甜蜜素在促进间充质干细胞体外高效成脂分化中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，尤其是一种甜蜜素在促进间充质干细胞体外高效成脂分化中的应用。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)属于成体干细胞，广泛分布于人和动物体内各种组织中，在体外培养时，间充质干细胞可向脂肪、骨、软骨、成肌、神经等细胞定向分化，在食品科学领域，间充质干细胞已被证明可以分化为肌肉细胞和脂肪细胞，进而可以用于生产瘦肉和脂肪；在再生医学领域，间充质干细胞是较为理想的组织工程种子来源，具有良好的临床应用前景。然而MSCs需定向分化成足够数目的细胞以用于科学领域使用，因此，间充质干细胞的定向分化效率低下可能会限制其在生物医药方面应用。间充质干细胞的非对称分裂使得一个子细胞不可逆地走向分化的终端成为功能专一的分化细胞，另一个保持亲代的特征，仍作为干细胞保留下来长。给予间充质干细胞一定诱导刺激，可促进其向固定的方向分化，以此获得目标细胞，然而目前间充质干细胞定向成脂分化效率有限，市售成脂培养基成分中含有不宜食用成分等等这些缺点限制其在食品科学、再生医学、机制研究等相关领域的研究与应用。因此，寻找合适的提高间充质干细胞定向脂肪细胞分化效率对科学研究至关重要。

食物中的脂肪除了为人体提供能量外，还有一些特殊的营养学功能如增加饱腹感、改善食物的感官性状、提供脂溶性维生素，因此，富含脂肪的食品很受消费者的欢迎。脂肪再生医学是一种利用人体自身脂肪细胞进行再生和修复的医学技术，这种技术可以用于许多不同的领域，例如整形外科、创伤修复、疤痕修复、乳腺重建、肉芽肿治疗和关节疾病治疗。脂肪同样适用于研究过度肥胖、骨质疏松症等领域的机制研究。

甜蜜素(Sodium Cyclamate)是一种人工甜味剂，具有安全性高、卡路里低等优点，因而广泛应用于食品、饮料、药物和个人护理品中。甜蜜素由“氨基磺酸”与环己胺、NaOH反应后制作而成的添加剂，外观为白色针状、片状结晶、结晶状粉末，化学名称为C6H11NHSO3Na。在食品加工行业中，甜蜜素是一种应用非常广泛的高倍甜味剂，属于食品添加剂的一种，其甜度为蔗糖甜度的30倍左右。在食品中加入甜蜜素可保留食品风味，改善食品口感。蜜饯、糕点、饮品等食品的生产活动是甜蜜素的主要应用场所。截至目前，甜蜜素对间充质干细胞成脂分化的影响还未见报道。

甜蜜素的化学结构式为：

通过检索，没有发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种甜蜜素在促进间充质干细胞体外高效成脂分化中的应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

甜蜜素在体外促进间充质干细胞高效成脂分化的应用，所述甜蜜素的化学结构式为：

进一步地，所述应用为甜蜜素在作为和/或制备体外促进间充质干细胞高效成脂分化诱导和维持培养基添加物中的应用。

进一步地，所述应用为甜蜜素在作为和/或制备体外促进猪源间充质干细胞的高效成脂分化诱导培养基添加物中的应用，其中，所述甜蜜素的浓度为0.01～100mM。

进一步地，所述应用为甜蜜素在作为和/或制备体外促进猪源间充质干细胞的高效成脂分化维持培养基添加物中的应用，其中，所述甜蜜素的浓度为0.01～100mM。

进一步地，所述应用为甜蜜素在作为和/或制备体外促进人源间充质干细胞的高效成脂分化诱导培养基添加物中的应用，其中，所述甜蜜素的浓度为0.01～100mM。

进一步地，所述应用为甜蜜素在作为和/或制备体外促进人源间充质干细胞的高效成脂分化维持培养基添加物中的应用，其中，所述甜蜜素的浓度为0.01～100mM。

进一步地，所述甜蜜素为高纯度的甜蜜素，纯度≥98％。

进一步地，所述应用为甜蜜素能够提高脂肪标记基因的表达。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明发现甜蜜素能够用于促进间充质干细胞体外成脂分化的用途，以提高体外间充质干细胞的成脂效率。本发明为间充质干细胞的体外分化和后续应用将提供重要的保障，为科学研究和临床治疗提供足够的脂肪细胞，具有重要的经济价值与社会意义。如图2和图5油红O吸光度值定量检测实验结果所示，加入甜蜜素后，细胞成脂率显著升高。

