掌桥专利:专业的专利平台
掌桥专利
首页

用于检测微生物抗性的快速方法

文献发布时间:2023-06-19 09:33:52



相关申请的参考

本申请要求于2018年4月20日提交的美国临时申请第62/660402号的优先权,其全部内容通过参考结合至本文中。

背景

1. 发明领域

本发明涉及用于检测和鉴定微生物中的抗性的方法、试剂盒和组合物,并且特别是快速、易于操作且廉价的方法。

2. 背景描述

结核分枝杆菌(

感染有MTB的个体中远超过90%保持表面健康,没有明显症状。这些个体被分类为潜伏性感染,是活动性MTB病例持续发展(“再活动性结核病”)的储库。潜伏性感染通常定义为除了对结核菌素皮肤测试中使用的MTB的纯化蛋白衍生物的迟发型超敏反应或对MTB特异性抗原的T细胞反应之外没有TB的临床症状。缺乏对潜伏期的了解并从而缺乏用于治疗的可靠控制措施,使得潜伏性结核感染成为一个严重问题。

结核分枝杆菌需要氧气才能增殖,并且由于其细胞壁的脂质含量高,因此无法保留典型的细菌学染色剂。尽管从经验的观点来看分枝杆菌不适合革兰氏阳性类别(即其不保留结晶紫染色剂),但是由于其缺乏细胞外膜,它们被分类为耐酸革兰氏阳性细菌。

结核分枝杆菌有超过100种菌株变异,每15-20小时分裂一次,这与具有以分钟为单位测量的分裂时间的其他类型细菌相比较非常缓慢(大肠杆菌(

MTB感染通过空气中的飞沫核传播,该飞沫核含有从活动性TB个体的肺部和气道排出的病原体。感染性飞沫核被吸入并滞留在肺泡和肺泡囊中,其中结核分枝杆菌由肺泡巨噬细胞吸收。这些巨噬细胞侵入衬托上皮层(subtending epithelial layer),导致局部炎症反应,引发形成肉芽肿,后者为结核病的标志。这导致从邻近血管募集单核细胞,从而为不断扩大的细菌群体提供新鲜的宿主细胞。然而,这些巨噬细胞无法消化细菌,因为细菌的细胞壁阻止吞噬体与溶酶体的融合。具体地讲,结核分枝杆菌阻断桥接分子,即早期内体自身抗原1 (EEA1);然而,这种阻断不能阻止充满营养物的囊泡融合。结果,细菌在巨噬细胞内不受控制地繁殖。细菌还携带UreC基因,该基因可防止吞噬体酸化,并且还通过中和反应性氮中间体来逃避巨噬细胞的杀灭。

随着淋巴细胞的到达,肉芽肿获得更有组织的分层的结构。在初次感染由对结核菌素的阳性DTH (迟发型超敏反应)反应指出之后,免疫反应的发展约需要4-6周。宿主免疫(保护性和病理性)与杆菌性繁殖之间的平衡决定感染结果。传统上认为与MTB相遇会产生3种可能的结果。在少数人群中发生的第一种可能结果为活动性TB和相关临床症状的快速发展。在大多数感染的个体中发生的第二种可能结果不包括疾病症状。这些个体会产生有效的获得性免疫反应,并被认为具有“潜伏性感染”。随着时间的推移,一部分潜伏感染的个体将再活化并发展为活动性TB。这些感染的个体(主要是婴儿或儿童)中大约有10%会发展为进行性临床疾病,称为原发性活动性TB。原发性TB通常发生在初次感染之后的1-2年内。这是由于局部杆菌性繁殖并在肺部和/或血液中传播所致。通过血液传播可在各种组织和器官中播种杆菌。由于免疫控制的丧失和杆菌的再活化,原发后或继发性TB可在感染之后许多年发生。患者的免疫反应导致病理性病变,其特征为局部的,通常是广泛的组织损伤和空洞形成。活动性原发后TB的特征可包括具有空洞形成的广泛的肺部破坏、痰液涂片阳性(最常见)和上叶受累,然而这些并非唯一。具有空洞病变(即突破到气道的肉芽肿)的患者为主要的感染传播者。在潜伏性TB中,宿主的免疫反应能够控制感染,但达不到根除病原体。潜伏性TB仅基于分枝杆菌蛋白致敏的证据来定义,其是在没有临床症状或从患者分离的细菌的情况下,在结核菌素皮肤测试(TST)对MTB的纯化蛋白衍生物的反应或干扰素-γ (IFN-γ)对MTB特异性抗原的体外释放测定方面的阳性结果。

