生产膜蛋白的方法

技术领域

本发明涉及膜蛋白质的制造方法。本发明的方法适用于要生产大量膜蛋白的工业应用。因此，该方法旨在适合于至少中试工厂生产的加工单位操作。值得注意的是，本发明的目的在于避免超速离心装置。

背景技术

人类基因组中大约三分之一的基因编码膜蛋白。膜蛋白在许多重要的细胞活动中起作用，包括能量转化、细胞信号传导、细胞-细胞相互作用、细胞粘附、细胞迁移、蛋白质运输、病毒融合、神经突触活动以及离子和代谢物运输。膜蛋白包埋在细胞膜的脂质双层中，由疏水和亲水部分组成。

最近，膜蛋白已经被成功地整合到接枝在多孔结构支撑层上的薄膜复合层中。此外，膜蛋白代表重要的药物靶标和关于细胞生物学和蛋白质生物化学的感兴趣的研究主题。因此，需要中试工厂或大规模生产膜蛋白。

WO2017137361(A1)公开了在跨膜蛋白(例如水通道蛋白水通道(AQP))和聚亚烷基亚胺(PAI)之间形成的自组装纳米结构。随后将自组装纳米结构并入接枝在多孔支撑膜上的薄膜复合(TFC)膜中。多孔支撑膜可以是用于反渗透或正渗透的中空纤维、平板、螺旋缠绕膜等。

WO2013/043118公开了薄膜复合(TFC)膜，其中水通道蛋白水通道(AQP)被并入膜的活性层中。此外，其公开了一种制备薄膜复合膜的方法及薄膜复合膜在过滤方法如纳滤和渗透过滤方法中的用途。TFC膜包括掺入TFC活性层中的脂质-AQP/共聚物-AQP囊泡。WO2010/146365描述了TFC-水通道蛋白-Z(AqpZ)过滤膜的制备，其使用两亲物三嵌段共聚物作为用于掺入固定的AQP的囊泡形成物质。

WO2014/108827公开了具有用含有水通道蛋白水通道的薄膜复合(TFC)层改性的纤维的中空纤维(HF)组件，其中在引入到TFC层之前，将水通道蛋白水通道引入到囊泡中。

本领域技术人员通常不能获得从细胞分离大量膜蛋白的工业方法。在现有技术中，焦点集中在用于研究目的的相对少量的膜蛋白的生产上。因此，容许相对麻烦和劳动密集的生产方法。然而，随着近来对用于反渗透和正渗透的工业膜中膜蛋白的更高需求，对更有效的生产方法的需求变得明显。本发明的目的是提供一种生产膜蛋白的方法，其中该方法可以以有效的方式生产相对大量的膜蛋白，而不损害最终产物的质量。

发明内容

本发明涉及一种生产膜蛋白的方法，包括以下步骤：

a.在存在于水性介质中的宿主生物中表达膜蛋白，

b.从宿主生物体释放膜蛋白，

c.使用去污剂溶液溶解膜蛋白，

d.通过离心法将溶解的膜蛋白的液体部分作为上清液进行回收，

e.对该液体部分进行层析，以将膜蛋白结合或保留在固定相上，以及

f.用洗脱缓冲液洗脱固定相，产生膜蛋白，

其中步骤d中的离心法在500g至30,000g下进行。

本方法具有能够处理大量含有宿主生物体的水性介质的优点。因此，该方法能够处理50L或更多的量，例如100L或更多的适于中试工厂或全规模生产的加工单位操作。此外，该方法是可规模化的，并且可以容易地适用于含有宿主生物体的大量水性介质。

本发明人惊奇地发现，当加入去污剂溶液时，宿主生物体表达的膜蛋白变得比其它蛋白溶解的程度更高。据估计，在由去污剂溶液形成的囊泡中，至少约60％的蛋白质是目标膜蛋白。此外，已经观察到由去污剂形成的囊泡的尺寸大于通常的尺寸，例如约0.5μm，这表明膜蛋白与去污剂形成比天然使用的磷脂质更稳定的超形式。

含有宿主生物体的水性介质可以直接用于该方法中。然而，为了获得更清洁的产品和避免处理过量的水性介质，通常在根据步骤b释放膜蛋白之前过滤步骤a中包含宿主生物体的水性介质。

通常，通过具有足够小以允许细胞碎片和介质通过的孔的过滤器的过滤来浓缩包含宿主生物体的水性介质，从而保留细胞。在合适的实施方案中，将步骤a中包含宿主生物体的水性介质通过孔径为0.5微米或更小的微滤膜过滤。优选地，孔径为0.1微米或更小。

