基于胶乳增强免疫比浊法测定N-MID的试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物检测试剂制备领域，具体涉及基于胶乳增强免疫比浊法测定N-MID的试剂盒及其制备方法。

背景技术

人N端中段骨钙素(N-MID Osteocalcin)：骨钙素是成熟成骨细胞分泌的一种非胶原骨基质蛋白，占骨基质中非胶原蛋白成分的25﹪，骨总蛋白的2﹪。完整的骨钙素有49个氨基酸组成，相对分子质量为5800。血清中的骨钙素具有多样性，约三分之一为完整骨钙素，三分之一为骨钙素N端中分子(N-MID)片段，三分之一为氨基酸短肽。骨钙素是成骨细胞功能和骨质矿化的特殊标志物，作为骨转换标志物逐渐被临床应用。目前国内大多数用酶联免疫法测定全段骨钙素，由于全段骨钙素自身稳定性较差，标本存放温度与时间会影响实验结果。

检测N-MID的方法主要基于抗原抗体反应.现有某公司已注册N-MID测定试剂盒(荧光免疫层析法)与(电化学发光免疫层析法)，为境内第二类医疗器械，进口的有电化学发光法测定试剂盒与化学发光法测定试剂盒。目前，市场上N-MID测定试剂盒以免疫学方法为主，但是现有的检测方法存在一定的缺陷，检测步骤繁琐，操作难度较大，且检测的效率低，精密性不佳，检测的结果受操作的影响，并且价格较高。

发明内容

本发明的目的是解决上述的不足，提供一种基于胶乳增强免疫比浊法测定N-MID的试剂盒及其制备方法，旨在解决现有市场上流通的检测骨钙素N端中分子片段的试剂盒缺点，可以使用全自动生化分析仪检测骨钙素N端中分子片段，操作简便、检测速度快、精密度高、重复性好。

为实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了基于胶乳增强免疫比浊法测定N-MID的试剂盒，包括反应缓冲液与N-MID胶乳试剂，所述反应缓冲液与所述N-MID胶乳试剂体积比为4:1，所述反应缓冲液包括0.5-5g/L的缓冲液、10-25g/L的无机盐、15-40g/L的增浊剂、0.5-2ml/L的防腐剂和25-50ml/L的稳定剂，溶剂为纯化水，所述N-MID胶乳试剂包括至少两种胶乳试剂，所述胶乳试剂由单抗与胶乳微球偶联而成。

进一步的，所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、甘氨酸缓冲液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)缓冲液中的任一种。

进一步的，所述无机盐选自氯化钠、氯化镁、氯化钾、氯化锌、氯化钙中的任意一种或两种以上的按任意比例混合的混合物；所述增浊剂选自聚乙二醇1000、聚乙二醇2000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000中的任意一种或两种以上的按任意比例混合的混合物。

进一步的，所述防腐剂为Proclin300或硫柳汞；所述稳定剂选自BSA、蔗糖、甘露醇中的任意一种或两种以上的按任意比例混合的混合物。

根据本发明的另一个方面，基于胶乳增强免疫比浊法测定N-MID的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，量取0.1-0.5ml固含为10％的胶乳微球，加至磷酸盐缓冲液中进行清洗，之后在20000转/分钟的转速下进行离心30min后，去上清，用MES缓冲液对余下沉淀物重悬超声，加入质量浓度为2％的EDAC 0.1ml和质量浓度为4％的NHS 0.2ml进行活化，活化时间为0.5h，制得活化胶乳微球；

步骤2，取至少两株单抗，分别与制得的活化胶乳微球按体积比1:1-1:3混匀，并进行1-2h的偶联，在20000转/分钟的转速下进行离心30min后，去上清，用偶联缓冲液对余下沉淀物重悬超声，制取至少两种偶联后的胶乳微球；

步骤3，向上述至少两种偶联后的胶乳微球中分别加入0.35-0.85ml封闭液进行1-2h的封闭，封闭结束后，在20000转/分钟的转速下进行离心30min后，去上清，加入2-4ml的胶乳保存液重悬超声，得到至少两种胶乳试剂，然后将至少两种胶乳试剂混合均匀，得到N-MID胶乳试剂；

