一种ATP生物荧光法检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种ATP生物荧光法检测试剂盒及其应用。

技术背景

目前，细胞培养技术已广泛应用于生物学、医学等各个领域，而细胞活力的检测是细胞培养中重要的研究方法之一。细胞活力的检测方法有染料排除法、克隆(集落)形成试验、MTT比色试验、三磷酸腺苷发光试验(ATP-TCA生物发光法)、细胞蛋白质含量测定法和细胞蛋白质合成测定法等等。

细胞内源性ATP含量与活细胞数呈正相关。内源性ATP是活体细胞最基本的能量来源，细胞死亡时，ATP迅速水解。因此测定细胞内源性ATP的含量可以及时反映细胞的活性和活细胞数量。在有氧和ATP的条件下，荧光酶催化荧光素发出荧光(波长562nm)，同时ATP转化为AMP。反应中发出荧光的强度与溶液中ATP的含量呈正相关，因此，所测定的荧光强度反映了活细胞的数量。对比于克隆(集落)形成试验、MTT比色试验，三磷酸腺苷发光试验(ATP-TCA生物发光法)以其快速、简便、重现性好的优势得到越来越广泛的应用。

三磷酸腺苷发光试验(ATP-TCA生物发光法)，测定过程中ATP的提取需要吸出培养液、清洗细胞、吹打细胞、用Tris缓冲液中和待测液，操作繁杂耗时；测定的样品中细胞数量不能太少，因此灵敏度有时达不到要求。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中ATP-TCA生物发光法检测费时费力，灵敏度不高的技术问题，提供一种操作简单、省时省力，可标准化，灵敏度高的ATP生物荧光法检试剂盒及其应用。

一种ATP生物荧光法检测试剂盒，其特征在于，ATP提取液、荧光酶工作液和荧光酶/荧光素检测系统；

所述ATP提取液包括如下原料组分：Tris、甘油、Triton X-100、BSA、EDTA和2-巯基乙醇；

所述荧光酶工作液包括如下原料组分：Tris、2-巯基乙醇、EDTA和硫酸镁；

所述荧光酶/荧光素检测系统包括如下原料组分：Tris、组氨酸、DTT、蔗糖、甘露醇、BSA、荧光素和荧光酶。

优选的，所述ATP提取液各原料组分浓度如下：

Tris 15-30mM、甘油0.7-2.1M、Triton X-100 4-20mM、BSA1-5mg/ml、EDTA 10-30mM和2-巯基乙醇2-5mM。

优选的，所述ATP提取液各原料组分浓度如下：

Tris 25mM、甘油1.4mM、Triton X-100 4mM、BSA 1mg/ml、EDTA 20mM和2-巯基乙醇4mM。

优选的，所述荧光酶工作液各原料组分浓度如下：

Tris 40-60mM、2-巯基乙醇100-130mM、EDTA 5-15mM和硫酸镁1-10mM。

优选的，所述荧光酶工作液各原料组分浓度如下：

Tris 50mM、2-巯基乙醇120mM、EDTA 10mM和硫酸镁1mM。

优选的，所述荧光酶/荧光素检测系统各原料组分浓度如下：

Tris 10-30mM、组氨酸10-30mM、DTT 5-15mM、蔗糖50-150mM、甘露醇150-250mM、BSA 5-20mg/ml、荧光素0.6-1.0mg/ml和荧光酶0.01-0.02mg/ml。

优选的，所述荧光酶/荧光素检测系统各原料组分浓度如下：

Tris 20mM、组氨酸20mM、DTT 10mM、蔗糖116mM、甘露醇220mM、BSA 10mg/ml、荧光素0.8mg/ml和荧光酶0.013mg/ml。

优选的，所述荧光酶/荧光素检测系统为冻干品。

一种ATP生物荧光法检测试剂盒，包括(1)ATP提取液，每盒1瓶，25ml/瓶；(2)荧光酶工作液，每盒1瓶，25ml/瓶；(3)荧光酶/荧光素检测系统，每盒4瓶；每个试剂盒可以检测4块96孔培养板。