在过滤步骤(适当地通过微滤进行)之后，可以从水性介质的剩余部分分离宿主生物体。尽管几种可能的分离方法是可能的，但通常优选的是，在过滤后通过对包含宿主生物体的水性介质应用离心法来分离宿主生物体。离心过程通常在重力下进行，其在合适的时间周期内形成沉淀颗粒。因此，离心法通常在500g或更高，例如1000g或更高，优选2000g或更高下进行。沉淀颗粒的密度不应太高以防止在随后步骤中的困难。因此，离心法通常不在30,000g以上进行，例如不在20,000g以上，合适地不在15,000g以上，并且优选不在8,000g以上。

收获作为沉淀颗粒的细胞，并可以弃去上清液。优选的是，用等渗盐水溶液洗涤分离的宿主生物体以溶解污染盐，随后如上所述离心分离洗涤的宿主生物体。可以丢弃上清液中出现的用过的洗涤溶液。

含有已洗涤细胞的沉淀颗粒可通过在-20℃冷冻保存或直接用于下一步骤。合适地，在步骤b之前可以加入稀释缓冲液。稀释缓冲液可以含有防止膜蛋白降解的蛋白酶抑制剂、用于将pH值维持在所需范围内的pH调节物质如TRIS和磷酸盐、和/或离子清除剂如EDTA。

膜蛋白可以以多种方式从宿主生物体中释放，优选通过细胞的化学或机械裂解。当进行细胞的化学裂解时，适当地加入水性裂解溶液以从宿主生物体释放膜蛋白。在本发明的一个优选方面，水性裂解缓冲液是去污剂溶液，其同时溶解膜蛋白。

为了使细胞裂解和膜蛋白溶解发生，通常，在搅拌过程中使宿主细胞经受去污剂的作用。通常，允许宿主细胞与去污剂反应至少一小时，如2小时，优选至少6小时。

当使用细胞的机械裂解时，通常通过均质器从宿主细胞释放膜蛋白。使用与乳品工业中用于使乳品均质化的均质器相同类型的均质器是适合的。合适的例子包括Stansted7575均质器。在均质器中处理后，细胞破裂，释放膜蛋白。

在膜蛋白释放后，可以加入阳离子絮凝剂。据信阳离子絮凝剂与特别是带负电荷的细胞碎片相互作用，从而形成絮凝物。在本发明的一个优选的方面中，阳离子絮凝剂是多胺化合物，例如Superfloc C581。

絮凝物的形成通常不是立即发生的。因此，优选的是，在温和搅拌下，使阳离子絮凝剂与再悬浮液的细胞部分反应，形成絮凝物。通常，使阳离子絮凝剂和细胞碎片在室温搅拌的同时相互作用10分钟至2小时。

当使用细胞的化学裂解时，步骤e的液体部分作为来自离心分离含有絮凝物的悬浮液时的上清液被回收。当膜蛋白被去污剂溶液溶解时，膜蛋白出现在上清液中。

当使用细胞的机械裂解时，基于固体部分的再悬浮来回收步骤e的液体部分，其中将固体部分再次悬浮在用于溶解膜蛋白的去污剂溶液中。在本发明的一个实施方案中，由于含有膜蛋白的细胞碎片与絮凝剂相互作用并形成絮凝物，形成固体部分，所述絮凝物可以通过离心法从液体中分离。在本发明的另一个实施方案中，令人惊奇地发现，当使用细胞的机械裂解而不使用絮凝剂时，可以收获沉淀颗粒中的膜蛋白。通过离心法获得的沉淀颗粒可以再次悬浮于去污剂溶液中以溶解膜蛋白。在该步骤中，通过离心法收获作为上清液的步骤e的液体部分。

离心过程通常在重力(g力)下进行，其在合适的时间内形成沉淀颗粒。因此，离心通常在500g或更高，例如1000g或更高，优选2000g或更高下进行。沉淀颗粒的密度不应太高以防止在随后步骤中的困难。因此，离心通常不在30,000g以上进行，例如不超过20,000g，合适地不超过10,000g，优选不超过8,000g。施加低于30,000g的g力使得可以使用通常用于乳品厂的澄清器，例如来自GEA、Tetra Pak、Alfa Laval和SPX Flow Seital SeparationTechnology(斯必克流体Seital分离技术)的孢子去除离心机。在本发明中有用的澄清器也可以被一些制造商称为离心除菌机(Bactofuges)。因此，本发明可省略超速离心机的应用，超速离心机仅能够分批离心和处理少量。

