一种可视化智能感应控释抗菌涂层及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医疗材料技术领域，具体涉及一种可视化智能感应控释抗菌涂层及其制备方法和应用。

背景技术

气管插管是危重病患者抢救中建立通畅气道的简捷有效的方法，气管插管所建立的人工气道，是危重患者身上最重要的一条“生命线”，临床中每天需要进行气管插管机械通气的患者不计其数，其并发症中的植入物相关感染成为临床医生亟待解决的问题。机械通气过程中最常见且最严重的并发症—呼吸机相关性肺炎(Ventilator associatedpneumonia，VAP)，发病率高，一旦发生又得不到有效控制时，大大增加了患者治疗风险和身心折磨，也极大地增加了医疗经济负担，同时患者的死亡率明显增高。

研究表明，气管插管导致的呼吸道感染及呼吸机相关性肺炎常见的病原菌是鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌等，而且这些细菌在气管插管患者中可以相继或重叠出现，表现出多重耐药甚至泛耐药，尤其是细菌生物被膜一旦形成，由于生物膜的屏障作用及生物膜内细菌低代谢等特点，其耐药性可提高成百上千倍，使得疗效堪忧，患者常常由于无法有效控制呼吸道感染而死亡。因此，研制新型抗菌涂层，并进一步制备新型抗菌气管导管，从源头预防或减少气管插管呼吸机相关性肺炎的发生，对于提高危重患者救治成功率，减少医疗经济负担，减轻患者身心痛苦具有重要意义。

发明内容

基于此，本发明提供了一种可视化智能感应控释抗菌涂层及其制备方法和应用。本专利技术为早期诊断细菌感染提供依据，有助于减少患者不必要的有创检测，实现涂层智能控释，能够根据细菌感染情况做出响应释药，将抗菌策略优化高效化，可用于VAP防治中，具有较大的应用潜力。

作为了达到上述技术效果，本发明采用的技术方案为：

一种可视化智能感应控释抗菌涂层，由氧化羧甲基纤维素，壳聚糖，FK13-a1多肽，抗生素美罗培南，pH指示剂组成。

优选地，所述FK13-a1多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

WKRIVRRIKRWLR-NH2(SEQ ID NO.1)；

优选地，所述pH指示剂为溴麝香草酚蓝。

本发明还提供了一种可视化智能感应控释抗菌涂层的制备方法，包括以下步骤：

S1、以羧甲基纤维素为原料合成氧化羧甲基纤维素；

S2、将步骤S1合成的氧化羧甲基纤维素与壳聚糖交联，并向其中加入溴麝香草酚蓝，形成CMCO-CS空白水凝胶；

S3、将抗生素美罗培南载入步骤S2获得的CMCO-CS空白水凝胶上，得到MEM@CMCO-CS；

S4、将多肽FK13-a1载入步骤S3得到的MEM@CMCO-CS上，即得FK-MEM@CMCO-CS涂层。

优选地，步骤S1所述的氧化羧甲基纤维素的具体制备过程如下：将羧甲基纤维素在80℃下溶解于蒸馏水中，冷却至室温后，加入NaIO

优选地，步骤S2所述的CMCO-CS空白水凝胶的具体制备过程为：将制备好的氧化羧甲基纤维素溶解，与等体积的2％壳聚糖醋酸水溶液及溴麝香草酚蓝溶液混合，室温下反应，形成CMCO-CS空白水凝胶，干燥备用。

优选地，步骤S3所述的将美罗培南载入CMCO-CS空白水凝胶上的具体过程为：将CMCO-CS浸泡在美罗培南溶液当中，然后洗去未包载的美罗培南，得到MEM@CMCO-CS，干燥备用。

优选地，步骤S4所述的将FK13-a1多肽载入MEM@CMCO-CS上的具体过程为：在37℃下，将MEM@CMCO-CS浸泡在FK13-a1多肽溶液当中进行席夫碱反应，使FK13-a1多肽结合在薄膜上，形成FK-MEM@CMCO-CS，洗去未负载的FK13-a1多肽，得到FK-MEM@CMCO-CS，干燥备用。