优选的，所述的ATP生物荧光法检测试剂盒的使用方法包括如下步骤：

(1)ATP的提取

配制发光工作液：将荧光酶工作液加入到荧光酶/荧光素检测系统中，充分溶解混合配成发光工作液，室温避光放置，备用；

用多道加样器向培养板中加入ATP提取液，并将培养板置于振荡器上振荡混匀；

(2)荧光测定

用多道加样器自培养板每孔吸出上清液，转移至荧光测定板中，向荧光测定板中的上清液加入发光工作液，在微量振荡器上振荡混匀，立刻用荧光检测仪测定。

通过采用上述技术方案，达到如下技术效果：

(1)本发明采用新的细胞ATP提取方法，只需一步即可进入测定步骤，操作简单，可以标准化；测定过程省时省力，完成一块96孔板的测定，最快只需10-15分钟的时间，可以实现高通量检测。

(2)本发明实施例细胞ATP的含量与吸收值之间具有良好的线性关系；每孔细胞最少检出不高于10个细胞；CV值都小于10％，具有良好的重复性。

(3)本发明关键试剂采用冻干技术，保质期长，性能稳定，便于运输和储藏。基于上述优势，本发明除了应用于基础研究领域，还在肿瘤药物敏感性检测、设计个体化治疗方案、研究新的联合化疗方案、化疗药物新适应症研究及新药筛选等方面有着广阔的应用前景。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步描述，但不作为对本发明的限定。本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书做出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范畴。

实施例1

1.ATP提取液

ATP提取液配方：

Tris 7.57克，EDTA 18.62克，BSA 2.5克，甘油250毫升，Triton X-100 2.5毫升，2-巯基乙醇0.7毫升，去离子水2500毫升。

ATP提取液配制方法：

1.1量取去离子水2000毫升，至于搅拌器上，缓慢搅拌。

1.2称取Tris，缓慢加至容器中，缓慢搅拌直至完全溶解。

1.3称取EDTA，缓慢加至容器中，缓慢搅拌直至完全溶解。

1.4称取BSA，缓慢加至容器中，缓慢搅拌直至完全溶解。

1.5向溶液中加入甘油，Triton X-100和2-巯基乙醇，搅拌器上搅拌10分钟。

1.6定容2500毫升。

1.7分装，25ml/瓶。

2.荧光酶工作液

荧光酶工作液配方：

Tris 15.145克，无水硫酸镁0.3克，EDTA9.3克，2-巯基乙醇17.5毫升，去离子水2500毫升。

2.1量取去离子水2200毫升，至于搅拌器上，缓慢搅拌。

2.2称取Tris，缓慢加至容器中，缓慢搅拌直至完全溶解。

2.3称取无水硫酸镁，缓慢加至容器中，缓慢搅拌直至完全溶解。

2.4称取EDTA，缓慢加至容器中，缓慢搅拌直至完全溶解。

2.5量取2-巯基乙醇，缓慢加至容器中，缓慢搅拌直至完全溶解。

2.6定容至2500毫升。

2.7分装，25ml/瓶。

3.荧光酶/荧光素检测系统冻干品

荧光酶/荧光素检测系统冻干品配方：

Tris 0.97克，组氨酸1.33克，DTT 0.616克，蔗糖16克，甘露醇16克，BSA 4克，荧光素320毫克，荧光酶5.2毫克。

配制荧光酶/荧光素检测系统冻干液：

3.1量取400ml去离子水，至于搅拌器上，缓慢搅拌。

3.2称取Tris，缓慢加至容器中，缓慢搅拌直至完全溶解。

3.3称取组氨酸，缓慢加至容器中，缓慢搅拌直至完全溶解。

3.4称取DTT，缓慢加至容器中，缓慢搅拌直至完全溶解。

3.5称取蔗糖，缓慢加至容器中，缓慢搅拌直至完全溶解。

3.6称取甘露醇，缓慢加至容器中，缓慢搅拌直至完全溶解。

3.7称取BSA，缓慢加至容器中，缓慢搅拌直至完全溶解。

3.8称取荧光素，缓慢加至容器中，缓慢搅拌直至完全溶解。

3.9量取荧光酶，缓慢加至容器中，缓慢搅拌直至完全溶解。

4.分装，用10ml棕色玻璃瓶分装，1毫升/支。

5.冻干：将分装好的冻干液放置于冻干机中冻干，冻干条件：

5.1进料前搁板制冷

设置导热油进口温度4℃

5.2冷冻控制

设置导热油进口温度-45℃，保持150分钟

5.3捕水器制冷

设置捕水器温度-50℃

5.4预抽真空

设置真空为20Pa

5.5一次升华

将真空设置为0Pa,将导热油进口温度从-45℃升至-10℃用时120分钟，保持300分钟；将导热油进口温度从-10℃升至0℃用时90分钟，保持420分钟

5.6解析干燥

将真空设置为0Pa，将导热油进口温度从0摄氏度升至25℃用时60分钟，保持240分钟。

6.压盖：冻干完成后压盖密封。

7.细胞浓度-反应曲线测定

7.1将培养瓶中细胞吹匀，取出1ml左右到塑料管，计数板计数，用1640培养液稀释至333333个细胞/ml。取6只小塑料管，每管加入1640培养液0.6ml，加入细胞溶液0.3ml，混匀后取0.3ml加入下一个塑料管，以此类推，配成3倍稀释的系列浓度细胞。