用于本发明的去污剂包括烷基麦芽吡喃糖苷，例如正十二烷基-β-D-麦芽吡喃糖苷(DDM)、正癸基-β-D-麦芽吡喃糖苷(DM)或5-环己基戊基β-D-麦芽糖苷(Cymal-5)；烷基吡喃葡萄糖苷，如正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(OG)；氧化胺，如月桂基二甲胺N-氧化物(LDAO)；磷酸胆碱，例如正十二烷基磷酸胆碱(FC-12)、正十四烷基磷酸胆碱(FC-14)或正十六烷基磷酸胆碱(FC-16)；或聚氧乙烯二醇。在本发明的合适实施方案中，去污剂选自月桂基二甲胺N-氧化物(LDAO)、辛基葡糖苷(OG)、十二烷基麦芽糖苷(DDM)或其组合。LDAO是优选的去污剂，因为产生大且稳定的囊泡，表明去污剂能够置换天然存在的磷脂。

对液体部分进行层析处理，其中膜蛋白结合到固定相上或被固定相保留。层析的类型可以选择为亲和层析、离子交换层析、尺寸排阻层析、置换层析、液相层析、高效液相层析、反相层析、疏水作用层析等。通常，层析方法是制备性层析，与分析层析相反，以形成膜蛋白的纯化。

在目前优选的实施方案中，选择层析方法为亲和层析，根据该方法，亲和对的第一部分与膜蛋白结合，亲和对的第二部分与固定相结合。固定相的实例包括珠和柱材料。在本发明的一个优选实施方案中，与亲和对的第二部分相连的固定相存在于柱中。通常，亲和对的各部分通过与膜蛋白或固定相的共价结合而连接。然而，其它类型的结合也是可能的，例如杂交、通过抗体-抗原相互作用的亲和结合等。

可用于本发明的许多亲和对是本领域技术人员已知的，包括生物素-链霉亲和素对、抗体-抗原对、抗体-半抗原对、适体亲和对、捕获蛋白对、Fc受体-IgG对、金属-螯合脂质对、金属-螯合脂质-组氨酸(HIS)标记的蛋白对或其组合。在目前优选的实施方案中，亲和对是金属-螯合脂质-组氨酸(HIS)标记的蛋白对。

在称为固定化金属亲和层析(IMAC)的技术中，通常将金属固定在柱材料上。金属通常选为Cu(II)或Ni(II)，优选Ni(II)。使用Ni-NTA树脂，His-标记的蛋白质可以自动或手动纯化。合适的固定相是来自GE Healthcare的“Capto螯”(“Capto Chelating”)或来自GEHealthcare的HisTrap凝胶过滤材料(Ni Sepharose 6快速流动)。

亲和对的第一部分是组氨酸标签，其通常附着于膜蛋白的C末端。尽管组氨酸标签通常包含6个连续的组氨酸氨基酸，但在本发明中优选的是，组氨酸标签包含8个或更多个组氨酸分子。组氨酸标签中组氨酸氨基酸的高数目使得可以有效地分离特异性和非特异性结合蛋白。

在将含有膜蛋白的液体部分加入到柱中之后，通过重力或压力使液体渗透树脂。合适地，洗脱缓冲液包含咪唑。咪唑具有与以下结合相互作用的能力，所述结合为His标签和固定在树脂上的金属离子的结合。在咪唑的一定浓度下，His标记的膜蛋白将被释放。

为了从目标膜蛋白分离非特异性结合膜蛋白，通常，在用洗脱缓冲液洗脱之前，用包含洗脱缓冲液中咪唑浓度的40％或更低的洗涤缓冲液来洗涤柱。洗脱缓冲液中咪唑的浓度通常为200mM至2000mM的咪唑。在本发明的优选实施方案中，洗脱缓冲液中咪唑的浓度为400mM或更高。为了获得His标记的膜蛋白的更有效的洗脱，缓冲液中咪唑的浓度通常为600mM或800mM或更高。

对于大多数应用，His标签通常对蛋白质结构、功能和免疫原性具有可忽略的影响。然而，对于某些应用，可能希望在其发挥将膜分子结合到柱上的功能之后除去His标签。His标签可以通过在膜蛋白和His标签之间引入可切割连接而除去。合适的可切割连接包括pH敏感连接子、二硫化物连接子、蛋白酶敏感连接子和β-葡糖苷酸连接子。