步骤4，称取缓冲液、无机盐、增浊剂、防腐剂和稳定剂，制得反应缓冲液，将反应缓冲液和N-MID胶乳试剂混合，得到基于胶乳增强免疫比浊法测定N-MID的试剂盒。

进一步的，所述N-MID胶乳试剂包括两种胶乳试剂，两种胶乳试剂按照体积比1:1-1:3混合。

进一步的，所述封闭液选自BSA、甘氨酸中的任意一种或两种以上的按任意比例混合的混合物。

进一步的，所述胶乳保存液按重量份包括5-20g/L的缓冲液、4-15g/L的稳定剂、0.5-2ml/L的防腐剂和1-5ml/L的表面活性剂。

进一步的，所述表面活性剂选自吐温-20、吐温-80、曲拉通X-100中的任意一种或两种以上的按任意比例混合的混合物。

本发明提供的基于胶乳增强免疫比浊法测定的N-MID试剂盒，可以使用全自动生化分析仪检测N-MID，操作简便、检测速度快、精密度高、重复性好、检测结果不受操作影响并且价格上会有很大的优势；

在胶乳增强免疫比浊法应用中，采用多抗进行标记可以有效提高试剂灵敏度，但会造成特异性不强，使检测结果准确度下降；而采用一株单抗对胶乳进行标记可以使特异性提高，但灵敏度又会受到影响；针对上述问题，本发明采用两珠单抗对胶乳进行标记然后混合在一起可以保持灵敏度情况下特异性也较强。

附图说明

图1为本发明N-MID的试剂盒拟合曲线示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明，若本发明实施例中有涉及方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后……)，则该方向性指示仅用于解释在某一特定姿态(如附图所示)下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。

另外，若本发明实施例中有涉及“第一”、“第二”等的描述，则该“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。另外，“多个”指两个以上。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。

实施例1：

基于胶乳增强免疫比浊法测定N-MID的试剂盒，包括反应缓冲液与N-MID胶乳试剂，所述反应缓冲液与所述N-MID胶乳试剂体积比为4:1，所述反应缓冲液包括0.5g/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液、5g/L的氯化镁、5g/L的氯化钾、15g/L的聚乙二醇1000、0.5ml/L的Proclin300和25ml/L的BSA，溶剂为纯化水，所述N-MID胶乳试剂包括至少两种胶乳试剂，所述胶乳试剂由单抗与胶乳微球偶联而成。

基于胶乳增强免疫比浊法测定N-MID的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，量取0.1ml固含为10％的胶乳微球，加至磷酸盐缓冲液中进行清洗，之后在20000转/分钟的转速下进行离心30min后，去上清，用MES缓冲液对余下沉淀物重悬超声，加入质量浓度为2％的EDAC 0.1ml和质量浓度为4％的NHS 0.2ml进行活化，活化时间为0.5h，制得活化胶乳微球；

步骤2，取至少两株单抗，分别与制得的活化胶乳微球按体积比1:1混匀，并进行1-2h的偶联，在20000转/分钟的转速下进行离心30min后，去上清，用偶联缓冲液对余下沉淀物重悬超声，制取至少两种偶联后的胶乳微球；

步骤3，向上述至少两种偶联后的胶乳微球中分别加入0.35mlBSA进行1h的封闭，封闭结束后，在20000转/分钟的转速下进行离心30min后，去上清，加入2ml的胶乳保存液重悬超声，得到至少两种胶乳试剂，然后将至少两种胶乳试剂混合均匀，得到N-MID胶乳试剂；

步骤4，称取缓冲液、无机盐、增浊剂、防腐剂和稳定剂，制得反应缓冲液，将反应缓冲液和N-MID胶乳试剂混合，得到基于胶乳增强免疫比浊法测定N-MID的试剂盒。

所述反应缓冲液的制备步骤包括：准备原料，置于装有纯化水的烧杯中，依次称取原料进行溶解，如何将pH调节至7.5，最后将溶液转移到容量瓶中定容至1L，用0.22um滤膜过滤，贴上标签，置于2度保存。

