一种与小麦籽粒宽度相关的KASP引物组与应用

技术领域

本发明涉及小麦遗传育种领域，特别是涉及一组与小麦籽粒宽度QTL位点QgWD_1A相关的KASP标记的开发及其应用。

背景技术

小麦(Triticum aestivum L)是世界上最重要的主粮作物之一，为全世界人口提供了约20％的能量摄入和重要的蛋白质来源(Pfeifer M,Kugler K,Sandve S,et al.(2014)Genome interplay in the grain transcriptome of hexaploid breadwheat.Science 345:1250091)。随着人口的激增和极端气候频发，全球粮食供应面临巨大挑战，我国是世界上最大的小麦生产国和消费国，提高小麦产量和品质对保障我国乃至世界粮食安全和稳定具有重要意义(刘志勇,王道文,张爱民等.(2018)小麦育种行业创新现状与发展趋势.植物遗传资源学报19(03):430-434)。

小麦产量是一个复杂的数量性状，由单位面积穗数、穗粒数以及粒重三个因素构成。其中，小麦粒重通常用千粒重衡量，因其表型较稳定，具有较高遗传力，是小麦高产育种的重要选择指标。小麦粒重主要由籽粒大小决定，而籽粒大小又可以进一步分解为粒长、粒宽、粒厚等构成要素。有研究表明：粒长，粒宽等粒形要素均与粒重呈极显著正相关，且相关性大小为依次为粒宽>粒厚>粒长(魏玮,郭嘉莲,万琳涛等.(2016)小麦粒重形成的分子调控机制研究综述.浙江农林大学学报33(02):348-356)。此外，籽粒宽度还与籽粒磨粉质量密切相关，大而圆、且饱满的籽粒比小、薄且扁平的籽粒具有更高的面粉品质，决定着小麦的市场分级和商品价值(Dholakia B.(2003)Molecular marker analysis of kernelsize and shape in bread wheat.Plant Breeding 122:392-395)。因此，挖掘小麦粒宽相关QTL，并开发与其紧密连锁的分子标记对于小麦粒形改良、提高小麦产量和品质具有重要意义。

分子标记辅助选择(Marker-assisted Selection，MAS)利用与控制目标性状的QTL(Quantitative trait loci,数量性状位点)/基因紧密连锁或表现共分离的分子标记对选择个体进行目标以及全基因组筛选，可以从DNA水平上准确快速地分析个体的遗传组成，实现对表型性状的选择，且不受作物生长阶段的限制，结果精确稳定。该技术尤其在对小麦这样基因组巨大的作物中、针对包括粒宽这样复杂性状的鉴定、选择以及功能基因的聚合等方面具有不可替代的优势，可极大加快育种进程(王玉杰,冷春旭,孙中义等.(2022)浅析生物技术在作物育种中的应用.农业科技通讯2:4-6)。KASP(kompetitive allelespecific pcr)是近年兴起的一种基于荧光信号的同质基因分型技术，可实现对特定位点上的SNPs和插入缺失(insertion-deletions，InDels)序列进行精准的双等位基因检测。该技术极大克服了常用标记类型如RFLP、AFLP、DArT、SSR等检测步骤繁琐、成本高、周期长，不易对育种后代材料进行大规模筛选的缺点，通过巧妙在引物末端加入特定的荧光基团，读取PCR终端荧光信号确定个体基因型，具有结果精确、可操作性强、成本低等优点，特别适于育种工作中对大量遗传品系的高效检测需要，在农作物性状改良等领域具有很大的应用潜力。目前，有关小麦粒形遗传改良中育种可用的分子标记鲜有报道，开发适合于高通量鉴定优异粒宽基因型的育种可用的KASP分子标记，将为培育理想粒形的、高产、优质小麦品种提供有实用价值的分子检测新工具，加快育种进程。

