2-APB在治疗产气荚膜梭菌Epsilon毒素引起的疾病中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及2-APB在治疗产气荚膜梭菌Epsilon毒素引起的疾病中的应用。

背景技术

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)旧称魏氏梭菌，是革兰氏阳性杆状厌氧菌，因能分解肌肉和结缔组织中的糖类而产出大量气体以及可以在体内形成荚膜而得名。产气荚膜梭菌主要的致病因子是其分泌的外毒素，它可产生如α、β、γ、ε、θ、δ、η、ι、κ、λ、μ、ν等多种外毒素。根据产生的6种主要外毒素(α、β、ε、ι、CPE(肠毒素)和NetB(孔形成毒素))可将其分为A、B、C、D、E、F和G七个型。其中，Epsilon毒素(ε毒素，Epsilon toxin，ETX)是由B型和D型产气荚膜梭菌产生，可引起反刍动物患致死性肠毒血症，该病发病急、病程快、死亡率高，每年给畜牧业造成巨大损失。此外，Epsilon毒素不仅能够引起人患多发性硬化症，还可以特异性导致人的红细胞溶血。研究发现，Epsilon毒素的毒性仅次于肉毒毒素和破伤风毒素，美国疾病预防与控制中心(CDC)将其列为B类生物恐怖剂，对人类健康和安全具有潜在威胁。

动物肾脏和大脑是Epsilon毒素主要的靶器官。当Epsilon毒素进入动物体内，可在肾脏和大脑中大量积聚，发生充血和水肿，破坏血脑屏障，引起动物死亡。然而，对Epsilon毒素敏感的细胞不多，主要有鼠肾皮质集合管(mpkCCDcl4)细胞、人肾平滑肌瘤(G-402)细胞、费舍尔鼠甲状腺(FRT)细胞和人肾颗粒细胞癌(ACHN)细胞，其中最敏感的细胞是犬肾上皮(MDCK)细胞。Epsilon毒素攻击细胞时，首先与细胞表面的特定受体结合，在脂筏上形成七聚体复合物，并在细胞膜表面形成一个大的孔隙，导致细胞膜通透性改变，大量有毒的物质进入细胞，最终引起细胞死亡。

目前针对Epsilon毒素中毒救治主要是利用抗体中和Epsilon毒素，且大多处于研究阶段，临床上仍非常缺乏有效的治疗药物，因此，研究和开发安全有效的新型Epsilon毒素中毒救治药物和治疗方法十分必要，对产气荚膜梭菌Epsilon毒素引起的疾病的预防和治疗具有重要的意义和广泛的临床应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是现有技术中针对Epsilon毒素中毒非常缺乏有效的治疗药物，提供一种2-APB或其衍生物在制备治疗产气荚膜梭菌Epsilon毒素引起的疾病的药物中的应用。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了2-APB或其衍生物在制备预防、改善或治疗产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)感染引起的疾病的产品中的应用。

所述2-APB为2-氨基乙基二苯硼酸酯(2-Aminoethoxy diphenylborane，CAS号：524-95-8)，其分子结构式如图2所示。

上述应用中，所述产气荚膜梭菌可为B型和/或D型产气荚膜梭菌。

上述应用中，所述产气荚膜梭菌感染引起的疾病可为产气荚膜梭菌Epsilon毒素(也称为ε毒素、Epsilon toxin、ETX)引起的疾病。

所述Epsilon毒素的氨基酸序列可为SEQ ID No.2的第228-488位，所述Epsilon毒素的编码基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.1。

上述应用中，所述产气荚膜梭菌Epsilon毒素引起的疾病包括但不限于产气荚膜梭菌Epsilon毒素中毒、肠毒血症、坏死性肠炎、肾病、肠道疾病、脑部疾病(如脑炎或脑膜炎)或多发性硬化症。

