香菌筛选，并获得具有协同作用的组合以提高醇化效果；(3)对沉香优势结香菌进行混合发酵，并在发酵培养中加入第二液体培养液以促进分解酶的产生，实现协同作用最大化；(4)通过控制醇化发酵参数使沉香结香复合菌或沉香优势结香菌分阶段发挥作用，最终产生大量的芳香类物质和应激物海藻糖，综合感官评价优。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。实验例中的数据是由发明人通过大量实验获得，限于篇幅，在说明书中只展示其中的一部分，且本领域普通技术人员可以在此数据下理解并实施本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下面将结合实施例来详细说明本发明。本申请所述烟叶是指：经初烤、打叶复烤后的烟叶，所述烟叶为包括上二棚叶和顶叶的上部烟叶，由江苏中烟工业有限责任公司提供。

烟叶醇化，又称烟叶发酵，是烟草加工过程中的一个重要加工单元。烟叶醇化实质是在一定温度和湿度条件下，烟叶理化特性发生深刻变化，烟叶香气、色泽和吸味品质明显改善的加工过程；烟叶醇化分为自然醇化和人工醇化，通常认为该过程通过大量微生物菌落的代谢活动，降解烟叶中的多糖、蛋白质等大分子物质，产生酯类、酸类等致香小分子物质，进而有效提高烟叶吸食品质和缩短醇化时间。

现有技术中除用分离自烟叶的微生物外，食品微生物如乳酸菌、乳杆菌、米根霉用于烟叶醇化均取得了一定的效果，但醇化后烟叶内各种成分比例不协调，增香及改善烟叶品质的效果并不理想。通过培养沉香树酯中的内生菌株来吸收烟叶中的单糖双糖并分解淀粉等大分子有机营养源，经应激或代谢产生海藻糖改善烟叶苦碱，以及多种芳香类物质形成沉香树酯的香味，其香气宜人，故利用沉香结香菌进行烟叶醇化具有重要意义。

实施例1 沉香结香复合菌的获得

本发明提供了一种烟叶处理用沉香结香复合菌，采用如下方法获得：

S1、取培育结香或天然结香的沉香树酯，通过粉碎机粉碎到粒径为50μm；

S2、将经预处理后的烟叶混入粉碎后的沉香树酯粉末，混合均匀置入托盘中，置于35℃生化箱中培养；

S3、保持温度35±0.5℃，湿度75％，通风环境下静置放置2-3天后，待里面布满沉香菌丝，得到沉香结香复合菌。

本申请实施例中所用的沉香树酯来自于某中药铺收集存放的野生沉香木片，经鉴定为白木香树。本申请中所述的“沉香结香复合菌”是指，仅仅是指，沉香树酯的内生真菌利用茶叶作为营养物质生长繁殖后，形成的复合菌株。

优选的，所述步骤S2中烟叶的预处理为：将烟叶去梗除杂，在(22±2)℃、相对湿度60％条件下平衡48h，然后测定含水率；S22、将烟叶湿基揉捻、挤压使烟叶的汁液外溢，通过微波发生器处理3-5min。利用微波杀菌，处理时间短，烟叶成分破坏少以模拟烟叶醇化环境，筛选的优势结香菌效果好。优选的，所述微波发生器的功率为：800W，运行频率为：2450MHZ。

优选的，用于筛选用烟叶为上部烟叶，包括上二棚叶和顶叶。相对于中部烟叶，上部烟叶的叶片厚，结构致密，成熟度不够，且蛋白质等大分子及烟碱含量过高，还原糖含量及糖碱比过低，烟叶醇化难度大，最终品质较差，能够提高筛选压力。

实施例2 沉香优势结香菌的获得

对于沉香结香复合菌采用下述方法进行鉴定：S11、用接种环分别挑取步骤S3得到的菌丝放入100ml无菌水中，于37℃恒温摇床120rpm震荡培养20min；

S12、取200μl液体涂布于筛选平板，32℃恒温培养3-5d，挑取具有明显水解圈的单菌落，对菌落形态观察，同时对菌株进行革兰氏染色，在光学显微镜下观察菌体的形态特征；

S13、采用水煮法提取各菌株的DNA，经PCR扩增后送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，在NCBI基因库中进行菌株的同源性比对并构建系统发育树，结合形态学观察、革兰氏染色结果及16SrDNA测序结果对菌株进行鉴定，得到沉香优势结香菌，包含内生真菌和内生细菌，优选自毛色二孢属(Lasiodiplodia)、毛双孢属(Lasiodiplodia sp.)、黄绿墨耳菌(Cephalosporium sp.)、镰刀菌属(Fusarium)、黄绿墨耳菌(Melanotusflavolivens)、头孢霉属(Cephalosporium sp.)、红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)、单孢菌属(Pelomonas)、放线孢菌属(Actinomycetospora)。