膜蛋白在其天然环境中跨越整个双脂膜，即从细胞内部跨越到细胞外空间。许多跨膜蛋白作为特定物质的通道发挥功能，从而允许这些物质在细胞内部和细胞外液体之间交换。跨膜蛋白的特征性特点是疏水区的存在，其将确保跨膜蛋白整合到膜中。跨膜蛋白在中空纤维区的两侧还具有亲水片段，所述亲水片段分别指向细胞内部和细胞外液。

尽管据信任何膜蛋白都可根据本发明生产，但通常希望使用该方法来生产转运离子(离子通道)和水(水通道蛋白水通道)的膜蛋白。离子通道包括氯离子通道和金属离子转运蛋白。除了传导氯离子之外，某些氯离子通道还传导HCO

在本发明的一个优选实施方案中，膜蛋白是水通道蛋白水通道。水通道蛋白水通道促进水运输进或出细胞。在工业膜中，水通道蛋白水通道通过渗透确保水的流动，而溶液中的其它组分被排除。膜蛋白，例如水通道蛋白水通道，可以从包括原核和真核生物在内的各种来源产生。水通道蛋白的原核来源包括大肠杆菌、Kyrpidia spormannii、甲烷热杆菌(Methanothermobacter)属物种、Novibacillus thermophilus、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和盐单胞菌(Halomonas)属物种。一种水通道蛋白的真核来源包括日本稻、巨桉、马铃薯(丹麦马铃薯)和小斑熊虫(Milnesium tardigradum)(水熊虫)。

来自源生物体的膜蛋白的核酸序列通常使用Geneart(Thermo FischerScientific的子公司)的服务进行密码子优化以提高在宿主生物体中的表达。所得到的基因通过在C-末端添加组氨酸编码密码子以及在N-末端和C-末端添加侧翼限制性位点而适当地合成。合成的基因片段可以用限制酶消化并连接到载体片段中。优选将所得连接混合物转化到生物体中，例如大肠杆菌DH10B。在含有抗生素的培养基上适当地选择抗生素抗性转化体。通过对遗传构建体测序来确认转化体。分离的载体DNA随后被转移到生产宿主中。生产宿主可以选自许多合适的原核或真核生物，例如大肠杆菌和酿酒酵母。

通常处理宿主生物体以比通常更高量地表达天然膜蛋白或表达非天然膜蛋白。如上所述，表达膜蛋白的一种方式可以是用包含编码膜蛋白的DNA的载体转化宿主生物体。获得膜蛋白过表达的另一种可能性是通过上调天然膜蛋白的表达，例如通过削弱阻遏物或插入合适的启动子区。获得非天然蛋白表达的另一种可能性是用含有编码膜蛋白的核酸的病毒或噬菌体转染宿主生物体。

实施例

制备大肠杆菌BL21菌株，其包含产生与C-末端His标签连接的水通道蛋白的载体。His标签含有十个连续的组氨酸分子，其附着于水通道蛋白膜蛋白的一级序列。

在标准培养基中培养大肠杆菌菌株以获得150L的总发酵液，通过用孔径为0.05μm的微滤膜过滤发酵液来收获大肠杆菌细胞。将含有大肠杆菌细胞的滤液减少至约50L，随后在5300g下离心20分钟。因此，通过微量过滤将大肠杆菌细胞浓缩，随后通过离心将剩余的培养基作为上清液除去。

收集离心得到的沉淀颗粒，加入1:1体积的0.9％氯化钠洗涤细胞并溶解污染盐。随后，在以5300g运行20分钟的离心机中除去洗涤溶液。弃去上清液，收集作为沉淀颗粒的已洗涤细胞。该沉淀颗粒可以在-20℃下冷冻保存或直接用于下一步骤。

将包含大肠杆菌细胞的沉淀颗粒溶解在用作结合缓冲液的约47L TRIS缓冲液中。搅拌约一小时后，加入6.4L去污剂(5％LDAO)溶解至终浓度为0.6％。将混合物在室温和温和搅拌下温育过夜。通过将细胞再悬浮于含有去污剂的缓冲液中，发生细胞裂解。通过细胞裂解，膜蛋白从细胞的内膜释放并被去污剂溶解。