本发明还提供了一种利用所述制备方法制备得到的FK-MEM@CMCO-CS可视化智能感应控释抗菌涂层。

本发明另外提供了一种所述的FK-MEM@CMCO-CS可视化智能感应控释抗菌涂层在制备抗菌医疗导管涂层材料中的应用。

FK13-a1多肽源于人源抗菌肽LL-37的多肽片段，通过渗透和破坏细胞膜来杀灭微生物细胞，该序列被鉴定为负责LL-37抗菌活性的区域，其结构简单易合成，并且保留有高细胞选择性及抗菌抗炎活性，生产成本也大大降低。但目前还没有公开文献报道FK13-a1多肽在抗VAP领域当中发挥作用。

美罗培南(meropenem，MEM)是人工合成的广谱碳青霉烯类抗生素，是临床应对细菌耐药感染的主要治疗药物之一。易穿透大多数细菌的细胞壁，通过抑制细菌细胞壁的合成而产生抗菌作用。是肺炎(包括院内获得性肺炎)；尿路感染；妇科感染及诸多耐药菌感染的首选药物。临床用美罗培南多为进口药物，价格相对昂贵，发明人经过研究发现，将美罗培南与抗菌肽FK13-a1联合使用能够起到协同抗菌的作用，提高抗菌效能，同时还可以降低患者花费，减轻经济负担。

对材料表面进行修饰，形成功能化的医疗抗菌导管，以防止微生物粘附或杀死附着在生物膜上的微生物，是一个日益具有挑战性的领域中的重要策略。基于改善VAP的医疗环境提供一定策略。本发明旨在从源头出发，制备材料表面实现可视化pH感应控释及抗细菌生物膜的导管涂层FK-MEM@CMCO-CS，以解决患者机械通气带来的细菌感染问题。抗菌肽与抗生素协同抗菌提高抗菌效能，同时构建可视化监测体系，使涂层能够直观为早期诊断细菌感染提供依据，能够减少临床不必要的有创检测，智能控释也使得涂层能够根据细菌感染情况做出响应释药，实现最优化抗菌效果，具有重要现实意义。

本发明通过实验发现，FK13-a1多肽及MEM具有抗临床肺炎克雷伯氏菌活性，因此可以用于制备新型抗菌材料，本发明将氧化羧甲基纤维素及壳聚糖交联形成的水凝胶作为FK13-a1及MEM的载体，同时以BTB作为pH指示剂，形成FK-MEM@CMCO-CS抗菌涂层，进一步研究发现，与FK13-a1及MEM相比，FK-MEM@CMCO-CS具备更好的抗菌活性。

与现有技术相比，本发明具有如下技术优势：

(1)采用本发明方法制备的FK-MEM@CMCO-CS抗菌涂层，实验技术简单，对获得的FK-MEM@CMCO-CS抗菌涂层进行抗菌检测研究，发现FK-MEM@CMCO-CS抗菌涂层具有显著的抗菌活性；

(2)本发明建立了可视化监测体系，为早期诊断细菌感染提供依据，减少了患者不必要的有创检测，可以实现涂层智能控释，根据细菌感染情况做出响应释药，将抗菌策略优化高效化，应用前景广阔。

附图说明

图1为FK13-a1多肽及MEM含量测定标准曲线及载药率结果图；

图2为FK-MEM@CMCO-CS在体外pH可视化智能响应结果；

图3为FK-MEM@CMCO-CS在体外累计释药率；

图4为FK-MEM@CMCO-CS涂层FTIR结果；

图5为FK-MEM@CMCO-CS涂层XPS结果；

图6为FK-MEM@CMCO-CS抗菌涂层SEM图；

图7为FK-MEM@CMCO-CS涂层WCA结果；

图8为FK-MEM@CMCO-CS对正常小鼠成纤维细胞L929毒性验证结果；

图9为FK-MEM@CMCO-CS溶血特性结果；

图10为FK-MEM@CMCO-CS抗细菌粘附作用结果；

图11为FK-MEM@CMCO-CS抗细菌生物膜作用结果；

图12为FK-MEM@CMCO-CS在体内可视化监测结果。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料；本发明试验中所用的导管是通过先将导管浸渍在CS溶液中5min，半干状态后再浸入CMCO溶液中5min，向其中加入0.1％的BTB指示剂1min后，进行步骤S3、S4所得；其中，CS、CMCO溶液及BTB的浓度及用量参见实施例1。