抗结核病的BCG疫苗(Bacille de Calmette et Guérin)由减毒但活的牛结核杆菌(bovine tuberculosis bacillus) (牛分枝杆菌(

一项1994年的系统性回顾发现,BCG可将患TB的风险降低约50%。存在有效性的差异,其取决于区域,这是由于因素比如人群的遗传差异、环境变化、暴露于其他细菌感染以及其中疫苗生长的实验室的条件(包括所培养菌株之间的遗传差异和生长培养基的选择)所致。

BCG保护作用的持续时间尚不清楚地知道或了解。在显示保护作用的研究中,数据不一致。MRC研究表明,保护作用在15年之后下降至59%,在20年之后下降至零;然而,一项针对1930年代进行过免疫接种的美洲原住民的研究发现,即使在免疫接种之后60年也有保护作用的证据,但功效仅稍有下降。对结果的严格分析表明,BCG对成人肺部疾病的保护作用差,但对儿童播散性疾病和TB性脑膜炎的确提供良好的保护作用。因此,需要可提供对MTB的坚固和长期免疫的新疫苗和疫苗抗原。

抗体在对MTB产生免疫中的作用是有争议的。当前的数据表明,T细胞,特别是CD4

已经对MTB的细胞壁成分描述和分析了许多年。脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)已证明为一种毒力因子,并且针对LAM的单克隆抗体增强小鼠中对MTB的保护作用(Teitelbaum,等人, Proc. Natl. Acad. Sci. 95:15688-15693, 1998, Svenson等人, Human Vaccines,6-4:309-17, 2010)。MAB借以增强保护作用的机制尚未确定,并且MAB并未减轻杆菌性负荷。据推测,MAB可能阻断LAM诱导的细胞因子的作用。霉菌酸对疫苗和免疫治疗的作用尚不清楚。其已用于诊断目的,但尚未显示出对疫苗或其他免疫治疗方法具有效用。尽管MTB感染的个体可能产生针对霉菌酸的抗体,但没有证据表明一般抗体,或者特别是霉菌酸抗体,在对MTB的免疫中发挥作用。

抗生素抗性正越来越成为治疗MTB感染的问题。从1943年对TB进行首次抗生素治疗开始,某些TB菌菌株通过遗传变化对标准药物产生了抗性。针对TB的BCG疫苗不能在重大程度上提供保护作用免于获得TB。实际上,如果使用的治疗不正确或不充分,则抗性会加速,从而导致多药耐药TB (MDR-TB)的产生和传播。治疗不正确或不充分可能是由于使用了错误的药物、仅使用一种药物(标准治疗为至少两种药物)、没有持续或整个疗程服用药物(治疗需要几个月)。MDR-TB的治疗需要二线药物(例如氟喹诺酮类、氨基糖苷类等),这些药物通常比一线药物有效性更差,毒性更大且价格昂贵得多。如果对这些二线药物开具处方或服用不正确,则可产生进一步的抗性,从而导致极度耐药的TB (XDR-TB)。TB的抗性菌株已经存在于人群中,因此MDR-TB和XDR-TB直接从感染人传播到未感染人。因此,先前未经治疗的人可发展没有事先感染和/或治疗的MDR-TB或XDR-TB的新病例。这称为原发性MDR-TB或XR-TB,并且造成新TB病例的最多75%。当携带非抗性TB菌株的人治疗不充分,导致感染他/她们的TB细菌产生抗生素抗性时,产生获得性MDR-TB和XR-TB。这些人反过来又可感染患有MDR-TB的其他人。