发明内容

本发明的目的是基于首次发现的控制小麦籽粒宽度的QTL位点QgWD_1A，提供一种与小麦籽粒宽度相关的KASP分子标记与应用，QTL位点QgWD_1A能够显著增加小麦籽粒宽度，与之对应的KASP标记可简便、精确地实现对小麦理想粒宽类型的高通量鉴定与辅助选择，对优化小麦粒形、提高小麦产量和品质具有很高的应用价值。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种与小麦籽粒宽度相关的KASP引物组，所述KASP引物组包括核苷酸序列如SEQID NO.1所示的正向竞争性引物KASP-1A_542825309-1、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的正向竞争性引物KASP-1A_542825309-2、核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的反向通用性引物KASP-1A_542825309-3。

所述KASP引物组是基于小麦籽粒宽度QTL位点QgWD_1A开发的，QgWD_1A位于小麦的1A染色体上，在中国春参考基因组IWGSC RefSeq v1.0上的物理位置为542.83Mb-574.34Mb之间，其两侧的SNP分子标记分别是1A_542825309和1A_574338192。

所述KASP引物组的正向竞争性引物KASP-1A_542825309-1与正向竞争性引物KASP-1A_542825309-2的5’端连接有不同的荧光基团标签。

所述正向竞争性引物KASP-1A_542825309-1的5’端连接有如SEQ ID NO.7所示的FAM荧光基团标签；所述正向竞争性引物KASP-1A_542825309-2的5’端连接有如SEQ IDNO.8所示的HEX荧光基团标签。

所述的KASP引物组在检测小麦籽粒宽度中的应用。

所述应用包括以下任意一种或多种：

(1)所述KASP引物组用于检测小麦籽粒宽度QTL位点QgWD_1A和相关基因定位；

(2)所述KASP引物组用于选育和创制理想粒宽小麦品种；

(3)所述KASP引物组用于推广小麦籽粒宽度QTL位点QgWD_1A与小麦的其它优良性状位点间聚合育种。

所述应用包括以下步骤：以待测小麦的基因组DNA为模板，利用所述KASP引物组进行PCR扩增反应，获得扩增产物；再采用荧光检测平台对扩增产物进行荧光信号扫描与基因分型，若待测小麦出现所述正向竞争性引物KASP-1A_542825309-1的荧光信号，而未出现所述正向竞争性引物KASP-1A_542825309-2的荧光信号，则将该小麦记为A基因型；若待测小麦出现所述正向竞争性引物KASP-1A_542825309-2的荧光信号，而未出现所述正向竞争性引物KASP-1A_542825309-1的荧光信号，则将该小麦材料记为B基因型；A基因型小麦的籽粒宽度大于B基因型小麦。

所述PCR扩增反应的条件如下：

PCR扩增体系：浓度为120ng/ul的模板DNA 2.5μL，2×KASP Master Mix 5μL，KASPAssay Mix 0.14μL,ddH

其中，每100μL的KASP Assay Mix的配制方法如下：浓度为100μM的正向引物KASP-1A_542825309-1 12μL、浓度为100μM的正向引物KASP-1A_542825309-2 12μL、浓度为100μM的反向通用引物KASP-1A_542825309-3 30μL、ddH

PCR扩增程序：94℃热激活15min；94℃变性20s，61～55℃退火和延伸60s；10个touch-down循环，每次循环降低0.6℃；94℃变性20s，55℃复性60s，26个循环；

最后扩增产物于30℃保温，读取并解析荧光信号，得到清晰直观的基因分型图。

有益效果：相比于现有技术，本发明具有以下有益效果：

1)长江中下游麦区是我国重要的小麦主产区之一，扬麦158和宁麦9号曾在该产区小麦生产上占主导地位，迄今依然作为小麦的骨干亲本，其优良性状QTL定位与育种标记开发对小麦的育种改良意义重大。本申请利用扬麦158和宁麦9号构建高代重组自交群体，通过表型考察和连锁分析最终定位到一个控制小麦籽粒宽度的QTL位点QgWD_1A，QgWD_1A位于小麦1A染色体上，其物理位置为542.83Mb-574.34Mb，该QTL能够显著地增加小麦籽粒宽度，不仅可以为小麦籽粒形态优化以及产量和品质育种提供新的遗传位点和基因资源，也可进一步结合分子标记辅助选择在育种中加以转化和利用，促进对籽粒性状的分子优化，对于小麦高产、优质育种具有潜在的利用价值。