所述N-MID胶乳试剂包括两种胶乳试剂，两种胶乳试剂按照体积比1:1混合。

所述胶乳保存液按重量份包括5g/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液、4g/L的稳定剂、0.5ml/L的Proclin300和1ml/L的吐温-20。

实施例2：

基于胶乳增强免疫比浊法测定N-MID的试剂盒，包括反应缓冲液与N-MID胶乳试剂，所述反应缓冲液与所述N-MID胶乳试剂体积比为4:1，所述反应缓冲液包括2.56g/L的甘氨酸缓冲液、15.4g/L的氯化钠、25g/L的聚乙二醇8000、0.8ml/L的Proclin300和36ml/L的蔗糖，溶剂为纯化水，所述N-MID胶乳试剂包括至少两种胶乳试剂，所述胶乳试剂由单抗与胶乳微球偶联而成。

基于胶乳增强免疫比浊法测定N-MID的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，量取0.3ml固含为10％的胶乳微球，加至磷酸盐缓冲液中进行清洗，之后在20000转/分钟的转速下进行离心30min后，去上清，用MES缓冲液对余下沉淀物重悬超声，加入质量浓度为2％的EDAC 0.1ml和质量浓度为4％的NHS 0.2ml进行活化，活化时间为0.5h，制得活化胶乳微球；

步骤2，取至少两株单抗，分别与制得的活化胶乳微球按体积比1:2混匀，并进行1.5h的偶联，在20000转/分钟的转速下进行离心30min后，去上清，用偶联缓冲液对余下沉淀物重悬超声，制取至少两种偶联后的胶乳微球；

步骤3，向上述至少两种偶联后的胶乳微球中分别加入0.5ml甘氨酸进行1.5h的封闭，封闭结束后，在20000转/分钟的转速下进行离心30min后，去上清，加入3ml的胶乳保存液重悬超声，得到至少两种胶乳试剂，然后将至少两种胶乳试剂混合均匀，得到N-MID胶乳试剂；

步骤4，称取缓冲液、无机盐、增浊剂、防腐剂和稳定剂，制得反应缓冲液，将反应缓冲液和N-MID胶乳试剂混合，得到基于胶乳增强免疫比浊法测定N-MID的试剂盒。

所述反应缓冲液的制备步骤包括：准备原料，置于装有纯化水的烧杯中，依次称取原料进行溶解，如何将pH调节至7.5，最后将溶液转移到容量瓶中定容至1L，用0.22um滤膜过滤，贴上标签，置于5度保存。

所述N-MID胶乳试剂包括两种胶乳试剂，两种胶乳试剂按照体积比1:2混合。

所述胶乳保存液按重量份包括11.2g/L的甘氨酸缓冲液、10g/L的蔗糖、1.3ml/L的Proclin300和3.5ml/L的吐温-80。

实施例3：

基于胶乳增强免疫比浊法测定N-MID的试剂盒，包括反应缓冲液与N-MID胶乳试剂，所述反应缓冲液与所述N-MID胶乳试剂体积比为4:1，所述反应缓冲液包括5g/L的3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)缓冲液、25g/L的氯化锌、40g/L的聚乙二醇2000、2ml/L的硫柳汞和50ml/L的甘露醇，溶剂为纯化水，所述N-MID胶乳试剂包括至少两种胶乳试剂，所述胶乳试剂由单抗与胶乳微球偶联而成。

基于胶乳增强免疫比浊法测定N-MID的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，量取0.5ml固含为10％的胶乳微球，加至磷酸盐缓冲液中进行清洗，之后在20000转/分钟的转速下进行离心30min后，去上清，用MES缓冲液对余下沉淀物重悬超声，加入质量浓度为2％的EDAC 0.1ml和质量浓度为4％的NHS 0.2ml进行活化，活化时间为0.5h，制得活化胶乳微球；

步骤2，取至少两株单抗，分别与制得的活化胶乳微球按体积比1:3混匀，并进行2h的偶联，在20000转/分钟的转速下进行离心30min后，去上清，用偶联缓冲液对余下沉淀物重悬超声，制取至少两种偶联后的胶乳微球；