为了除去带负电荷的细胞物质，加入427mL多胺(Superfloc C581)。将混合物在室温搅拌下温育30分钟，以凝结带负电荷的分子如细胞碎片、DNA、RNA和一定程度的蛋白质。被去污剂溶解的膜蛋白保留在水相中。混合物以5300g的最大速度离心15分钟。弃去含有细胞碎片、DNA、RNA和溶解的蛋白质的沉淀颗粒，收集上清液。将上清液转移至含有107L稀释缓冲液的容器中，得到160L的最终体积，其中LDAO的最终浓度为0.2％。

提供了含有来自GE Healthcare的“Capto螯”亲和树脂的柱。树脂中加入Ni

制备大肠杆菌菌株BL21，其包含产生与C-末端His标签连接的水通道蛋白的载体。His标签含有十个连续的组氨酸分子，其附着于水通道蛋白膜蛋白的一级序列。

在标准培养基中培养大肠杆菌菌株，得到250L的总发酵液，通过孔径为0.05μm的PES平板膜过滤发酵液，收获大肠杆菌细胞。将含有大肠杆菌细胞的滤液减少至约50L，随后在Sorvall 16L离心机中5300g下离心20分钟。因此，通过微量过滤将大肠杆菌细胞浓缩，随后通过离心将剩余的培养基作为上清液除去。沉淀颗粒可以在-20℃下冷冻保存或直接用于下一步骤。

将包含大肠杆菌细胞的沉淀颗粒再悬于约50L缓冲液(蛋白酶抑制剂PMSF和EDTA的水溶液)中，并在Stansted nm-GEN 7575均质器中在1000巴下均化。为了分离目标细胞物质，加入12ml/L浓度的多胺(Superfloc C581)，温度保持在10-15℃。将混合物在室温下搅拌温育30分钟。将混合物以5300g的最大速度离心30分钟。沉淀颗粒含有膜蛋白，弃去上清液。

将沉淀颗粒再悬于0.9％氯化钠溶液中，得到总蛋白浓度为约50mg/ml。通过将28LTRIS结合缓冲液和4.5升5％LDAO加入至5L再悬的沉淀颗粒物质进行膜蛋白的溶解。在室温和温和搅拌下，允许混合物温育2至24小时。

溶解过程后，将混合物在2L容器中以5300g离心90分钟。回收上清液，并通过加入稀释缓冲液将LDAO浓度调节至0.2％。

提供了含有来自GE Healthcare的“Capto螯”亲和树脂的柱。树脂中加入Ni

制备大肠杆菌菌株BL21，其包含产生与C-末端His标签连接的水通道蛋白的载体。His标签含有十个连续的组氨酸分子，其附着于水通道蛋白膜蛋白的一级序列。

在标准培养基中培养大肠杆菌菌株以获得250L的总发酵液，收获时发酵批次的OD600值为13，诱导42.5小时。将材料在Stansted nm-GEN7575均质器中在100MPa下均化两次。从裂解的物质中取出10mL，加入到15mL Falcon管中。

然后以5300g离心1小时，沉淀颗粒与上清液分离。然后将沉淀颗粒再悬于10mL0.9％NaCl中。BCA试验用于测定第一次旋转后再悬的沉淀颗粒和分离的上清液的浓度(mg/mL总蛋白)。

最后将再悬的沉淀颗粒和分离的上清液溶解(1mL)于0.6％LDAO(120μL的来自Carbosynth的5％LDAO储液用于1mL材料)中2小时，并在5300G下再次离心15分钟。再一次，将上清液与沉淀颗粒分离。将沉淀颗粒再悬(再次至1mL)在结合缓冲液w/o LDAO中。

所有样品都在SDS-凝胶上分析，结果显示上清液中约60％的蛋白质是水通道蛋白膜蛋白。

在实施例2中纯化水通道蛋白Z之后，测量溶解在LDAO中的蛋白质的大小分布。

比较相同的洗脱缓冲液(含和不含蛋白质)以评价粒度分布是否受缓冲液组分(包括去污剂)或膜蛋白的影响。

使用含有1000mM咪唑和0.2％w/v LDAO的洗脱缓冲液，将水通道蛋白Z蛋白从IMAC柱上洗脱。通过氨基酸分析测量纯化的蛋白质浓度。将6.44mg/mL的澄清、溶解的、在洗脱缓冲液中的蛋白质加载到3个单独的小池(Sarstedt，4mL，PMMA，CA67.755，Nümbrecht，德国)中，并通过Malvern Zetasizer Nano-ZS(Malvern Instruments有限公司，Malvern UK)使用Malvern Zetasizer软件v.7.02分析大小分布。表1中所示的结果是一式三份运行的样品的平均值。