所述产气荚膜梭菌Epsilon毒素引起的疾病的症状可包括肾脏和大脑主要靶器官的水肿以及血管内皮细胞的损伤。

上述应用中，所述产品可具有下述至少任一种功能：

A1)预防、改善或治疗产气荚膜梭菌感染引起的疾病；

A2)预防、改善或治疗B型和/或D型产气荚膜梭菌感染引起的疾病；

A3)预防、改善或治疗产气荚膜梭菌Epsilon毒素引起的疾病；

A4)中和产气荚膜梭菌Epsilon毒素；

A5)降低或抑制产气荚膜梭菌Epsilon毒素的毒性作用；

A6)提高动物抵抗产气荚膜梭菌Epsilon毒素攻击的能力；

A7)提高产气荚膜梭菌Epsilon毒素中毒动物的生存率；

A8)作为产气荚膜梭菌Epsilon毒素抑制剂；

A9)作为抗产气荚膜梭菌制剂。

本发明还提供了以2-APB和/或其衍生物为活性成分的物质的下述任一种应用：

B1)在制备用于预防、改善或治疗产气荚膜梭菌感染引起的疾病的产品中的应用；

B2)在制备用于预防、改善或治疗B型和/或D型产气荚膜梭菌感染引起的疾病的产品中的应用；

B3)在制备用于预防、改善或治疗产气荚膜梭菌Epsilon毒素引起的疾病的产品中的应用；

B4)在制备用于中和产气荚膜梭菌Epsilon毒的产品中的应用；

B5)在制备用于降低或抑制产气荚膜梭菌Epsilon毒素的毒性作用的产品中的应用；

B6)在制备用于提高动物抵抗产气荚膜梭菌Epsilon毒素攻击的能力的产品中的应用；

B7)在制备用于提高产气荚膜梭菌Epsilon毒素中毒动物的生存率的产品中的应用；

B8)在制备产气荚膜梭菌Epsilon毒素抑制剂中的应用；

B9)在制备抗产气荚膜梭菌制剂中的应用。

本文所述动物包括人和非人动物。

本文所述产品可为药物或试剂。

上述应用中，所述物质可为药物组合物、饲料或饲料添加剂。

上述应用中，所述饲料或饲料添加剂可用于反刍动物、家禽、猪、马、兔子或鼠。

进一步地，所述反刍动物可包括牛(如黄牛、牦牛、奶牛或小牛等)或羊(如绵羊、山羊或羔羊等)，所述家禽可包括鸡、鸭或鹅。

进一步地，所述药物组合物还包括一种或多种药学上可接受的载体。

所述药学上可接受的载体可为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂但不限于此。

本发明主要有两个方面：一方面是在细胞水平验证2-APB对Epsilon毒素的抑制作用。发明人基于前期工作积累，在MDCK细胞中验证2-APB对Epsilon毒素毒性的抑制作用。结果表明：2-APB能有效抑制Epsilon毒素对MDCK细胞的毒性作用，且呈浓度依赖性。因此，本发明表明在Epsilon毒素中毒救治中有重要应用前景。

本发明的另一方面是通过动物实验，验证2-APB对Epsilon毒素引起的动物中毒救治效果。实施2-APB能有效抑制Epsilon毒素的毒性，并提高Epsilon毒素中毒动物的生存率，具有保护动物抵御Epsilon毒素感染的用途。因此，2-APB可在制备预防或者治疗动物的Epsilon毒素中毒的相关药物或试剂中应用。

本发明涉及到的2-APB分子结构清晰，获取简单。本发明中涉及到的Epsilon毒素的制备方法较为成熟，主要通过重组表达的方式获取。Epsilon毒素对MDCK细胞最敏感，因此用于本发明中2-APB中毒救治的研究。该验证方法符合毒素研究领域的经典方法范畴。