上述沉香优势结香菌用于烤烟叶醇化能够使烟叶具有不同的香味，例如以花蜜清香为主导的镰刀菌属(Fusarium)菌、黄绿墨耳菌(Melanotus flavolivens)、放线孢菌属(Actinomycetospora)；以松茸蘑菇清香为主导的硬孔菌属(Rigidoporus)菌、毛双孢属(Lasiodiplodia sp.)、头孢霉属(Cephalosporium sp.)、红褐肉座菌(Hypocreajecorina)；以果奶清香为主主导的单孢菌属(Pelomonas)、色二孢属(Lasiodiplodia)菌。

S14、种子液制备

将采自顶部的上部烟叶烘干、磨碎成烟末，过40目筛，称取2g烟末加入500mL三角瓶中，加水200mL，121℃灭菌20min，冷却。用移液枪向斜面试管中加入10mL无菌水，反复吹吸使各菌株或孢子分散在无菌水中，吸取一定量的菌悬液接种到种子培养基中，使初始菌浓度为10

S15、菌种筛选

经初步筛选后，发现沉香优势结香菌中毛色二孢属、镰刀菌属、毛双孢属、黄绿墨耳菌的产香能力最强，对上述菌种进行如下优化：称取粉碎后(过40目筛)的50g上部烟叶，置入托盘中，喷洒适量的无菌水，按照表1喷洒步骤S14制备的种子液使烟叶至含水率为25％，于生化培养箱中35℃恒温培养4d，对烟叶常规化学成分含量进行分析，并将烟叶切丝卷制成卷烟后进行感观评价，结果见表1。

常规化学成分检测采用YC/Y160-2002《烟草及烟草制品总植物碱的测定连续流动法》、测定烟碱含量，采用3,5－二硝基水杨酸比色法测定总糖和还原糖含量，香味物质含量采用气相色谱—质谱联用仪测定，具体测定方法为现有技术，在此不进行赘述。

对各处理组烟叶进行感官评价方法参考烟草行业标准YCT138—1998《烟草及烟草制品感官评价方法》中的三点检验的方法进行。每种样品使用未处理的烟丝作为空白对照，两支空白，一支样品。通过评吸时的差别对样品进行打分。参与评价的感官质量指标为：香气质、香气量、杂气、劲头、刺激性、余味。对每一种质量指标(满分：10分)打分，最后进行比较总结。打分说明如下：杂气分数越高，说明杂气量越少；劲头分数越高，说明劲头越小；刺激性分数越高，说明刺激性(鼻腔、喉部)越小。

表1不同菌种对烟叶常规成分含量及感官评价的影响

研究表明，打顶后烟叶中淀粉含量迅速升高，而在成熟过程中淀粉含量逐渐下降，而水溶性糖含量上升，而烟叶的物质成分能显著影响烟叶品质；如淀粉含量偏高时则影响燃烧速度和完全性，并产生焦糊味；淀粉等降解产生的还原糖等小分子物质，是烟叶焦甜香的重要物质基础能平衡酸碱味，在一定的条件下能促进美拉德反应产物的生成，减少烟气的刺激性，利于烟气的吃味、香味。

由表1可知，通过含烟叶培养基分离筛选的菌种均能以烟叶中的糖作为碳源进行生长繁殖并产生芳香类物质，而其中的毛色二孢属具有降解部分烟碱的能力，毛双孢属有较强的产香能力。当不同菌种混合发酵时，其结果通常是发酵结果的简单叠加，如组别6-8，甚至是拮抗作用，如组别5、10。申请人意外的发现，镰刀菌属:黄绿墨耳菌＝1:1混合时的烟叶的总糖含量更低，且产生的芳香类物质的量显著高于二者单用的含量，最终的清香+花蜜香特征明显，感官评价优，说明二者存在协同作用。同时还原糖含量相对于其它组来说明显升高，经检测分析发现：混合发酵过程中产生大量的海藻糖。