表1：

洗脱缓冲液样品(无蛋白质)含有97.9％的尺寸为8.6nm或更小的微粒的群体分布，表明在溶液中没有将被微量过滤保留的大去污剂胶束。含有蛋白质的样品中81.4％的微粒显示108nm或更大的尺寸，从而表明蛋白质和去污剂的存在一起形成大的可溶性微粒，其在微量过滤期间被保留。实验令人惊奇地显示，产生了由LDAO胶束和膜蛋白组成的大的、稳定的微粒。

在大肠杆菌中表达组氨酸标记的来自日本稻(Oryza sativa Japonica)的水通道蛋白以及使用IMAC将其纯化

使用Geneart(Thermo Fischer Scientific的子公司)的服务对编码来自日本稻的水通道蛋白的基因(UNIPROT：A3C132)进行密码子优化以提高在大肠杆菌中的表达。对所得到的基因进行合成，C-末端添加十个组氨酸编码密码子，N-末端和C-末端分别添加侧翼NdeI/XhoI限制性位点(基因ID：水通道蛋白_日本稻)。用NdeI/XhoI限制酶来消化合成的基因片段，并连接到用NdeI/XhoI消化和纯化的载体pUP1909片段上。将所得连接混合物转化到大肠杆菌DH10B中，并在含卡那霉素的LB琼脂平板上选择卡那霉素抗性转化体。通过对遗传构建体测序来确认转化体。分离的载体DNA随后被转移到生产宿主大肠杆菌BL21中。

为了在大肠杆菌中异源表达水通道蛋白，使所述生产宿主在基本培养基中生长，所述基本培养基由30g/L甘油、6g/L(NH

在分批发酵过程中，在具有ez-Control(ez-控制)的3L Applikon生物反应器中培养大肠杆菌。通过加入IPTG至终浓度为0.5mM诱导蛋白质产生，光密度(OD 600nm)约为30。诱导培养物约24小时，以5300g离心20分钟收获细菌细胞。

将包含大肠杆菌细胞的沉淀颗粒再悬于缓冲液(蛋白酶抑制剂PMSF和EDTA的水溶液)中，并在Stansted nm-GEN 7575均质器中在1000巴下均化。将温度保持在约10-15℃。混合物以5300g的最大速度离心30分钟。沉淀颗粒含有膜蛋白，弃去上清液。

将沉淀颗粒再悬于0.9％氯化钠溶液中，得到总蛋白浓度为约50mg/ml。通过将28LTRIS结合缓冲液和4.5升5％LDAO加入至5L再悬的沉淀颗粒进行膜蛋白的溶解。在室温和温和搅拌下，允许混合物温育2至24小时。

溶解过程后，将混合物在2L容器中以5300g离心90分钟。回收上清液，并通过加入稀释缓冲液将LDAO浓度调节至0.2％。

溶解和澄清后，用IMAC捕获蛋白质，并在含有1000mM咪唑和0.2％w/v LDAO的洗脱缓冲液中洗脱。洗脱部分通过SDS PAGE分析，仅显示一条主要条带，其在27kDa迁移，这对应于来自日本稻的水通道蛋白的大小。此外，通过与从用空载体转化的大肠杆菌纯化的阴性对照比较，证实了结果。阴性对照没有产生纯化的蛋白质。用对组氨酸标记特异的抗体(TaKaRa Bio)进行的Western印迹分析如所预期的那样，产生来自纯化的蛋白质的清晰信号，并且没有来自阴性对照的信号，证实纯化的蛋白质的来源是组氨酸标记的膜蛋白。

在大肠杆菌中表达组氨酸标记的来自巨桉(Eucalyptus grandis)的水通道蛋白以及使用IMAC将其纯化

使用Geneart(Thermo Fischer Scientific的子公司)的服务对编码来自Eucalyptus grandis的水通道蛋白的基因(UNIPROT：A0A059C9Z4)进行密码子优化以改善在大肠杆菌中的表达。对所得基因进行合成，C-末端添加十个组氨酸编码密码子，N-末端和C-末端分别添加侧翼NdeI/XhoI限制性位点(基因ID：水通道蛋白_巨桉)。如实施例5所述克隆并表达基因，如实施例5所述成功纯化并确认蛋白质。