耐药TB在2015年导致估计480000例新TB病例和250000例死亡,并且约占全球所有新TB病例的3.3%。TB细菌的这些抗性形式,无论是MDR-TB还是耐利福平的TB,导致新TB病例的3.9%和先前经治疗的TB病例的21%。在全球范围内,大多数耐药TB病例均发生在南美洲、非洲南部、印度、中国和前苏联地区。

MDR-TB的治疗需要用二线药物(通常是4种或更多种抗TB药物)治疗最少6个月,并且如果在患者已经感染的特定TB菌株中鉴定了利福平抗性,则可能会延长18-24个月。在理想的计划条件下,MDR-TB的治愈率可接近70%。XR-TB感染需要甚至更稳健和延长的治疗方案。

因此,强烈需要快速表征MTB的耐药菌株,使得可实施个性化的药物治疗。另外,由于MDR-TB以及TB是第三世界国家的主要问题,因此降低开支至关重要。

发明概述

本发明克服了与当前策略和设计相关的问题和缺点,并提供用于检测微生物抗性的新工具和方法。

本发明的一个实施方案涉及用于确定微生物抗性的方法,其包括:从含有微生物的生物样品中提取核酸;任选地,进行定量PCR以增加数量和/或评价微生物核酸;提供引物对的集合,其中每个引物对含有共有序列和可变序列,其中可变序列与负责抗性基因表达的微生物基因组的多个区域杂交;在PCR中将微生物核酸与引物对的集合组合以产生一系列扩增子;将所述扩增子系列连接至对生物样品特异性的独特序列;提供第二引物对集合,其中每个引物对含有与独特序列互补的序列和与一个或多个扩增子杂交的序列;在PCR中将连接的扩增子系列与第二引物对集合组合以产生第二扩增子系列;对第二扩增子系列进行测序;比较第二扩增子系列的序列与微生物核酸的野生型序列的序列;和鉴定生物样品的抗性基因的一个或多个突变。优选地,微生物抗性包括对抗生素的抗性。优选地,生物样品为体液、鼻涕、痰液样品、血液、组织样品、活检、培养样品或其组合。优选地,微生物为细菌、病毒、寄生虫和/或真菌。优选地,微生物为结核分枝杆菌。优选地,生物样品收集在含有胍、还原剂、螯合剂、非离子去污剂和缓冲剂的运输介质中。优选地,生物样品被灭菌。优选地,通过生物样品的化学或机械处理进行提取。优选地,集合和/或第二集合的引物对各自的长度为约20-约35个核苷酸。优选地,共有和/或独特序列的长度为约8-15个核苷酸。优选地,微生物基因组的多个区域中每一个的长度各自为约2 kb-约20 kb。优选地,微生物基因组含有4个或更多个不同的抗生素抗性基因,比如结核分枝杆菌的rpoB、katG、gyrA和pncA。优选地,连接通过将共有序列连接至扩增子系列中每个扩增子的5’末端来进行。优选地,连接通过将独特序列连接至第二扩增子系列中每个扩增子的5’末端来进行。优选地,聚合酶链反应为RT-PCR。优选地,所产生的扩增子系列和/或所产生的第二扩增子系列中扩增子的长度为50-1000个核苷酸,更优选地长度为100-500个核苷酸。优选地,将所产生的扩增子系列和/或所产生的第二扩增子系列中的扩增子在缓冲剂中稀释,并对一部分稀释的扩增子进行测序。优选地,通过离子激流(ion torrent)或下一代测序来进行测序,并且还优选地,以一步进行第二扩增子系列中扩增子的测序。优选地,所述方法在约24-约36小时内,更优选地在少于约24小时内进行。