2、本发明发现甜蜜素能够促进间充质干细胞成脂分化，还可以提高脂肪标记基因的表达，具有开发成促进间充质干细胞体外成脂分化的培养基的前景，对于细胞培养肉、细胞再生治疗、基因工程和组织工程等应用均至关重要，尤其是对食品科学、再生医学方面，该技术有望为细胞培养肉的生产制造、组织工程应用提供大量的脂肪细胞。如图3和图6qRT-PCR实验结果所示，加入甜蜜素后，脂肪标记基因在mRNA水平显著升高。

3、本发明发现甜蜜素具有体外促进猪源和人源间充质干细胞向脂肪细胞分化的作用。因此，甜蜜素具有开发成促进间充质干细胞体外成脂分化的培养基的前景，对于细胞培养肉、细胞再生治疗、基因工程和组织工程等应用均至关重要。

4、本发明发现甜蜜素优选浓度为0.01～100mM，应用于添加到成脂分化诱导培养基，体外促进猪源间充质干细胞的成脂分化。甜蜜素优选浓度为0.01～100mM，应用于添加到成脂分化维持培养基，体外促进猪源间充质干细胞的成脂分化。甜蜜素优选浓度为0.01～100mM，应用于添加到成脂分化诱导培养基，体外促进人源间充质干细胞的成脂分化。甜蜜素优选浓度为0.01～100mM，应用于添加到成脂分化维持培养基，体外促进人源间充质干细胞的成脂分化。如图1油红O染色定量分析实验结果所示，加入不同浓度甜蜜素(0.01～100mM)后，猪源间充质干细胞的成脂效果显著升高。如图4油红O染色定量分析实验结果所示，加入不同浓度不同浓度甜蜜素(0.01～100mM)后，人源间充质干细胞的成脂效果显著升高。

附图说明

图1为本发明中甜蜜素体外诱导猪源间充质干细胞向脂肪细胞分化结果图；其中，左边为对照组，右边为加药组；

图2为本发明中甜蜜素体外诱导猪源间充质干细胞向脂肪细胞分化油红O染色定量分析实验结果图；

图3为本发明中甜蜜素体外培养猪源间充质干细胞向脂肪细胞分化qRT-PCR检测标记基因实验结果图；

图4为本发明中甜蜜素体外诱导人源间充质干细胞向脂肪细胞分化结果图；其中，左边为对照组，右边为加药组；

图5为本发明中甜蜜素体外诱导人源间充质干细胞向脂肪细胞分化油红O染色定量分析实验结果图；

图6为本发明中甜蜜素体外培养人源间充质干细胞向脂肪细胞分化qRT-PCR检测标记基因实验结果图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

具体实施例中所涉及的各种实验操作，均为本领域的常规技术，本文中没有特别注释的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等予以实施。

甜蜜素在体外促进间充质干细胞高效成脂分化的应用，所述甜蜜素的化学结构式为：

较优地，所述应用为甜蜜素在作为和/或制备体外促进间充质干细胞高效成脂分化诱导和维持培养基添加物中的应用。

较优地，所述应用为甜蜜素在作为和/或制备体外促进猪源间充质干细胞的高效成脂分化诱导培养基添加物中的应用，其中，所述甜蜜素的浓度为0.01～100mM。

较优地，所述应用为甜蜜素在作为和/或制备体外促进猪源间充质干细胞的高效成脂分化维持培养基添加物中的应用，其中，所述甜蜜素的浓度为0.01～100mM。

较优地，所述应用为甜蜜素在作为和/或制备体外促进人源间充质干细胞的高效成脂分化诱导培养基添加物中的应用，其中，所述甜蜜素的浓度为0.01～100mM。

较优地，所述应用为甜蜜素在作为和/或制备体外促进人源间充质干细胞的高效成脂分化维持培养基添加物中的应用，其中，所述甜蜜素的浓度为0.01～100mM。

较优地，所述甜蜜素为高纯度的甜蜜素，纯度≥98％。

较优地，所述应用为甜蜜素能够提高脂肪标记基因的表达。

具体地，相关的制备及检测如下：

实施例1

猪骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分离和培养：

取三天龄新生小猪，用3％戊巴比妥钠麻醉致死，在脚踝处切断踝关节去掉脚掌，沿骨干刮去骨骼末端结缔组织。将胫骨和肱骨保存在添加有5％青霉素/链霉素的冷的PBS中。在无菌环境下剪掉股骨和胫骨末端，用完全培养基(DMEM/F12培养基+青霉素100IU/mL+链霉素100μg/mL+10％胎牛血清)从切口处冲刷骨髓填充物，收集BMSCs。200目筛网过滤掉细胞悬浮物除掉骨髓针状物、肌肉和细胞块。添加完全培养基稀释细胞至1×10