在大肠杆菌中表达组氨酸标记的来自马铃薯(Solanum tuberosum)(丹麦马铃薯)的水通道蛋白并使用IMAC将其纯化

使用Geneart(Thermo Fischer Scientific的子公司)的服务对编码来自马铃薯的水通道蛋白的基因(UNIPROT：Q38HT6)进行密码子优化以提高在大肠杆菌中的表达。对所得基因进行合成，C-末端添加十个组氨酸编码密码子，N-末端和C-末端分别添加侧翼NdeI/XhoI限制性位点(基因ID：水通道蛋白_马铃薯)。如实施例5所述克隆并表达基因，如实施例5所述成功纯化并确认蛋白质。

在大肠杆菌中表达组氨酸标记的来自小斑熊虫(Milnesium tardigradum)(水熊虫)的水通道蛋白并使用IMAC将其纯化

使用Geneart(Thermo Fischer Scientific的子公司)的服务对编码来自小斑熊虫(Milnesium tardigradum)的水通道蛋白的基因(UNIPROT：G5CTG2)进行密码子优化以提高在大肠杆菌中的表达。对所得基因进行合成，C-末端添加十个组氨酸编码密码子，N-末端和C-末端分别添加侧翼NdeI/XhoI限制性位点(基因ID：水通道蛋白_小斑熊虫)。如实施例5所述克隆并表达基因，如实施例5所述成功纯化并确认蛋白质。

在大肠杆菌中表达组氨酸标记的来自盐单胞菌(Halomonas)属物种的水通道蛋白以及使用IMAC将其纯化

使用Geneart(Thermo Fischer Scientific的子公司)的服务对编码来自盐单胞菌属物种的水通道蛋白的基因(UNIPROT：A0A2N0G6U6)进行密码子优化以提高在大肠杆菌中的表达。对所得基因进行合成，C-末端添加十个组氨酸编码密码子，N-末端和C-末端分别添加侧翼NdeI/XhoI限制性位点(基因ID：水通道蛋白_盐单胞菌)。如实施例5所述克隆并表达基因，如实施例5所述成功纯化并确认蛋白质。

在大肠杆菌中表达来自组氨酸标记的Kyrpidia spormannii的水通道蛋白以及使用IMAC将其纯化

使用Geneart(Thermo Fischer Scientific的子公司)的服务对编码来自Kyrpidia sp.的水通道蛋白的基因(UNIPROT：A0A2K8N5Z5)进行密码子优化以提高在大肠杆菌中的表达。对所得基因进行合成，C-末端添加十个组氨酸编码密码子，N-末端和C-末端分别添加侧翼NdeI/XhoI限制性位点(基因ID：水通道蛋白Kyrpidia spormannii)。如实施例5所述克隆并表达基因，如实施例5所述成功纯化并确认蛋白质。

在大肠杆菌中表达组氨酸标记的来自甲烷热杆菌(Methanothermobacter)属物种的水通道蛋白以及使用IMAC将其纯化

使用Geneart(Thermo Fischer Scientific的子公司)的服务对编码来自甲烷热杆菌属物种的水通道蛋白的基因(UNIPROT：A0A223ZCQ2)进行密码子优化以提高在大肠杆菌中的表达。对所得基因进行合成，C-末端添加十个组氨酸编码密码子，N-末端和C-末端分别添加侧翼NdeI/XhoI限制性位点(基因ID：水通道蛋白_甲烷热杆菌属物种)。如实施例5所述克隆并表达基因，如实施例5所述成功纯化并确认蛋白质。

在大肠杆菌中表达组氨酸标记的来自Novibacillus thermophilus的水通道蛋白以及使用IMAC将其纯化

使用Geneart(Thermo Fischer Scientific的子公司)的服务对编码来自Novibacillus thermophilus的水通道蛋白的基因(UNIPROT：A0A1U9K5R2)进行密码子优化以提高在大肠杆菌中的表达。对所得基因进行合成，C-末端添加十个组氨酸编码密码子，N-末端和C-末端分别添加侧翼NdeI/XhoI限制性位点(基因ID：水通道蛋白_Novibacillus_thermophilus)。如实施例5所述克隆并表达基因，如实施例5所述成功纯化并确认蛋白质。

在大肠杆菌中表达来自大肠杆菌的外膜蛋白A(OmpA)