本发明的另一个实施方案涉及治疗感染有分枝杆菌的患者,其包括:执行本文公开的本发明方法,其中生物样品获自患者;和用一种或多种药物或药物组合治疗患者。优选地,从执行所述方法到治疗患者的时间段少于48小时,更优选地从执行所述方法到治疗患者的时间段少于36小时,并且更优选地从执行所述方法到治疗患者的时间段少于24小时。

本发明的另一个实施方案涉及用于检测微生物抗性的试剂盒,其包含:用于收集生物样品的运输介质;用于PCR反应的引物对的集合,其中每个引物对含有共有序列和可变序列,其中可变序列与负责抗性基因表达的微生物基因组的多个区域杂交;第二引物对集合,其中第二集合的每个引物对含有与独特序列互补的序列;和PCR混合物,其包含:热稳定的聚合酶、三磷酸脱氧核苷酸(包含约等量的dATP、dCTP、dGTP和/或dTTP)、螯合剂、盐、缓冲剂和稳定剂。

本发明的另一个实施方案涉及用于确定多个生物样品中的微生物抗性的方法,其包括:从所述多个生物样品的每一个中提取核酸,每个所述多个生物样品均含有相同的微生物;任选地,分别进行定量PCR以增加数量和/或评价所述多个生物样品中的一个或多个的微生物核酸;提供引物对的集合,其中每个引物对含有共有序列和可变序列,其中可变序列与负责抗性基因表达的微生物基因组的多个区域杂交;在PCR中分别将提取的每种微生物核酸与引物对集合组合,以为每个生物样品产生一系列扩增子;将每个扩增子系列分别连接至对生物样品特异性的独特序列;提供第二引物对集合,对于所产生的每个扩增子系列为各一个第二集合,其中每个第二集合含有与独特序列互补的序列和与一个或多个扩增子杂交的序列;在PCR中分别将连接的扩增子系列与第二集合组合以为每个生物样品产生第二扩增子系列;合并所有所产生的每个生物样品的第二扩增子系列;对合并的扩增子进行测序;比较合并的扩增子的序列与微生物核酸的野生型序列的序列;和鉴定每个生物样品的抗性基因中的一个或多个突变。

本发明的其他实施方案和优点部分地在随后的描述中阐述,并且部分地可从该描述中显而易见,或者可从本发明的实践中获悉。

发明描述

结核分枝杆菌(MTB)为结核病(TB)的病原体,并且世界人口中约三分之一感染有结核分枝杆菌(MTB)。越来越多的多药耐药(MDR)和广泛耐药(XDR) MTB菌株的病例持续流行,特别是在整个亚洲、非洲和欧洲东部。尽管MDR菌株为对抗生素利福平(RIF)和异烟肼(INH)具有抗性的菌株,但XDR菌株对氟喹诺酮(FQ)和至少一种可注射的氨基糖苷类药物(例如阿米卡星、卡那霉素或卷曲霉素)呈现出另外的抗性。TB以一种形式或另一种形式折磨我们行星的约三分之一人口,耐药菌株变得更加常见。

靶向测序为一种用于分析生物体中特定核苷酸序列的方法,其相对于传统的下一代测序(NGS)方法提供几个优势。具体地讲,其使聚焦且更灵敏的方法能够用于产生可靠的高质量(即Q> 30)数据和足够的覆盖深度。使用靶向扩增的下一代测序包括一系列离散步骤,这些步骤独特地有助于数据集的总体质量。标准化测序度量提供有关样品处理(包括文库制备、碱基识别、读出比对和变体识别)的准确性的信息。碱基识别准确性为通过Phred质量分数(Q分数)来衡量,并且一般地用于通过测序仪评价碱基识别的准确性。成本和时间对NGS工作流程也重要。需要高质量的方法,其确保可重复性并减少获得结果的时间,而无需使用辅助和昂贵的设备,这一点至关重要,特别是在资源有限的环境中。