2)进一步，本申请针对该QTL位点QgWD_1A开发了可用于精确、高效地检测籽粒宽度QTL QgWD_1A的KASP分子标记及其应用方法，该分子标记与QgWD_1A紧密连锁，具有扩增稳定，分辨率高、分型精准的优点，非常契合在育种实践中对大规模遗传品系优异基因型的高效检测需求，可用于小麦籽粒宽度的高通量筛选。

3)利用本申请提供的KASP分子标记引物组合可促进小麦籽粒宽度QTL QgWD_1A在籽粒形态优化、产量及品质育种中的应用，实现靶标性状的早期预测和辅助选择，提升育种效率；也可辅助实现优异籽粒宽度位点/基因型与其他优良性状进行聚合，加快选育籽粒性状理想、综合性状优良的小麦新品种。

附图说明

图1为控制小麦籽粒宽度QTL位点QgWD_1A的遗传定位示意图；

图2为本发明所提供KASP分子标记组合的分型效果和对各小麦群体/品系验证材料的基因型检测结果图；

其中，a为KASP分子标记组合在检测样本中的分型效果图，b为KASP分子标记组合在扬麦158和宁麦9号衍生的BC1F7家系材料中的检测结果，c为KASP分子标记组合在小麦主载品种和育种品系材料中的检测结果；坐标轴数值代表等位基因荧光信号强度，左下角的点代表阴性对照(NTC)(即ddH

图3为扬麦158和宁麦9号衍生的BC1F7家系经KASP分子标记检测出的两种不同基因型的籽粒宽度比较结果图；其中：A、B为两种基因型，GWD代表籽粒宽度；

图4为供试小麦主载品种和育种品系经KASP分子标记检测出的两种不同基因型的籽粒宽度比较结果图；其中：A、B为两种基因型，GWD代表籽粒宽度。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做更进一步的解释。

本发明基于小麦籽粒宽度QTL位点QgWD_1A设计了一种KASP引物组，QgWD_1A位于小麦的1A染色体上，在中国春参考基因组IWGSC RefSeq v1.0上的物理位置为542.83Mb-574.34Mb之间，其两侧的SNP分子标记分别是1A_542825309和1A_574338192。

KASP引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向竞争性引物KASP-1A_542825309-1、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的正向竞争性引物KASP-1A_542825309-2、核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的反向通用性引物KASP-1A_542825309-3。

KASP-1A_542825309-1：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTgagcagtagatcatcaccctacT(SEQID NO.1)；

KASP-1A_542825309-2：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTgagcagtagatcatcaccctacC(SEQID NO.2)；

KASP-1A_542825309-3：ataatctgctaatgaaccacttggc(SEQ ID NO.3)。

KASP引物组的正向竞争性引物KASP-1A_542825309-1与正向竞争性引物KASP-1A_542825309-2的5’端连接有不同的荧光基团标签。具体的，正向竞争性引物KASP-1A_542825309-1的5’端连接有如SEQ ID NO.7所示的FAM荧光基团标签；正向竞争性引物KASP-1A_542825309-2的5’端连接有如SEQ ID NO.8所示的HEX荧光基团标签。

FAM:GAAGGTGACCAAGTTCATGCT(SEQ ID NO.7)

HEX:GAAGGTCGGAGTCAACGGATT(SEQ ID NO.8)