基本上如实施例5所述大肠杆菌中进行OmpA(UNIPROT：P0A910)的表达和纯化，除了用空载体转化大肠杆菌并将溶解延长至24小时。通过SDS-PAGE估计所得的溶解蛋白的纯度约为30-50％，因此清楚地表明，按照标准纯化方法，在膜组分中成功地分离OmpA。另外的大小排阻层析(SEC)步骤可进一步纯化OmpA。

构建表达来自大肠杆菌的水通道蛋白-Z(AqpZ)的酿酒酵母菌株，所述水通道蛋白-Z融合至N-末端组氨酸标记的yEGFP并通过烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶切割位点分离

使用Geneart的服务，对来自大肠杆菌的AqpZ(UNIPROT ID：P60844)进行密码子优化，以改进在酿酒酵母中的表达。为了在酿酒酵母中表达，AqpZ与酵母增强的绿色荧光蛋白(yEGFP)N-末端融合(Brendan P.Cormack等，Microbiology(1997)，143,303-311)，以使得膜蛋白可视化检测和定量。此外，八个组氨酸(His8)N-末端加到yEGFP作为IMAC纯化标签。His8-yEGFP和AqPZ在构建过程中通过PCR引物引入的TEV蛋白酶切割位点在遗传上分开。

通过在His8-yEGFP-TEV PCR片段、TEV-AqpZ PCR片段和来源于对pEMBLyex4质粒进行SalI、HindIII和BamHI消化的线性化表达质粒之间，对酿酒酵母中通过引物掺入的重叠区进行体内同源重组，快速和有效地构建编码His8-yEGFP-TEV-AqpZ融合的质粒，如(Scientific Reports 7:16899)所述。TEV切割位点使得随后通过TEV蛋白酶去除His8-yEGFP蛋白。

在尿嘧啶缺陷但补充了亮氨酸和赖氨酸的基本培养基平板上进行酿酒酵母转化体的选择，以确保具有正确重组DNA片段的细菌细胞的存活。本实施例中使用的培养基组成和氨基酸浓度与实施例15中所列的相同。

用酿酒酵母表达His8-yEGFP-TEV-AqpZ

选择性繁殖转化的酵母细胞的单菌落，直到在5ml补充有60mg/L亮氨酸和30mg/L赖氨酸的葡萄糖基本培养基中饱和。随后将200μL该培养物在5ml补充了30mg/L赖氨酸的葡萄糖基本培养基中增殖，用于选择高质粒拷贝数。制备高质粒拷贝数细胞的冷冻储备液。

将200μL解冻的冷冻贮存物加入10ml补充有赖氨酸的基本培养基中，生长至饱和。将1ml培养物转移到100ml相同的培养基中。过夜生长后，将对应于0.05的最终OD600的等分试样转移至1.5升基本培养基中，所述基本培养基具有作为碳源的20g/L葡萄糖和补充有额外氨基酸的30g/L甘油的初始浓度。培养物在3L的

发酵的起始部分在20℃下在基本培养基中进行。当初始量的葡萄糖已经代谢时，向生物反应器提供葡萄糖至3％w/v的最终浓度。通过计算机控制添加1M NH4OH将生长培养基的pH保持在6.0。当CO2废气稳定后，由于葡萄糖的有限进入，在诱导重组AQP生产之前，将生物反应器冷却到15℃。加入由400mL/L ASD-10、400mL/L额外氨基酸、200g/L甘油和20g/L半乳糖组成的50mL/L表达培养基启动重组蛋白的表达。～96小时后收获酵母细胞。

基本培养基由20g/L葡萄糖、100mL/L ASD-10、5mL/L V-200、30g/L甘油、0.1g/LCa

在具有酿酒酵母的生物反应器中克隆来自小斑熊虫(Milnesium tardigradum)的His8-yEGFP-TEV-AQP5

按照实施例14中概述的方法制备His8-yEGFP-TEV-AQP5构建体，尽管需要在酵母中表达，但来自小斑熊虫的AQP5蛋白(UNIPROT：G5CTG2)经密码子优化以在大肠杆菌中表达。

从酿酒酵母中纯化His8-yEGFP-TEV-AqpZ和His8-yEGFP-TEV-AQP5如实施例2所述纯化从酿酒酵母异源表达的膜蛋白，不同之处在于按比例缩小所用缓冲液体积以匹配减少的培养物体积，并且在1800巴下进行裂解。用SDS PAGE和蛋白质印迹成功地证实了融合蛋白的蛋白产量和纯度，并且没有检测到污染蛋白。