已经令人惊讶地发现,可以快速和廉价地从生物样品中确定微生物抗性,这是治疗的关键关注点。确定并不复杂,仅涉及具有名义上训练的基本实验室技术。另外,没有苛刻或危险的化学品、设备或其他材料。因此,对医护人员的风险尽可能小。

本发明的一个实施方案涉及一种用于确定微生物比如细菌、病毒、寄生虫或真菌感染的微生物抗性的方法。优选地,微生物为结核分枝杆菌(MTB)或流感病毒。

优选地,生物样品收集在运输介质中,并且更优选地在含有胍、还原剂、螯合剂、非离子去污剂和缓冲剂的水性运输介质中。 优选的水性运输介质为PRIMESTORE™(Longhorn Vaccines and Diagnostics, LLC, Bethesda, MD)。优选地,生物样品被灭菌。优选地,通过生物样品的化学或机械处理进行提取。

通过对获自怀疑被感染的患者的生物样品进行分析来确定抗性。所述方法包括:从生物样品中提取核酸。优选地,生物样品例如为体液、鼻涕、痰液样品、血液、组织样品、活检或其组合。或者,生物样品可获自将生物样品用于生长和/或发育的培养物,比如琼脂平板或其他生长支持物、肉汤、悬浮液和/或体外细胞培养物。

任选地,可通过定量PCR处理提取的核酸以增加数量和/或评价微生物核酸。将来自生物样品或来自定量PCR的核酸与引物对的集合进行组合,其中每个引物对含有共有序列和可变序列,其中可变序列与已知或预计负责微生物的抗性基因表达的微生物基因组的多个区域杂交。所有引物的共有序列均相同,并且优选连接至每个引物的5’末端。优选地,集合的引物对各自的长度为约15-约35个核苷酸,更优选地为约18-25个核苷酸。引物也可更大或更小。优选地,共有序列为引物长度的约三分之一至一半。优选地长度为约8-15个核苷酸。

对微生物核酸和第一引物对系列进行PCR,以产生一系列扩增子。聚合酶链反应可为用于DNA序列的PCR或用于RNA序列的逆转录PCR (RT-PCR)。由于每个引物上均有共有序列,所产生的扩增子系列将各自保留该共有序列,并且该共有序列识别出从特定生物样品中产生的扩增子。

将所产生的扩增子各自连接至同样对生物样品特异性的独特序列。优选地,独特序列的长度为约4-20个核苷酸,但是根据需要可以更长或更短。更优选地,独特序列的长度为6-10个核苷酸。优选地,连接通过将共有序列连接至扩增子系列中每个扩增子的5’末端来进行。优选地,连接通过将独特序列连接至第二扩增子系列中每个扩增子的5’末端来进行。

提供第二引物对集合,其长度优选地为约15-约35个核苷酸,更优选地为约18-25个核苷酸(尽管可以使用更小或更大的引物)。每个引物对含有与独特序列互补的序列和与一个或多个扩增子杂交的序列。在PCR中将连接的扩增子系列与第二引物对集合组合以产生第二扩增子系列。对该第二扩增子系列进行测序,并将确定的序列与微生物核酸的野生型序列的序列进行比较。从与野生型序列的比较中可鉴定出生物样品的抗性基因的一个或多个突变。优选地,微生物抗性包括对抗生素或者其他药物或药物混合物的抗性。

本发明的另一个实施方案为分别对多个生物样品进行第一PCR,并进行上面概述的方法的所有步骤。测序之前,可将产生的各种扩增子合并,任选地稀释并一起测序。因为每个独特序列均与特定的生物样品一致,因此可容易地将所鉴定出的突变鉴定至特定的生物样品,从而至患者。