本发明的KASP引物组能够应用在检测小麦籽粒宽度中，具体包括以下任意一种或多种：

(1)所述KASP引物组用于检测小麦籽粒宽度QTL位点QgWD_1A和相关基因定位；

(2)所述KASP引物组用于选育和创制理想粒宽小麦品种；

(3)所述KASP引物组用于推广小麦籽粒宽度QTL位点QgWD_1A与小麦的其它优良性状位点间聚合育种。

应用包括以下步骤：以待测小麦的基因组DNA为模板，利用上述KASP引物进行PCR扩增，再利用荧光定量PCR仪对扩增产物进行荧光信号扫描，根据荧光信号对待测小麦材料进行基因分型：若待测小麦材料出现KASP引物组的正向竞争性引物KASP-1A_542825309-1的荧光基团信号(荧光信号值聚合在接近Y轴、显示蓝色的样本)，而不含有正向竞争性引物KASP-1A_542825309-2的荧光基团信号，则认为该待测小麦材料含有所述的小麦籽粒宽度QTL位点QgWD_1A，记为A基因型(扬麦158基因型类型)；若待测小麦材料出现KASP引物组的正向竞争性引物KASP-1A_542825309-2的荧光基团信号(荧光信号值聚合在接近X轴、显示红色的样本)，而不含有正向竞争性引物KASP-1A_542825309-1的荧光基团信号，则认为该待测小麦材料不含所述的小麦籽粒宽度QTL位点QgWD_1A，记为B基因型(宁麦9号基因型类型)，则判断A基因型小麦株系的籽粒宽度显著高于B基因型小麦株系。上述待测小麦品种优选长江中下游麦区(该麦区的定义参见程顺和等(2012)(程顺和,郭文善,王龙俊等.(2012)《中国南方小麦》.江苏科学技术出版社)小麦。

以上所涉及的PCR扩增反应体系的总体积为10μL，其中包括：浓度为120ng/ul的基因组DNA 2.5μL,2×KASP Master Mix(LGC)5μL,KASP Assay Mix 0.14μL,ddH

其中，KASP Assay Mix配制方法为：每100μL KASP Assay Mix包含浓度为100μM的所述正向引物KASP-1A_542825309-1 12μL、浓度为100μM的所述正向引物KASP-1A_542825309-2 12μL、浓度为100μM的反向通用引物KASP-1A_542825309-330μL、ddH

PCR扩增反应程序为：1)94℃热激活15min；2)94℃变性20s，61～55℃退火和延伸60s(10个Touch-down循环，每次循环降低0.6℃)；3)94℃变性20s，55℃复性60s，26个循环。扩增产物30℃保温，读取并解析荧光信号，得到清晰直观的基因分型图。

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

下述实施例中所用的试剂、设备等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明中所用的小麦材料均为江苏省省级种质资源库(农作物)—扬州大学农学院保存的种质资源材料，可被本领域技术和研究人员获得使用。

实施例1小麦籽粒宽度QTL位点QgWD_1A的遗传定位及标记区间的获得

(1)本实施例以长江中下游小麦骨干亲本扬麦158和宁麦9号分别作为父、母，杂交获得F1代，F1代自交得到F2代，再通过单粒传法获得含有282个株系的高代重组自交系(RIL)遗传群体；同时以扬麦158为轮回亲本，通过与F1回交再不断自交，构建了包含480个家系的BC1F7群体。

(2)利用illumina 90k基因芯片对宁麦9号×扬麦158RIL群体进行全基因组扫描，利用QTL IciMapping v4(Meng L,Li H,Zhang L,et al.(2015)QTL IciMapping:Integrated software for genetic linkage map construction and quantitativetrait locus mapping in biparental populations.Crop J 3:269-283)的bin功能删除冗余标记，构建连锁遗传图谱，图谱覆盖小麦的21条染色体，全长3,022cM。

(3)于2020-2021和2021-2022连续2年将上述RIL群体种植于扬州大学试验基地(119.41°E,32.35°N)，采用完全随机区组设计，三次重复，单行区，行长1.2m，行距0.3m。试验基地土壤质地均匀，在成熟收获之前，参考马鸿翔等(2021)(马鸿翔,顾克军,陈怀谷(2021)《小麦产业关键实用技术100问》,中国农业出版社.)公开的方法，给予完全一致的田间管理。待籽粒成熟，每株系均随机收获5株长势均匀的植株，籽粒脱粒后经自然晾晒，再从中随机选择1,000粒种子进行籽粒相关性状的表型考察。使用SC-G籽粒自动考种分析仪(万深，中国)对籽粒宽度进行测定，取其平均值用于数据分析。