需要说明的是，所述沉香结香菌包括沉香结香复合菌和沉香优势结香菌，其中所述沉香优势结香菌是从沉香结香复合菌中分离的单一或组合菌株。

实施例3

一种利用沉香结香复合菌提升烤烟叶品质的加工方法，包括：

S1、取培育结香或天然结香的沉香树酯，通过粉碎机粉碎到粒径为50-200μm；

S2、将经处理后的烟叶混入粉碎后的沉香树酯粉末，混合均匀置入托盘中，置于35℃生化箱中培养；

S3、保持温度35±0.5℃，相对湿度75％-90％，通风环境下静置放置2-3天后，待里面布满沉香菌丝，得到沉香结香复合菌，40℃烘干粉碎至100目细粉，待用；

S4、将步骤S3的沉香结香复合菌细粉按照3-10g：1000g与新鲜加湿的烤烟叶混合，控制温度为25-35℃、相对湿度为90％下发酵5-7天，待新鲜烤烟叶表面布满菌丝后，将烤烟叶烘干至含水量为10％-13％。

S5、将烟叶进行堆垛至高度100-120cm，在20-23℃、相对湿度为60％-65％下加速醇化6个月。

实施例4

一种利用沉香优势结香菌提升烤烟叶品质的加工方法，包括：

S1、分别取镰刀菌属、黄绿墨耳菌的斜面菌株接种到已灭菌的种子培养基中，在160rpm、30℃的条件下恒温震荡培养36h，得到种子培养液；

所用种子培养基，每1L中含有的成分为：葡萄糖20.0g、马铃薯200.0g、蒸馏水余量，自然pH，121℃灭菌20min。

S2、将菌种种液在6500rpm离心15min，弃去清液，将镰刀菌属、黄绿墨耳菌的菌泥按1：1(W/W)混合后加入去离子水配置成5％混合菌液；

S3、将混合菌液按照1:1(W/W)喷洒在烤烟叶表面，控制温度为25-35℃、相对湿度为90％下发酵5-7天，待新鲜烤烟叶表面布满菌丝后，将烤烟叶烘干至含水量为10％-13％，烟叶表面没有明显水珠。

S4、将烟叶进行堆垛至高度100-120cm，在20-23℃、相对湿度为60％-65％下加速醇化6个月。

实施例5

一种利用沉香优势结香菌提升烤烟叶品质的加工方法，包括：

S1、分别取镰刀菌属、黄绿墨耳菌的斜面菌株接种到已灭菌的种子培养基中，在160rpm、30℃的条件下恒温震荡培养36h，得到种子培养液；

所用种子培养基，每1L中含有的成分为：葡萄糖20.0g、马铃薯200.0g、蒸馏水余量，自然pH，121℃灭菌20min。

S2、往发酵罐中装入40％(v/v)的液体培养基，将镰刀菌属种子液按照6％的接种量接种到发酵罐中，控制通气比为1:1.2，搅拌转速为80rpm，培养温度为32℃，培养16h；再按5-10％的接种量接种黄绿墨耳菌种子液，通气比1:1.7，搅拌转速130rpm、温度为35℃下继续培养12h，然后补加25％(v/v)第二液体培养基，继续培养42h，得到发酵液。

所述液体培养基为：硝酸钠3g，磷酸氢二钠1g，马铃薯浸出粉20g，氯化钠1.5g，藜麦粉30g，葡萄糖30g，加蒸馏水至1000ml，121℃高压灭菌20min，调pH6.2-6.8；

第二液体培养基为：马铃薯浸出粉6g，葡萄糖20g，烤烟叶粉50g，葡聚六糖0.1g，加蒸馏水至1000ml，121℃高压灭菌20min，pH7.2-7.6；

S3、将发酵液加水稀释至5％混合菌液，按照1:1(W/W)喷洒在烤烟叶表面，控制温度25-35℃、相对湿度为90％下发酵5-7天，待新鲜烤烟叶表面布满菌丝后，将烤烟叶烘干至含水量为10％-13％，烟叶表面没有明显水珠。

S4、将烟叶进行堆垛至高度100-120cm，在20-23℃、相对湿度为60％-65％下加速醇化6个月。

实施例6

一种利用沉香优势结香菌提升烤烟叶品质的加工方法，包括：

S1、分别取镰刀菌属、黄绿墨耳菌的斜面菌株接种到已灭菌的种子培养基中，在160rpm、30℃的条件下恒温震荡培养36h，得到种子培养液；

所用种子培养基，每1L中含有的成分为：葡萄糖20.0g、马铃薯200.0g、蒸馏水余量，自然pH，121℃灭菌20min。

S2、往发酵罐中装入40％(v/v)的液体培养基，将镰刀菌属种子液按照6％的接种量接种到发酵罐中，控制通气比为1:1.2，搅拌转速为80rpm，培养温度为32℃，培养16h；再按5-10％的接种量接种黄绿墨耳菌种子液，通气比1:1.7，搅拌转速130rpm、温度为35℃下继续培养12h，然后补加25％(v/v)第二液体培养基，继续培养42h，得到发酵液。