7.2取一块96孔板，向1-12列的1-4排共48孔加入100μl培养基。然后8-12列共20孔每孔再加入100μl培养基作为无细胞对照。从7列至1列，加入系列稀释的细胞溶液，每孔100μl，每浓度4个平行孔，加液的顺序为从低浓度到高浓度，方向是从第7列至第1列。

7.3然后每孔加ATP提取液50μl，震荡60秒。

7.4将6ml荧光酶工作液加入到荧光酶-荧光素系统中，充分溶解混合配成发光工作液。

7.5用多道加样器从上述96孔板中吸取裂解上清液50μl转移到荧光测定板的相应孔内，并每孔加入配好的发光工作液50μl，振荡10秒钟混匀，即刻进行测量。

7.6以平均荧光强度的对数值为纵坐标，细胞浓度对数值为横坐标，在Excel软件中做散点图，加趋势线，计算相关系数R。

8.最低检出限测定

8.1空白溶液测20次，操作过程见7项，计算空白溶液发光强度的均值+2SD，利用7.6中得到的公式加趋势线得到的该数值对应的细胞数即为最低检出限。

9.重复性测定

9.1向细胞培养板加入20孔无细胞的培养基，每孔100μl。

9.2调整细胞数至30000个/ml，总体积不少于2.5ml。

9.3向细胞培养板加入20孔上述细胞溶液，每孔100μl。

9.4每孔加细胞提取液50μl，震荡60秒。

9.5用多道加样器从上述96孔板中吸取裂解上清液50μl转移到荧光测定板的相应孔内，并每孔加入配好的发光工作液50μl，振荡10秒钟混匀，即刻进行测量。

9.6数据处理20孔发光强度值，计算CV值。

实施例2

1.ATP提取液

ATP提取液配方：

Tris 4.54克,EDTA 9.31克，BSA 2.5克,甘油125毫升,Triton-1002.5毫升，2-巯基乙醇0.35毫升，超纯水2500毫升。

2.荧光酶工作液

荧光酶工作液配方：

Tris 12.116克，无水硫酸镁0.3克，EDTA4.65克，2-巯基乙醇14.58毫升，去离子水2500毫升

3.荧光酶/荧光素检测系统冻干品

荧光酶/荧光素检测系统冻干品配方：

Tris 0.485克，组氨酸0.165克，DTT 0.308克，蔗糖6.897克，甘露醇10.909克，BSA2克，荧光素240毫克，荧光酶4.0毫克

其他与实施例1相同。

实施例3(范围的端值数据替换下面的数据)

1.ATP提取液

ATP提取液配方：

Tris 9.084克,EDTA 27.93克，BSA 12.5克,甘油375毫升,Triton-100 12.5毫升，2-巯基乙醇0.875毫升，超纯水2500毫升。

2.荧光酶工作液

荧光酶工作液配方：

Tris 18.174克，无水硫酸镁3克，EDTA 13.95克，2-巯基乙醇18.958毫升，去离子水2500毫升

3.荧光酶/荧光素检测系统冻干品

荧光酶/荧光素检测系统冻干品配方：

Tris 1.455克，组氨酸1.995克，DTT 0.924克，蔗糖20.689克，甘露醇18.182克，BSA 8克，荧光素400毫克，荧光酶8毫克。

其他与实施例1相同。

测定结果如下：

由上表可以看出：

实施例1-3中细胞ATP的含量与吸收值之间都具有良好的线性关系；每孔细胞最少检出都低于10个细胞，检出限低；CV值都小于10％，具有良好的重复性。

本发明除了应用于基础研究领域，还在肿瘤药物敏感性检测、设计个体化治疗方案、研究新的联合化疗方案、化疗药物新适应症研究及新药筛选等方面有着广阔的应用前景。

本发明采用的荧光检测仪为北京滨松光子技术股份公司生产的BHP9504型微孔板发光分析仪。