2-APB在MDCK细胞毒性实验、小鼠攻毒实验中均显示出对Epsilon毒素毒性的抑制作用，表现为MDCK细胞死亡率降低、2-APB处理过的小鼠再次被完全致死剂量的Epsilon毒素攻毒时，小鼠100％存活。揭示本发明中，2-APB对Epsilon毒素的中毒有很好的治疗效果，在畜牧业有很好的应用前景，对人类社会生物安全具有十分重要的意义。

本发明的有益效果在于：

1、本发明涉及到的2-APB对Epsilon毒素毒性中和效果很好。在细胞水平，2-APB对Epsilon毒素的毒性有较好的抑制效果，在动物实验中，2-APB显示出对Epsilon毒素攻毒后动物的强效保护效果。因此，2-APB有望成为预防和治疗Epsilon毒素引起感染的重要试剂和药物。

2、本发明设计的2-APB分子结构简单，在畜牧业有很好的应用前景，对人类社会安全具有十分重要的意义。

发明人长期从事Epsilon毒素相关研究工作，通过筛选大量抑制剂，发现2-APB(2-Aminoethoxy diphenylborane，CAS号524-95-8)可以减弱Epsilon毒素对细胞的毒性作用，并能完全保护小鼠抵抗致死剂量Epsilon毒素的攻击，降低死亡率。

附图说明

图1为Epsilon毒素纯化后SDS-PAGE结果图。

图2为2-APB的分子结构图。

图3为不同浓度Epsilon毒素对MDCK细胞毒性结果图。

图4为2-APB对抑制Epsilon毒素对MDCK细胞毒性结果图。

图5为不同浓度Epsilon毒素攻毒小鼠后小鼠的生存曲线图。

图6为2-APB对Epsilon毒素攻毒小鼠后小鼠的生存曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的2-APB为2-氨基乙基二苯硼酸酯(2-Aminoethoxydiphenylborane，CAS号：524-95-8)，其分子结构式如图2所示。

下述实施例中的pGEX-4T-1载体为Cytiva公司产品，产品目录号为：28954549。

下述实施例中的MDCK细胞为武汉普诺赛生命科技有限公司产品，产品目录号为：CL-0154。

实施例1、2-APB在抑制Epsilon毒素中的应用

一、Epsilon毒素的表达与纯化

1、构建Epsilon毒素重组菌株BL21(DE3)

本发明利用本实验室保存的Epsilon毒素重组菌株BL21(DE3)，纯化得到纯度较高的Epsilon毒素，用于后续研究。Epsilon毒素重组菌株BL21(DE3)的构建方法如下：

1.1、构建重组载体pGEX-4T-1-Epsilon

重组载体pGEX-4T-1-Epsilon是将pGEX-4T-1载体的BamHI和XhoI识别位点间的片段(小片段)替换为序列表中SEQ ID No.1的DNA片段(即Epsilon毒素基因)，保持pGEX-4T-1载体的其他核苷酸序列不变，得到的重组表达载体。Epsilon毒素基因和载体上的GST标签融合表达，得到融合了GST标签的Epsilon毒素，该融合了GST标签的Epsilon毒素的氨基酸序列为SEQ ID No.2，其中，SEQ ID No.2的第228-488位为Epsilon毒素(由SEQ ID No.1所示的Epsilon毒素基因编码)，第1-226位为GST标签。

1.2、构建Epsilon毒素重组菌株BL21(DE3)

将上述步骤1.1中构建的质粒(重组载体pGEX-4T-1-Epsilon)转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，对转化菌落进行筛选鉴定，得到正确插入质粒的重组菌即为Epsilon毒素重组菌株BL21(DE3)，-80℃保存备用。

2、Epsilon毒素的表达与纯化：

2.1、Epsilon毒素重组菌株BL21(DE3)的培养与诱导

从-80℃冰箱中取出保存的Epsilon毒素重组菌株BL21(DE3)，按照1:100的比例转接入5ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基(500ml培养基中需加入5g蛋白胨、2.5g酵母提取物和5g NaCl，余量为水)中，37℃下，180r/min培养6h后，按照1:100的比例转接入500ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃下，180r/min摇培至OD