FK13-a1的结构如下：

实施例1一种可视化智能感应控释抗菌涂层

所述可视化智能感应控释抗菌涂层的具体制备过程如下：

S1、以羧甲基纤维素为原料合成氧化羧甲基纤维素(CMCO)：将3g羧甲基纤维素在80℃下溶解在100mL蒸馏水中，并将制备的溶液加入到250mL烧瓶中，在30℃下冷却至室温。在室温下，将化学计量计算量(高碘酸钠与邻二醇(羧甲基纤维素的内部羟基)反应1：1)的3g NaIO

S2、将步骤S1合成的氧化羧甲基纤维素与壳聚糖交联，并向其中加入溴麝香草酚蓝(BTB)，形成CMCO-CS空白水凝胶：在35℃下，将制得的2g氧化羧甲基纤维素溶解在100mL蒸馏水中，配置等体积的2％壳聚糖醋酸水溶液(醋酸体积分数为1％)，各取5mL溶液，与500μL、0.1％的BTB指示剂混合，在pH为7，温度为37℃的温度下，反应60s，形成具备pH指示作用的水凝胶，干燥后形成膜状涂层。

S3、将抗生素美罗培南(美平)载入步骤S2获得的CMCO-CS空白水凝胶上，得到MEM@CMCO-CS；

S4、将多肽FK13-a1载入步骤S3得到的MEM@CMCO-CS上，即得FK-MEM@CMCO-CS涂层。

S3、S4的具体过程如下：将步骤S2获得的空白CMCO-CS抗菌涂层(即CMCO-CS空白水凝胶)依次浸泡在32μg/mL的MEM及256μg/mL的FK13-a1多肽当中，分别于35℃下浸泡2h，用蒸馏水洗涤3次以去除未载入薄膜上的MEM及FK13-a1，干燥后得到FK-MEM@CMCO-CS抗菌涂层。

取剩余FK13-a1及MEM溶液，用于紫外定量测试，从而得到FK13-a1及MEM在CMCO-CS当中的负载量。

负载量的计算公式为：负载量(％)＝(W-W

其中W

试验例1可视化响应测试

1.试验对象：实施例1制得的FK-MEM@CMCO-CS抗菌涂层

2.试验过程：将制备完全的涂层导管分别浸渍在pH 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5等的PBS缓冲溶液当中，0.5h后取出，干燥后观察涂层颜色变化。

3.试验结果：具体试验结果如图2所示，由图2可知，BTB在pH为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5下颜色由亮黄-黄绿-蓝色发生转变，同时，菌液(肺炎克雷伯氏菌，CGMCC1.839)在10

试验例2在两种不同介质中的FK13-a1及MEM的释放

1.试验对象：实施例1制得的FK-MEM@CMCO-CS抗菌涂层

2.试验过程：试验分成2组，分别取FK-MEM@CMCO-CS20mg，每组10mg，第一组置于10mL、pH 7.4的PBS中，第二组置于10mL、pH 5.0的PBS中，其余操作相同，保持释放体系温度在37℃，500rpm匀速振荡72h。分别在第2、4、6、8、10、12、24、36、48、60、72h时，取上清1mL，每次取完后同时立即补充1mL对应pH的PBS溶液，采用紫外分光光度法测定药物含量，计算累积释放百分数。

3.试验结果：具体试验结果如图3所示，由图3可知，在pH 5.0的溶液中，FK-MEM@CMCO-CS在72h下FK13-a1及MEM累计释放率分别为65.59％、58.58％；在pH 7.4的溶液中，FK-MEM@CMCO-CS在72h下FK13-a1及MEM累计释放率分别为19.66％、29.23％。由此可知，本发明药物释放率明显低于pH为5.0的溶液，药物含量高。

试验例3傅里叶红外光谱(Fourier transformed infrared，FTIR)

FTIR能够对材料的基团结构进行定性及定量分析

1.试验样品：FK-MEM@CMCO-CS抗菌涂层，溴化钾；

2.试验方法：将FK-MEM@CMCO-CS抗菌涂层研磨成粉末与溴化钾(样品：溴化钾1:100)混匀压片置于红外光谱下(Thermo Scientific Nicolet iS50)进行检测。

3.试验结果：结果如图4所示，由图4可知，氧化羧甲基纤维素氧化成功，FK13-a1及MEM负载成功，形成席夫碱键。

试验例4X射线光电子能谱(X-ray photoelectron spectroscopy，XPS)

XPS能够观测化学位移。从而判断原子氧化态、原子电荷和官能团变化。

1.试验样品：FK-MEM@CMCO-CS抗菌涂层；

2.试验过程：将样品取材至尺寸小于5×5×3mm，进行X射线光电子能谱(ThermoScientific Nexsa)检测。

3.试验结果：试验结果如图5所示，由此可获得FK-MEM@CMCO-CS涂层元素的价态变化。

试验例5扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscope，SEM)