实施例2

取P3代的猪骨髓间充质干细胞用于成脂分化实验。

成脂分化培养分为诱导和分化两个阶段，诱导阶段培养基成分为含有10μm地塞米松、200mM吲哚美辛和10μm胰岛素的完全培养基，称培养基①，维持阶段培养基为含有10μm胰岛素的完全培养基，称培养基②，在实施过程中，先加培养基①，作用一段时间撤掉后加培养基②，培养基①②配套循环使用，以下称该配套培养基为DI培养基；甜蜜素溶解后经过滤除菌加入到DI培养基中，按6种浓度(0、0.01、0.1、1、10、100mM)进行混合。

将P3代的猪骨髓间充质干细胞以5×10

实验结果：不同浓度给药组的成脂效果如图1所示，相比于0mM甜蜜素组，不同浓度甜蜜素可以有效促进猪骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化，与对照组相比，10mM和100mM甜蜜素更能促进猪骨髓间充质干细胞的成脂分化。

实施例3

取P3代的猪骨髓间充质干细胞油红O染色定量分析实验。

其中，固定液为：含有体积百分数4％的多聚甲醛溶液，溶剂为10mM磷酸缓冲盐溶液；

洗涤液为：为10mM磷酸缓冲盐溶液；

染色液为：油红O染色液(购于北京索莱宝有限公司)

提取液为：含有体积百分数98％的异丙醇溶液，溶剂为10mM磷酸缓冲盐溶液。

实验分为对照组和给药组。其中，对照组培养基分为诱导和分化两个阶段，诱导阶段培养基成分为含有10μm地塞米松、200mM吲哚美辛和10μm胰岛素的完全培养基，称培养基①，维持阶段培养基为含有10μm胰岛素的完全培养基，称培养基②，在实施过程中，先加培养基①，作用一段时间撤掉后加培养基②，培养基①②配套循环使用，以下称该配套培养基为DI培养基；给药组中，甜蜜素溶解后经过滤除菌加入到DI培养基中。本实验中，对照组为含0mM甜蜜素的DI培养基组，给药组为含有0.01、0.1、1、10、100mM甜蜜素的DI培养基组。

将P3代的猪骨髓间充质干细胞以5×10

成脂率＝OD

实验结果：如图2所示，不同浓度甜蜜素可以有效促进猪骨髓间充质干细胞体外成脂分化，与对照组相比，10mM和100mM甜蜜素给药组的成脂效果更优，分别提高1.943±0.062和1.863±0.071倍。

实施例4

取5代的猪骨髓间充质干细胞用于qRT-PCR实验。

对照组为完全培养基培养，实验分为3组，均分为诱导和分化两个阶段，诱导阶段培养基成分为含有10μm地塞米松、200mM吲哚美辛和10μm胰岛素的完全培养基，称培养基①，维持阶段培养基为含有10μm胰岛素的完全培养基，称培养基②，在实施过程中，先加培养基①，作用一段时间撤掉后加培养基②，培养基①②配套循环使用，以下称该配套培养基为DI培养基；甜蜜素溶解后经过滤除菌，按10mM浓度加入分别加入完全培养基和DI培养基中。分组为：完全培养基组、DI培养基组、含10mM甜蜜素的完全培养基组和含10mM甜蜜素的DI培养基组。

将P5代的猪骨髓间充质干细胞以5×10

实验结果：对照组和实验组的实验结果qRT-PCR如图3所示，甜蜜素促进了猪骨髓间充质干细胞成脂分化过程中脂肪标记基因FABP4的表达，与完全培养基组相比，DI培养基组、含10mM甜蜜素的完全培养基组、含10mM甜蜜素的DI培养基组的FABP4表达量分别提高了3.013±0.273、2.168±0.131、5.509±0.260倍，与完全培养基组、DI培养基组、含10mM甜蜜素的完全培养基组相比，10mM甜蜜素加DI培养基的组合显著促进FABP4在mRNA水平的表达。同时，也可以看出，本发明中甜蜜素与DI培养基、以及操作步骤“首先分别进行48h成脂诱导培养，后用PBS清洗，换成相同甜蜜素浓度的成脂维持培养基培养48h”之间具有协同作用，能够协同促进FABP4在mRNA水平的表达。