2.2、蛋白混合液的制备

将上述步骤2.1得到的培养液4℃下，8000r/min离心15min收集菌体后，弃上清，PBS将菌体重悬，8000r/min离心15min后，弃上清，用80ml A液(1L A液中需加入8.18gNaCl，0.2g KCl，3.58g Na

2.3、利用纯化仪纯化Epsilon毒素

(1)用无菌水以3ml/min流速冲洗纯化仪A、B泵；

(2)用B液(1LB液中需加入7.88g Tris-HCl，3.07g10mM还原性谷胱甘肽，0.62gDTT，pH 8.0，余量为水)以3ml/min流速冲洗B泵；

(3)将GSTrap

(4)将步骤2.2中制备的蛋白混合液通过(3)处理后的GSTrap

(5)用A液冲洗GSTrap

(6)用B液以梯度方式洗脱与GSTrap

结果如图1所示，A液为上述步骤(5)收集的产物，B液为上述步骤(6)收集的产物；穿透液为上述步骤(4)收集的产物；可以看出，经纯化后，获得了纯度较高的大小为56kDa的融合了GST标签的Epsilon毒素(命名为GST-Epsilon)，氨基酸序列为SEQ ID No.2，浓度为4mg/ml，可用于后续实验。

下述实验采用的Epsilon毒素均为GST-Epsilon。

二、2-APB在Epsilon毒素对MDCK细胞中毒性抑制能力验证

1、MDCK细胞制备96孔细胞板

本发明采用对Epsilon毒素引起MDCK细胞死亡的抑制活性作为验证2-APB对Epsilon毒素毒性抑制效果的评价标准。MDCK细胞使用前用含10％(体积百分含量)FBS的DMEM培养基稀释成10

2、Epsilon毒素对MDCK细胞半数致死剂量的确定

采用MTS测定法，用MTS测试试剂盒(CellTiter96

实验组：用含10％(体积百分含量)FBS的DMEM培养基将上述一中制备的Epsilon毒素GST-Epsilon稀释至终浓度分别为16000、8000、4000、2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125、3.096、1.95、0.97、0.488、0.244和0.122ng/ml共18个梯度，按照100μl/孔体积将其加入96孔板内。

空白对照组：只加入100μl/孔含10％(体积百分含量)FBS的DMEM培养基作为对照组。

上述各组在细胞培养箱中孵育1h后，弃去培养基，PBS洗3次，再加入100μl/孔含10％(体积百分含量)FBS的DMEM培养基和20μl/孔MTS，细胞培养箱中孵育3h后，检测492nm处吸光值，并根据如下公式计算MDCK细胞的存活率。

细胞存活率(％)＝实验组492nm处吸光值/对照组492nm处吸光值×100

进一步通过Epsilon浓度-细胞存活率曲线确定Epsilon毒素对MDCK细胞的半数致死剂量，结果如图3所示，Epsilon毒素对MDCK细胞毒性的半数致死剂量约为100ng/ml。

3、不同浓度的2-APB与MDCK细胞孵育

使用2.4ml DMSO溶解50mg 2-APB(Tocris，英国，货号1224)，再加入42ml含10％(体积百分含量)FBS的DMEM培养基将其稀释至5mM母液，随后用含10％(体积百分含量)FBS的DMEM培养基将其分别稀释为720、653、586、518、450、383、315、248、180、0mg/L共10个梯度，按照100μl/孔体积将其加入步骤1中制备的96孔细胞板内。在细胞培养箱中与MDCK细胞一起孵育30min，得到2-APB与MDCK细胞共孵育细胞板。

4、Epsilon毒素攻击细胞

实验组(100ng/mL GST-Epsilon+2-APB)：将上述一制备的Epsilon毒素GST-Epsilon用含10％(体积百分含量)FBS的DMEM培养基稀释至终浓度为100ng/ml，按照100μl/孔体积分别加入上述步骤3获得的2-APB与MDCK细胞共孵育细胞板内；