SEM可以对薄膜表面结构直接成像。

1.试验样品：FK-MEM@CMCO-CS抗菌涂层导管，原材料导管；

2.试验过程：将样品置入样品室抽真空，然后对样品表面进行喷金处理，插入电子显微镜(TESCAN MIRA LMS)。

3.试验结果：具体结果如图6所示，由此可知，FK-MEM@CMCO-CS表面相比未处理的材料(即原材料导管)表面形貌发生变化，表面颗粒感增强。

试验例6水接触角测试(Water contact Angle test，WCA):

静态接触角能够评价涂层表面疏水性能，同时也一定程度上反映涂层的组织相容性。材料表面整体由偏疏水性变为亲水性。对与人体接触的医疗器械来说，这种亲水性的增加一方面可以提升材料表面的组织相容性，另一方面也能促进涂层表面与细菌接触，进一步提升抗菌能力。

1.试验样品：FK-MEM@CMCO-CS抗菌涂层薄膜；

2.试验过程：测试前，需确保样品真空干燥，且测试时两面平整，使用水接触角试验机(承德鼎盛JY-82C视频接触角测定仪)对制备好的薄膜进行水接触角抑制角测试。

3.试验结果：具体试验结果如图7所示，由图7可知，水接触角值整体呈现降低趋势，说明涂层的亲水性得以提升。这主要是由于FK13-a1中存在大量的氨基与羟基，同时MEM中存在羧基，这些都为亲水物质，这些使得涂层在与水接触的过程当中容易被湿润。因此，随着在材料表面构建水凝胶涂层，并在其中加入FK13-a1及MEM，材料表面整体由偏疏水性变为亲水性。

试验例7FK-MEM@CMCO-CS涂层导管对L929细胞毒性评价

1.试验样品：FK-MEM@CMCO-CS涂层制成的涂层导管；

2.试验方法：采用CCK-8法评价FK-MEM@CMCO-CS对L929细胞毒性的影响，具体方法如下：

取L929小鼠成纤维细胞，在添加10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素溶液的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，Gibco公司)中，于37℃、5％的CO

将培养基(100μL)中的细胞(每个孔中的细胞密度为10

3.试验结果：试验结果以相对于对照实验的百分比表示。细胞存活率用公式计算：(70％以下为有细胞毒性)，细胞存活率(％)＝(OD实验组-OD空白组)/(OD阳性组-OD空白组)×100％；具体结果如图8所示，CCK-8结果显示FK-MEM@CMCO-CS对L929无细胞毒性。

试验例8FK-MEM@CMCO-CS涂层导管溶血测定

1.试验样品：CMCO-CS，FK@CMCO-CS，MEM@CMCO-CS，FK-MEM@CMCO-CS；

2.试验过程：取大鼠血液，采血管1200g离心15min后收集红细胞，PBS洗涤3遍后，制备成2％红细胞悬液。试验分成6组，分别为阴性组、阳性组、CMCO-CS导管组、FK@CMCO-CS导管组、MEM@CMCO-CS导管组、FK-MEM@CMCO-CS导管组，其中阴性对照为PBS处理，阳性对照组使用1％ Triton X-100处理(2％红细胞PBS悬液及Triton X-100：红细胞悬液1：99(v/v)共300μL)，其他组分别与300μL体积比2％(v/v％)的红细胞悬液均匀混合，37℃水浴1h后再离心15min，各取200μL加入96孔板测量OD540nm，拍照记录结果。小鼠及人源红细胞样品处理结果同上。

3.试验结果：具体试验结果如图9所示，由此可知，FK-MEM@CMCO-CS涂层对于小鼠、大鼠、人源红细胞的溶血率均低于5％，这进一步表明FK-MEM@CMCO-CS涂层不会产生明显的溶血反应。阳性对照组溶血率为100％。