优选地,所产生的扩增子系列和/或所产生的第二扩增子系列中扩增子的长度为50-1000个核苷酸,更优选地长度为100-500个核苷酸。优选地,将所产生的扩增子系列和/或所产生的第二扩增子系列中的扩增子在缓冲剂中稀释,并对一部分稀释的扩增子进行测序。优选地,通过离子激流或下一代测序来进行测序,并且还优选地,以一步进行第二扩增子系列中扩增子的测序。优选地,所述方法在约24-约36小时内,更优选地在少于约24小时内进行。

对于MTB,优选地,微生物基因组含有4个或更多个不同的抗生素抗性基因,比如rpoB、katG、gyrA和pncA。对于流感,耐药性区域为流感基因组的HA和NA区域。

本发明的另一个实施方案涉及治疗感染有分枝杆菌的患者,其包括:执行本文公开的本发明方法,其中生物样品获自患者;和用一种或多种药物或药物组合治疗患者。优选地,从执行所述方法到治疗患者的时间段少于48小时,更优选地从执行所述方法到治疗患者的时间段少于36小时,并且更优选地从执行所述方法到治疗患者的时间段少于24小时。

本发明的另一个实施方案涉及用于检测微生物抗性的试剂盒,其包含:用于收集生物样品的运输介质;用于PCR反应的引物对的集合,其中每个引物对含有共有序列和可变序列,其中可变序列与负责抗性基因表达的微生物基因组的多个区域杂交;第二引物对集合,其中第二集合的每个引物对含有与独特序列互补的序列;以及PCR混合物,其包含:热稳定的聚合酶、三磷酸脱氧核苷酸(包含约等量的dATP、dCTP、dGTP和/或dTTP)、螯合剂、盐、缓冲剂和稳定剂。

本发明的另一个实施方案涉及用于确定多个生物样品中的微生物抗性的方法,其包括:从所述多个生物样品的每一个中提取核酸,每个所述多个生物样品均含有相同的微生物;任选地,分别进行定量PCR以增加数量和/或评价所述多个生物样品中的一个或多个的微生物核酸;提供引物对的集合,其中每个引物对含有共有序列和可变序列,其中可变序列与负责抗性基因表达的微生物基因组的多个区域杂交;在PCR中分别将提取的每种微生物核酸与引物对的集合组合,以为每个生物样品产生一系列扩增子;将每个扩增子系列分别连接至对生物样品特异性的独特序列;提供第二引物对集合,对于所产生的每个扩增子系列为各一个第二集合,其中每个第二集合含有与独特序列互补的序列和与一个或多个扩增子杂交的序列;在PCR中分别将连接的扩增子系列与第二集合组合以为每个生物样品产生第二扩增子系列;合并所有所产生的每个生物样品的第二扩增子系列;对合并的扩增子进行测序;比较合并的扩增子的序列与微生物核酸的野生型序列的序列;和鉴定每个生物样品的抗性基因中的一个或多个突变。

尽管本发明通常指涉结核分枝杆菌对人类的感染进行描述,但是如本领域技术人员所清楚的,方法和组合物通常并且特别地适用于治疗和预防许多其他受试者(例如牛、马、绵羊、猫、狗、农场动物、宠物等)中的许多其他疾病和感染,并且尤其是其中病原体属于病毒、细菌、真菌和寄生虫来源的疾病。其中本发明的方法可用于确定和鉴定抗性的微生物包括例如链球菌属(Streptococcus spp.)、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、志贺氏菌属(Shigella spp.)、耶尔森氏菌属(Yersinia spp.) (例如鼠疫耶尔森氏菌(Y. pestis))、梭状芽孢杆菌属(Clostridium spp.) (例如肉毒梭状芽孢杆菌(C.botulinum)、艰难梭状芽孢杆菌(C. difficile))、李斯特菌属(Listeria spp.)、葡萄球菌属(Staphylococcusspp.)、沙门氏菌属(Salmonella spp.)、弧菌属(Vibrio spp.)、衣原体属(Chlamydiaspp.)、淋病属(Gonorrhea spp.)、梅毒属(Syphilis spp.)、MRSA、链球菌属(Streptococcus spp)、埃希氏菌属(