实施例5

人脐带来源间充质干细胞(hMSCs)培养：

将脐带在含有5％青霉素/链霉素PBS缓冲液中清洗干净后，剖开并将铺展在10mm

实施例6

取P3代的人脐带间充质干细胞用于成脂分化实验。

成脂分化培养分为诱导和分化两个阶段，诱导阶段培养基成分为含有10μm地塞米松、200mM吲哚美辛和10μm胰岛素的完全培养基，称培养基①，维持阶段培养基为含有10μm胰岛素的完全培养基，称培养基②，在实施过程中，先加培养基①，作用一段时间撤掉后加培养基②，培养基①②配套循环使用，以下称该配套培养基为DI培养基；甜蜜素溶解后经过滤除菌加入到DI培养基中，按6种浓度(0、0.01、0.1、1、10、100mM)进行混合。

将P3代的人脐带间充质干细胞以5×10

实验结果：不同浓度给药组的成脂效果如图4所示，相比于0mM甜蜜素组，不同浓度甜蜜素可以有效促进人脐带间充质干细胞向脂肪细胞分化，与对照组相比，10mM和100mM甜蜜素更能促进人脐带间充质干细胞的成脂分化。

实施例7

取P3代的人脐带间充质干细胞油红O染色定量分析实验。

其中，固定液为：含有体积百分数4％的多聚甲醛溶液，溶剂为10mM磷酸缓冲盐溶液；

洗涤液为：为10mM磷酸缓冲盐溶液；

染色液为：油红O染色液(购于北京索莱宝有限公司)

提取液为：含有体积百分数98％的异丙醇溶液，溶剂为10mM磷酸缓冲盐溶液。

实验分为对照组和给药组。其中，对照组培养基分为诱导和分化两个阶段，诱导阶段培养基成分为含有10μm地塞米松、200mM吲哚美辛和10μm胰岛素的完全培养基，称培养基①，维持阶段培养基为含有10μm胰岛素的完全培养基，称培养基②，在实施过程中，先加培养基①，作用一段时间撤掉后加培养基②，培养基①②配套循环使用，以下称该配套培养基为DI培养基；给药组中，甜蜜素溶解后经过滤除菌加入到DI培养基中。本实验中，对照组为含0mM甜蜜素的DI培养基组，给药组为含有0.01、0.1、1、10、100mM甜蜜素的DI培养基组。

将P3代的人脐带间充质干细胞以5×10

成脂率＝OD

实验结果：如图5所示，不同浓度甜蜜素可以有效促进人脐带间充质干细胞体外成脂分化，与对照组相比，10mM和100mM甜蜜素给药组的成脂效果更优，分别提高1.553±0.107和1.589±0.086倍。

实施例8

取5代的人脐带间充质干细胞用于qRT-PCR实验。

对照组为完全培养基培养，实验分为3组，均分为诱导和分化两个阶段，诱导阶段培养基成分为含有10μm地塞米松、200mM吲哚美辛和10μm胰岛素的完全培养基，称培养基①，维持阶段培养基为含有10μm胰岛素的完全培养基，称培养基②，在实施过程中，先加培养基①，作用一段时间撤掉后加培养基②，培养基①②配套循环使用，以下称该配套培养基为DI培养基；甜蜜素溶解后经过滤除菌，按10mM浓度加入分别加入完全培养基和DI培养基中。分组为：完全培养基组、DI培养基组、含10mM甜蜜素的完全培养基组和含10mM甜蜜素的DI培养基组。

将P5代的人脐带间充质干细胞以5×10

实验结果：对照组和实验组的实验结果qRT-PCR如图6所示，甜蜜素促进了人脐带间充质干细胞中脂肪标记基因FABP4的表达，与完全培养基组相比，DI培养基组、含10mM甜蜜素的完全培养基组、含10mM甜蜜素的DI培养基组的FABP4表达量分别提高了4.671±0.158、4.759±0.357、10.439±1.081倍；与完全培养基组、DI培养基组、含10mM甜蜜素的完全培养基组相比，10mM甜蜜素加DI培养基的组合显著促进FABP4在mRNA水平的表达。同时，也可以看出，本发明中甜蜜素与DI培养基、以及操作步骤“首先分别进行48h成脂诱导培养，后用PBS清洗，换成相同甜蜜素浓度的成脂维持培养基培养48h”之间具有协同作用，能够协同促进FABP4在mRNA水平的表达。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。