(4)联合基因型与表型数据，利用软件QTL IciMapping v4，采用完备区间作图法(ICIM-ADD)进行籽粒宽度性状QTL定位，以LOD值2.5作为显著性的阈值。最终定位到一个来源于扬麦158的正调控籽粒宽度且在不同环境下都检测到的稳定QTL，申请人将其自命名为QgWD_1A，其遗传定位如图1所示。QgWD_1A位于小麦1A染色体上，其两侧的SNP分子标记分别是1A_542825309和1A_574338192，在中国春参考基因组IWGSC RefSeq v1.0上的物理位置为542.83Mb-574.34Mb之间。

实施例2KASP分子标记的开发、筛选与验证

(1)为了更好地对实施例1中遗传定位获得的籽粒宽度位点QgWD_1A进行育种利用，针对其区间标记SNP组成，进一步开发适用于高通量基因分型的KASP分子标记。如表1所示，所述SNP分别为1A_542825309和1A_574338192。首先分别调取上述各SNP位点上下游150bp的序列信息，再利用Primer Premier5(http://www.premierbiosoft.com/primerdesign/)设计多组扩增引物，然后利用DNAMAN对所设计的引物质量进行评估，进一步利用Ensembl Plants小麦基因组数据库进行引物特异性检测，最后将筛选后的能够特异性识别靶标位点、且满足PCR扩增原则要求的引物序列转化为KASP引物(杨青青,唐家琪,张昌泉等.(2022)KASP标记技术在主要农作物中的应用及展望.生物技术通报38(04):58-71)，所涉及到的KASP引物组序列如表1所示，每一组引物由3条序列组成，即：正向竞争性引物1：FAM荧光标签序列+扩增引物序列；正向竞争性引物2：HEX荧光标签序列+扩增引物序列；反向通用性引物：扩增引物序列；其中，FAM荧光标签序列和HEX荧光标签序列的核苷酸序列如下：

FAM标签序列(SEQ ID NO.7)：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’(可结合FAM荧光基团)；

HEX标签序列(SEQ ID NO.8)：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’(可结合HEX荧光基团)。

表1KASP引物设计

注：SNP组成(a/b)中a代表扬麦158变异类型，b代表宁麦9号变异类型。

(2)从宁麦9号×扬麦158RIL群体中随机选取50份材料，连同两个亲本一起取其幼嫩叶片，参照Stein等(2001)(Stein N,Herren G,and Keller B(2001)Anew DNAextraction method for high-throughput marker analysis in a large-genomespecies such as Triticum aestivum.Plant Breed 120:354-356)，采用CTAB法从中提取基因组DNA，灭菌ddH

利用表1中获得的KASP引物组进行PCR扩增，反应体系、扩增程序和基因型分型方法具体如下：

1)PCR反应体系：总体积为10μL，包括样品DNA(120ng/ul)2.5μL,2×KASP MasterMix(LGC Genomics,Hoddeston,UK)5μL,KASP Assay Mix 0.14μL,ddH

其中，KASP Assay Mix配制方法如下：每100μL KASP Assay Mix包含浓度为100μM的两条正向竞争性引物各12μL、浓度为100μM的反向通用性引物30μL、ddH

2)PCR反应程序：94℃热激活15min；94℃变性20s，61～55℃退火延伸60s(10个Touch-down循环，每次循环降低0.6℃)；94℃变性20s，55℃复性60s，26个循环。扩增产物30℃保温。