步骤3，向上述至少两种偶联后的胶乳微球中分别加入0.85ml甘氨酸进行2h的封闭，封闭结束后，在20000转/分钟的转速下进行离心30min后，去上清，加入4ml的胶乳保存液重悬超声，得到至少两种胶乳试剂，然后将至少两种胶乳试剂混合均匀，得到N-MID胶乳试剂；

步骤4，称取缓冲液、无机盐、增浊剂、防腐剂和稳定剂，制得反应缓冲液，将反应缓冲液和N-MID胶乳试剂混合，得到基于胶乳增强免疫比浊法测定N-MID的试剂盒。

所述反应缓冲液的制备步骤包括：准备原料，置于装有纯化水的烧杯中，依次称取原料进行溶解，如何将pH调节至7.5，最后将溶液转移到容量瓶中定容至1L，用0.22um滤膜过滤，贴上标签，置于8度保存。

所述N-MID胶乳试剂包括两种胶乳试剂，两种胶乳试剂按照体积比1:3混合。

所述胶乳保存液按重量份包括5-20g/L的3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)缓冲液、4-15g/L的甘露醇、0.5-2ml/L的硫柳汞和1-5ml/L的曲拉通X-10。

实施例4：

试剂盒性能评价

采用实施例2的配方，选取两株不同的鼠抗人N-MID的单克隆抗体，分别记做鼠抗人N-MID的单克隆抗体1和鼠抗人N-MID的单克隆抗体2，进行性能测评，结果如下：

1.线性

线性相关系数：在[10.0ng/ml-2000.0ng/ml]范围内用接近线性区间下限的低值标本稀释接近线性区间上限的高值标本，混合成至少5个不同浓度(Xi)的标本，每个标本重复测定3次，分别计算测定结果的均值(yi)。以稀释浓度(Xi)为自变量，以测定结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程。按公式(1)计算线性回归的相关系数r，所得结果应符合线性相关系数r应≥0.9900。

线性评价结果如表1所示：

表1

如图1所示，本试剂盒的直线拟合曲线为：y＝1.0098x+1.355R2＝1.0R>0.99，满足临床要求。

2.精密度

在重复条件下，取(100.0±30.0)ng/mL和(400.0±60.0)ng/mL浓度的样本(质控品、校准品或其他定值样本)，用同一批号试剂重复测定10次，分别计算测定值的平均值和标准差，按(2)式计算批内变异系数(CV)，所得结果应CV应≤8.0％。

式中：SD为标准差，计算公式为

dn为同水平各次所测值的偏差，计算公式为

xn为同水平各次所测值；

结果如表2所示：

表2

由检测结果可以看出，低值样本的CV为3.2％，高值样本的CV为1.4％，均小于8％，满足临床要求。

3.准确度

取高、低两个水平的质控品，按照说明书操作步骤进行测定，用同一批号试剂重复测定3次，测试结果记为(xi)，按(3)式求出相对偏差(Bi)，3次结果均应符合测定值与质控品靶值相对偏差应≤15.0％；如果3次结果中有2次符合要求，1次不符合要求，应重新连续测试20次，并分别按照(3)式计算相对偏差(Bi)，当大于等于19次结果符合要求，准确度被验证即符合测定值与质控品靶值相对偏差应≤15.0％的要求。

式中：xi为测定结果；

T为靶值。

结果如表3所示：

表3

从检测结果可以看出，低值质控的相对偏差为1.7％，高值质控的相对偏差为1.9％，均小于15％，故满足临床要求。

综上所述，本发明提供一种基于胶乳增强免疫比浊法测定N-MID的试剂盒及其制备方法，能有效的提升N-MID检测试剂的灵敏度与特异性。本发明采用了创新的用至少两珠特异性强的单抗通过标记胶乳微粒偶联然后混合在一起的技术来制备检测N-MID的试剂盒，实现了上全自动生化仪，自动检测，并有效提高试剂的灵敏度与特异性，具有极高的应用价值与广阔的市场前景。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。