对照组：将上述一制备的Epsilon毒素GST-Epsilon用含10％(体积百分含量)FBS的DMEM培养基稀释至终浓度为100ng/ml，按照100μl/孔体积加入仅添加MDCK细胞的96孔板(即步骤1中制备的96孔细胞板)。

细胞培养箱中孵育1h后，弃去培养基，PBS洗3次，再加入100μl/孔含10％(体积百分含量)FBS的DMEM培养基和20μl/孔MTS，细胞培养箱中孵育3h后，检测492nm处吸光值，并根据上述步骤2中的公式计算细胞存活率。

2-APB抑制Epsilon毒素对MDCK细胞毒性能力变化如图4所示，结果表明，2-APB对Epsilon毒素引起的MDCK细胞毒性作用有显著的抑制效果，有效降低Epsilon毒素引起的MDCK细胞的死亡率。

三、2-APB对Epsilon毒素攻毒小鼠的保护作用

前面步骤二的体外实验中，2-APB能有效抑制Epsilon毒素对MDCK细胞的毒性作用，推测其有望成为良好的Epsilon毒素中毒救治药物。

为了验证这一推测，拟在动物体内进行2-APB对Epsilon毒素攻毒动物的保护作用研究，具体实验设计如下：

1、Epsilon毒素对小鼠的致死率

实验选取6周龄BALB/c雄性小鼠(购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，中国)，将其随机分为5组，每组5只，分别腹腔注射不同浓度(12800、6400、3200、1600、0ng/kg)的上述步骤一中制备的0.1ml Epsilon毒素GST-Epsilon，连续三天观察小鼠状态，并记录其存活率。其中Epsilon毒素GST-Epsilon为0ng/kg时表示只注射等体积的PBS，作为空白对照。

结果如图5所示，12800ng/kg组小鼠在3小时内全部死亡，6400ng/kg组小鼠在8小时内全部死亡，3200ng/kg组小鼠在72小时内3只死亡，其余各组在72小时内均存活。因此，选择Epsilon毒素浓度为6400ng/kg进行后续实验。

2、2-APB抑制Epsilon毒素对小鼠的致死率

实验选取6周龄BALB/c雄性小鼠，将其随机分为2组，每组10只，分别是：

3mg/kg 2-APB+6400ng/kg Epsilon组(2-APB+Epsilon组)：前三天内，每天腹腔注射0.1ml 2-APB(3mg/kg)，第三天注射2-APB 30min后，腹腔注射0.1ml Epsilon毒素(6400ng/kg)；

6400ng/kg Epsilon组(Epsilon组)：前三天内，每天腹腔注射0.1ml PBS，第三天注射PBS 30min后，腹腔注射Epsilon毒素(6400ng/kg)。

随后，连续三天观察小鼠状态，并记录其存活率。

实验结果如图6所示，与Epsilon组(8小时生存率即降为0)相比，2-APB+Epsilon组加入2-APB可以有效降低Epsilon毒素对小鼠的毒性作用，显著提高Epsilon毒素攻毒后小鼠的生存率，小鼠生存率为100％，可见2-APB具有很好的Epsilon毒素中和能力，对Epsilon毒素中毒小鼠具有很好的保护作用，进一步表明2-APB在动物体内同样具有很好的治疗作用。

综上，无论是体外细胞实验，还是体内小鼠实验，实验结果均表明，2-APB能够有效降低或抑制Epsilon毒素的毒性，提高动物抵抗Epsilon毒素攻击的能力，可作为一种理想的Epsilon毒素抑制剂用于预防或治疗Epsilon毒素引起的疾病。因此，2-APB有望成为Epsilon毒素中毒相关疾病预防和治疗的有效药物，具有良好的临床应用前景，同时为Epsilon毒素研究开拓新的思路。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。