3)基因型分型：利用荧光定量PCR仪Applied Biosystems ABI Viia7 Real TimePCR System(Thermo Scientific,USA)扫描荧光信号并进行基因型分型，具体是：荧光信号强度值聚合在接近Y轴、显示蓝色的样本的荧光类型代表FAM荧光基团，为扬麦158基因型类型；荧光信号强度值聚合在接近X轴、显示红色的样本的荧光类型代表HEX荧光基团，为宁麦9号基因型类型；聚合在接近原点、显示黑色的样本为空白对照。

根据分型结果，最终筛选出一组扩增效率高、分型清晰，且与对应基因型亲本聚集完全一致的KASP引物组(如图2中a所示)，申请人将该引物组自命名为KASP

实施例3KASP

(1)为了对实施例2中获得的分子标记KASP

(2)KASP

最终结果与扬麦158相同荧光信号的记为A基因型，与宁麦9号相同荧光信号的记为B基因型(表2)。

表2宁麦9号×扬麦158高代回交群体供试株系的基因型与表型

统计分析采用SPSS19.0。对比表2中A、B基因型，和分别携带这两种基因型材料的籽粒宽度表型数据，结果发现携带A基因型类型的小麦籽粒宽度大于携带B基因型类型的小麦籽粒宽度(图3)。

采用双尾t检验，结果进一步表明，高籽粒宽度基因型(A基因型)与低籽粒宽度基因型(B基因型)的表型差异达到极显著水平(表3)。

表3高代回交群体中供试株系基因型—表型统计分析结果

注：*表示显著性水平0.05下呈现差异，**表示显著性水平0.01下呈现差异。

由此可见，携带所提供QTL位点QgWD_1A优势基因型A能够显著增加小麦籽粒宽度，与之相关的KASP标记能够完成对优势等位变异的精准分型。

(3)KASP

最终结果与扬麦158相同荧光信号的记为A基因型，与宁麦9号相同荧光信号的记为B基因型(表4)。

表4随机选取的232份小麦育成品种和育种品系的基因型与表型

/>

/>

/>

/>

注：E1为江苏镇江丹徒试验(119.31°E,32.21°N)表型考察结果，E2为江苏南京六合试验(118.68°E,32.50°N)表型考察结果；NA代表缺失数据，缺失数据的小麦品种/品系不进行统计。

统计分析采用SPSS19.0。对比表4中A、B基因型，和分别携带这两种基因型材料的籽粒宽度表型数据，结果发现携带A基因型类型的小麦籽粒宽度大于携带B基因型类型的小麦籽粒宽度(图4)。

采用双尾t检验，结果进一步表明，高籽粒宽度基因型(A基因型)与低籽粒宽度基因型(B基因型)的表型差异达到极显著水平(表5)。

表5供试小麦品种/品系材料基因型—表型统计分析结果

注：E1为江苏镇江丹徒试验(119.31°E,32.21°N)表型考察结果，E2为江苏南京六合试验(118.68°E,32.50°N)表型考察结果；*表示显著性水平0.05下呈现差异，**表示显著性水平0.01下呈现差异。

综上结果可见，携带所提供QTL位点QgWD_1A的基因型能够显著增加小麦籽粒宽度，与之相关的KASP标记与QgWD_1A紧密连锁，具有扩增稳定，检测方便快捷、结果精准可靠的特点，可用于分子标记辅助育种，满足育种实践中对大规模遗传品系优异基因型的高效检测需求，且不受作物生长发育周期的限制，促进对籽粒形态性状的早期预判和分子优化，节约育种成本，提高育种效率。同时，也可辅助实现优异籽粒宽度位点/基因型与其他优良性状进行聚合，加快选育籽粒性状理想、综合性状优良的小麦新品种。

以上实施例中供试小麦包括由长江中下游骨干小麦品种扬麦158和宁麦9号作为亲本衍生的群体材料、已通过品种审定的长江中下游麦区主栽小麦品种，以及利用长江中下游麦区主要品种杂交所获得的小麦高代(F7～F8)育种品系，因此鉴定获得的QTL位点QgWD_1A以及开发的KASP分子标记KASP

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。