所述液体培养基为：硝酸钠3g，磷酸氢二钠1g，马铃薯浸出粉20g，氯化钠1.5g，藜麦粉30g，葡萄糖30g，加蒸馏水至1000ml，121℃高压灭菌20min，调pH6.2-6.8；

第二液体培养基为：马铃薯浸出粉6g，葡萄糖20g，烤烟叶粉50g，葡聚六糖0.1g，加蒸馏水至1000ml，121℃高压灭菌20min，pH7.2-7.6；

S3、将发酵液加水稀释至5％混合菌液，按照1:1(W/W)喷洒在烤烟叶表面，堆垛至高度80-100cm，后控制温度25-28℃、相对湿度为90-95％下发酵2-3天；待垛芯温度升至35-38℃后进行翻堆；之后控制温度为28-32℃，相对湿度为80-85％下发酵3天，待新鲜烤烟叶表面布满菌丝后，将烤烟叶烘干至含水量为10％-13％，烟叶表面没有明显水珠。

S4、将烟叶进行堆垛至高度100-120cm，控制温度在20-23℃、相对湿度为60％-65％下加速醇化6个月。

对比例1

采用公开号CN111657536A中实施例1方法对烟叶进行醇化处理；

对比例2

采用与实施例6相同的方法，区别在于：步骤S2中未补加第二液体培养；

对比例3

采用与实施例6相同的方法，区别在于：步骤S2中液体培养基；硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，马铃薯浸出粉20g，氯化钾1.5g，藜麦粉30g，葡萄糖30g，加蒸馏水至1000ml，121℃高压灭菌20min，氢氧化钠或硝酸调pH6.2-6.8；

将各实施例、对比例制备的醇化烟叶烘干粉碎，测定发酵前、后烟叶中大分子化合物的含量变化。烟叶中淀粉含量采用碘显色法测定，纤维素含量测定采用安玉民等的方法，海藻糖采用海藻糖含量测定试剂盒测定(索莱宝科技有限公司)，YC/T162-2011《烟草及烟草制品氯的测定连续流动法》和YC/T173-2003《烟草机烟草制品中钾的测定法火焰光度法》测定、钾和氯，香味物质含量采用气相色谱—质谱联用仪测定，具体检测方法为现有技术，在此不进行赘述，结果见表2。

表2不同组别烟叶中大分子化合物的含量变化

经检测，待实验用的复烤烟叶中淀粉、纤维素、海藻糖、钾、氯的含量分别为10.82％、14.08％、1.05μg/mg、1.71％、0.62％；通过微生物的代谢活动，复烤烟叶中的淀粉等大分子化合物降解为单糖等小分子物质，同时通过菌种复配发酵时能产生较多的海藻糖以调和烟碱的苦涩味，使得烟叶甘甜滋润，同时提升燃吸品质。由上表可知，实施例3利用沉香树酯得到的沉香结香复合菌对烟叶进行醇化发酵，能够降低淀粉含量，提升烟叶的燃吸品质；实施例4-5通过分离的沉香优势结香菌-镰刀菌属、黄绿墨耳菌进行混合发酵，二者之间存在明显的协同作用，通过混合发酵工艺的优化，使菌体产生应应激反应而进一步增加海藻糖含量；同时对发酵液中补加营养液使其大量产生酶类以作用于烟叶，通过控制醇化发酵参数使复合菌体分阶段发挥作用，最终产生大量的芳香类物质；

将各实施例/对比例制备的醇化烟叶切丝卷制成卷烟，采用实施例3的方法进行感官评价，结果见表3。

表3不同组别制备烟叶的感观评价结果

与对比例3相比，通过添加含氯不含钾的第二液体培养基，虽然降低了最终烟叶的钾氯比，但通过促进微生物的代谢活动而改善醇化效果，最终烟叶的感官评价良好。由表3可知，实施例3-5所制备的醇化烟叶的综合感官质量评价优于对比例1。在实施例6中利用镰刀菌属、黄绿墨耳菌的混合发酵，并在发酵后期产生大量的酶类，当接种至复烤烟叶后首先酶类对烟叶进行初次降解，通过分阶段控制发酵的环境参数并分别达到镰刀菌属、黄绿墨耳菌的最适代谢条件，进行复烤烟叶的固态发酵，制备烟叶的感观评价优。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。