试验例9FK-MEM@CMCO-CS涂层抗细菌黏附

1.试验样品：PVC、CMCO-CS、FK@CMCO-CS、MEM@CMCO-CS、FK-MEM@CMCO-CS；R.Kpn和MRSA；

2.试验过程：将培养好的R.Kpn(GDMCC 1.3691)和MRSA(GDMCC 1.536)用LB培养液稀释至OD600＝0.05备用。将制备好的PVC、CMCO-CS、FK@CMCO-CS、MEM@CMCO-CS、FK-MEM@CMCO-CS涂层薄膜于紫外灯下灭菌备用。分别取MRSA、R.Kpn菌液25μL，37℃下孵育3h，对于黏附性试验，将涂层导管浸入2mL PBS缓冲液中，并进行3min的超声处理。将10

3.试验结果：具体试验结果如图10所示，图10中，a为菌落涂布结果；b、c为统计结果；由图10可知，FK-MEM@CMCO-CS涂层上的细菌显著减少，这表明其在抗细菌粘附上展现出较好的性能。

试验例10FK-MEM@CMCO-CS涂层导管抗细菌生物膜

1.试验样品：PVC导管，CMCO-CS涂层导管，FK@CMCO-CS涂层导管，MEM@CMCO-CS涂层导管，FK-MEM@CMCO-CS涂层导管；

2.试验过程：将培养好的R.Kpn和MRSA用LB培养液稀释至OD600＝0.05备用。取24孔板，将PVC导管、CMCO-CS、FK@CMCO-CS、MEM@CMCO-CS、FK-MEM@CMCO-CS涂层导管分别浸没在1mL的LB菌液当中，37℃共孵育24h后，各组导管标本用生理盐水冲洗3次以冲走非黏附细菌，继而放在装有1mL生理盐水的无菌试管中，然后把试管放在水浴超声器振荡(150W，4000HZ，10min)以振下黏附细菌，用无菌生理盐水10倍系列稀释，取100μL连续稀释液涂布于LB培养皿，37℃恒温培养箱过夜培养，次日菌落计数。另取一组，在洗脱非黏附细菌后对导管壁上生物膜进行结晶紫染色，统计吸光度值。

3.试验结果：具体试验结果如图11所示。由此可知，PVC导管上逐渐大量产生MRSA和R.Kpn生物膜。FK-MEM@CMCO-CS涂层显著抑制了两种受试细菌生物膜形成。与未涂覆的PVC相比，培养72小时后，MRSA和R.Kpn生物膜形成分别被抑制99％和96％。如先前结果所示，涂层的抗生物膜作用可能与浮游细胞数量的减少和细菌附着有关。

试验例11FK-MEM@CMCO-CS涂层体内可视化监测结果

1.试验样品：FK-MEM@CMCO-CS涂层导管；

2.试验动物：56只SD大鼠适应性培养1周，体重约为200g。随机分成7组，每组8只，雌雄对半。

3.试验过程：分别为空白无菌导管组(Control组)、BF导管组(Model组)、CMCO-CS导管组、FK@CMCO-CS导管组、MEM@CMCO-CS导管组、FK-MEM@CMCOCS导管组，阳性药组(CAZ)给药一周。

建立气管插管导管的动物模型(VAP大鼠模型)，每天固定时间称重。Control组插入无菌导管并固定；Model组插入BF导管并固定；FK@CMCO-CS导管组插入FK@CMCO-CS导管并固定；MEM导管组插入MEM@CMCO-CS导管并固定；FK-MEM@CMCO-CS导管组插入FKMEM@CMCO-CS导管并固定；阳性药组将BF导管插入气管固定，按400mg/mL，200μL/d剂量肌注CAZ给药一周。无菌环境培养大鼠，每天供应足量灭菌水和饲料，饲养7d后处死大鼠。试验过程中，对大鼠体内导管进行可视化监测，期间观察并拍照记录涂层导管感染前后颜色变化情况。

判断VAP大鼠模型的构建成功：当导管进入气管时有轻微阻力感，同时动物出现轻度咳呛，导管内壁可见蒸汽贴壁，此时可判断造模成功。

涂层导管植入气管前需用细菌诱导感染进行预处理。

3.试验结果：具体试验结果如图12所示，由此可知，Control组涂层导管表面略浑浊；Model组及CMCO-CS组由浅黄色转变成深黄色；FK@CMCO-CS组及MEM@CMCO-CS组由浅蓝色转变为蓝绿色；FK-MEM@CMCO-CS组仍然保持浅蓝色未见明显变化，Positive组由淡黄色转变为浅蓝色。这表明，涂层能够一定程度上随着细菌感染程度进行可视化监测。

最后，需要说明的是，上述实施例仅例示性说明本发明的原理、性能及功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。