以下实施例说明本发明的实施方案,但不应视为限制本发明的范围。

实施例

实施例1

靶向测序为一种用于分析生物体中特定核苷酸序列的方法,其相对于传统的下一代测序(NGS)方法提供几个优势。具体地讲,其使聚焦且更灵敏的方法能够用于产生可靠的高质量(即Q> 30)数据和足够的覆盖深度。使用靶向扩增的下一代测序包括一系列离散步骤,这些步骤独特地有助于数据集的总体质量。标准化测序度量提供有关样品处理(包括文库制备、碱基识别、读出比对和变体识别)的准确性的信息。碱基识别准确性为通过Phred质量分数(Q分数)来衡量,并且一般地用于通过测序仪评价碱基识别的准确性。成本和时间对NGS工作流程也重要。需要高质量的方法,其确保可重复性并减少获得结果的时间,而无需使用辅助和昂贵的设备,这一点至关重要,特别是在资源有限的环境中。

结核分枝杆菌(MTB)为结核病(TB)的病原体。越来越多的多药耐药(MDR)和广泛耐药(XDR) MTB菌株的病例持续流行,特别是在整个亚洲、非洲和欧洲东部。尽管MDR菌株为对抗生素利福平(RIF)和异烟肼(INH)具有抗性的菌株,但XDR菌株对氟喹诺酮(FQ)和至少一种可注射的氨基糖苷类药物(例如阿米卡星、卡那霉素或卷曲霉素)呈现出另外的抗性。TB以一种形式或另一种形式折磨我们行星的约三分之一人口,耐药菌株变得更加常见。

迫切需要快速表征耐药菌株,使得可实施个性化的药物治疗。使用下一代测序(NGS)进行的标准全基因组遗传分析已在每次运行分析多个样品时实现快速的基因组分析,且样品制备时间最短(2-4天),成本适中。Illumina MiSeq平台每次运行最多可对24个全MTB基因组进行测序,平均可重复的覆盖深度为~30倍。然而,标准的NGS工作流程需要使用昂贵的设备和试剂来进行文库制备,这在世界上许多地区均成本高昂。例如,Nextera XTLibrary Prep Kit (FC-131-1024)使用Illumina专有的‘标签化-碎片化’(称为“标签和碎片(tag and frag)”)技术,在将仪器加载到Illumina平台上之前进行精确的大小选择和文库归一化。试剂盒需要冷冻酶储存和扩展的深度工作流程。最重要的是,用于24个反应的试剂盒定价很高。

如本文公开和描述的方法和试剂盒通过利用高度灵敏和特异性的‘靶向’扩增方法来规避使用这种昂贵的方法,该方法采用执行3个重要步骤的杂合寡核苷酸引物:1) 目标区域的靶向扩增。在该实施例中,在其中已知产生赋予耐药性的突变的特定区域中扩增关键TB基因(rpoB、katG、gyrA、pncA)。2) 通过PCR,靶向的寡核苷酸产生所需长度(即100-500个核苷酸)的扩增子,这避免需要使用常规系统进行大小选择或使用凝胶电泳进行繁琐的切除。3) 靶标寡核苷酸的5个主要末端含有必需的寡核苷酸‘接头’序列,其使得能够基于单次运行对‘条形码’或‘索引化’的多个患者样品进行后续的下游扩增。这降低与NGS相关的成本,并能够对基因组数据进行统一分析,以快速筛选MTB基因中赋予耐药性的突变。

因此,所开发的方法减少工作流程,对辅助设备的需求以及Illumina或其他NGS文库制备试剂盒和试剂的成本。使用耐药性MTB基因靶向的工作流程简要概述如下:

1. 收集:优选地在PrimeStore MTM中收集样品,例如MGIT、LJ培养物或初始痰液。

2. 提取:优选地根据制造商的建议使用PrimeXtact Kit提取样品(可使用的常规提取系统包括例如Qiagen、Roche MagNApure)。

3. 确认性qPCR:定量PCR确定所收集/提取样品的质量和数量,并提供用于确定下游NGS成功的度量。

4. 靶向的NGS扩增:引物对产生长度在400-500个核苷酸之间的扩增子。引物含有Longhorn优化的靶标特异性序列,用于产生rpoB、katG、gyrA和pncA基因的区域。该区域以其中已知发生最普遍的赋予抗性的突变的区域为目标。更重要的是,引物含有附加于引物对序列上的突出端(overhand)接头序列,以与Illumina索引和测序接头相容。

5. 制备文库:可使用以上步骤4中掺入的接头序列添加Illumina测序条形码(索引)。这需要进行二次PCR (仅12个循环;约30分钟)。进行PCR净化以去除PCR试剂并纯化文库。

6. 量化和归一化:使用小型台式Qubit荧光计对文库进行量化,并随后稀释至~5nM。重要的是,一次测序运行最多可将96个文库合并在一起。

在MiSeq上的测序:在准备测序时,将合并的文库(最多96个样品)用NaOH (0.2 N)变性,用杂交缓冲液(10 mM TRIS, pH 8.5)稀释,并热变性(96℃)两分钟,之后加载到MiSeq仪器上。由于文库的长度在400-500 bp之间,因此可使用便宜的MiSeq V2 ReagentKit (500个循环;REF 15033625;$360)。该试剂盒的运行时间为约24小时。

实施例2

进行下一代测序,以表征高流行性多药耐药结核分枝杆菌突变。下一代测序(NGS)为用于遗传表征赋予多药耐药(MDR)的结核分枝杆菌(MTB)突变的已建立方法。然而,NGS仍然成本高昂,并且需要进行大量的文库制备。使用一组南非临床分离株,使用了一种简化的靶向PCR方法来检测rpoB (利福平)、katG (异烟肼)、gyrA (氟喹诺酮)和pncA (吡嗪酰胺)基因中高流行性的MDR特异性突变。将结果与通过全基因组测序(WGS)获得的那些结果进行比较。

针对以下基因设计和优化了4种靶向PCR测定:1) 包含利福平抗性决定区的rpoB,2) 跨越S-315-T抗性突变的katG,3) 包含喹诺酮抗性决定区的gyrA,和4) 完整的pncA基因。使用Illumina MiSeq,使用来自南非的临床分离株(N = 16)评估靶向PCR结果,并与WGS进行比较。

在通过靶向测序分析的16种临床分离株中,12种(75%)带有S-450-L突变,3种(19%)含有D-435-L,和1种在rpoB中具有较不流行的Q-423-K赋予利福平抗性的突变。KatG的分析显示,11种分离株(69%)带有S-315-T异烟肼赋予突变,10种(63%)在gyrA中含有氟喹诺酮抗性突变,和11种(69%)含有pncA基因突变。通过靶向测序获得的所有突变均通过WGS确认。

靶向NGS在11种(69%)非洲分离株中检测到MDR-TB。在一种MDR分离株中,检测到较不流行的Q-423-K rpoB赋予抗性的突变。与GeneXpert相比较,靶向测序检测到更广泛范围的赋予抗性的突变,并且更具成本效益,特别是在其中无法进行培养或WGS的资源贫乏地区。

通过考虑本文公开的发明的说明书和实践,本发明的其他实施方案和用途对于本领域技术人员将是显而易见的。本文引用的所有参考文献,包括所有公开以及美国和外国专利和专利申请,均通过参考具体和全部结合。无论何时使用,词语“包含”旨在包括术语“由……组成”和“基本上由……组成”。此外,词语 “包含”、“包括”、“含有”等不旨在为限制性的。旨在认为说明书和实施例仅为示例性的,本发明的真实范围和精神由所附权利要求指出。

技术分类

06120112210776