一种高地芽孢杆菌YG045及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种高地芽孢杆菌YG045及其应用。

背景技术

水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)和水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)分别引起水稻白叶枯病和水稻细菌性条斑病，是我国水稻生产上的两种主要细菌病害，常年发生面积在1000～1500万亩，危害面积达500～800万亩，通常造成产量损失5％～10％，严重时达50％以上，甚至绝产。近年来，由于水稻轻简化种植模式推广，两系杂交籼稻栽培面积增加，种质资源交换频繁，病原菌致病性变异等原因，导致两种细菌病害不仅继续在南方籼稻区流行为害，而且快速向我国长江流域籼粳混栽区及北方粳稻区扩展蔓延，对我国水稻安全生产构成严重威胁。目前，水稻细菌病害的防控严重依赖化学农药，主要包括三氯异氰尿酸、氯溴异氰尿酸、噻菌铜、噻霉酮、噻唑锌等。然而，化学农药的长期不合理使用导致病原菌抗药性逐渐增强，施用剂量盲目增加，防治效果不理想，对病害的综合防治效果在50％～70％，同时残留农药对食品安全和生态环境构成严重威胁。另外，由于开发安全、高效化学杀菌剂的成本高昂，投资风险巨大，近年来，登记用于防治作物细菌病害的新型化学杀菌剂种类很少。

近年来，具有相对安全、无残留、环境友好等优点的生物农药产业不断增长，成为国际绿色农药发展的重点。基于微生物的生物防控技术被认为是未来控制作物细菌病害的主要发展方向之一。芽孢杆菌(Bacillus spp.)属于革兰氏阳性细菌，广泛分布于土壤、植物表面、水体、农业废弃物等各种生境中，具有广谱的抗菌活性、较高的芽孢产率和较强的逆境适应性，被认为是最具有应用开发潜力的有益微生物之一，例如解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、多粘类芽孢杆菌(B.polymyxa)、坚强芽孢杆菌(B.firmus)、蜡状芽孢杆菌(B.cereus)等，是一类被科学家和消费者广泛认可的对人体安全的生防微生物，目前我国含芽孢杆菌活性成分的杀菌剂登记产品达138个。

相对上述芽孢杆菌，关于高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)防治作物病害的研究报道较少，且来源不同菌株的生物学特性、抗菌谱等存在明显差异，具有菌株特异性。发明专利CN105820981A公开了一株高地芽孢杆菌对桃褐腐病、灰霉病、软腐病及青霉病等多种真菌病害表现较好生防效果；发明专利CN108865946A公开了一株高地芽孢杆菌对番茄根结线虫具有较好的防治效果。研究能够对水稻白叶枯病和水稻细菌性条斑病具有防治效果的高地芽孢杆菌菌株具有重要生产实践意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种对水稻白叶枯病和水稻细菌性条斑病具有较好生防效果的高地芽孢杆菌YG045及其应用。本发明的高地芽孢杆菌菌株具有生长速度快、拮抗活性强、生防效果好、对化学杀菌剂耐受性强等特性。

为解决上述问题，本发明采取的技术方案如下：

本发明采用稀释涂布分离法和平板拮抗法从苹果树根际土壤分离筛选获得一种对水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、番茄灰霉病菌均具有较强拮抗活性的生防菌株YG045，采用菌落形态观察、菌体形态观察和gyrB基因序列测定相结合的方法，将该菌株鉴定为高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)。该菌株已于2020年6月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，菌种保藏编号为CGMCC No.20157。

高地芽孢杆菌菌株YG045在NA固体培养基平板上，28℃条件下培养24h后的菌落特征：单菌落接近象牙白色，略扁平，形状不规则，直径1.5mm～3.0mm，菌落表面有光泽，边缘不整齐；其菌体形态为杆状，直径约0.5μm～0.6μm，长度约1.5μm～2.3μm，芽孢呈杆状或梭状。所使用的NA固体培养基成分为：蛋白胨5g，蔗糖10g，酵母提取物1g，牛肉浸膏3g，琼脂粉15g，加水定容至1000mL，pH 6.8～7.2，121℃条件下灭菌20min。

本发明采用室内NA固体培养基平板生测法测定了高地芽孢杆菌YG045对噻唑锌、噻霉酮、三氯异氰尿酸的耐受性。

本发明提供所述高地芽孢杆菌YG045的发酵产物。本发明所述的发酵产物可以为本领域常规的任何一种发酵后的产物形式，例如包括但不限于可以为含有菌体的发酵液，也可以为过滤除菌后的无菌发酵滤液，或者为菌株发酵后提取获得的有效成分。

在本发明的一些实施例中，本发明提供所述高地芽孢杆菌YG045的发酵液，此处的发酵液可以指含有菌体的发酵液；在本发明的另一些实施例中，本发明提供所述高地芽孢杆菌YG045的无菌发酵滤液，可以指发酵液过滤除去菌体后的液体。

本发明还提供含有所述高地芽孢杆菌YG045的菌悬液，可以是离心获得的菌体按照本领域常规方法和常规试剂重悬获得的溶液。

本发明还提供包含所述高地芽孢杆菌YG045和/或高地芽孢杆菌YG045发酵产物的生防菌剂。

本发明所述的发酵产物、发酵液、无菌发酵滤液、生防菌剂可以按照本领域常规的方法进行制备，例如将高地芽孢杆菌YG045制备成种子液后，接种到发酵培养基中发酵获得发酵液；发酵液离心过滤后获得无菌发酵滤液；发酵液加入本领域允许的助剂后形成生防菌剂。

在一种具体的实施例中，本发明提供包含所述高地芽孢杆菌YG045和/或高地芽孢杆菌YG045发酵产物的生防菌剂的制备方法：

(1)活化培养：取本发明高地芽孢杆菌YG045的甘油菌种，划线接种至新鲜NA固体平板上，在26℃～30℃条件下培养24h～36h；

(2)种子液制备：挑取一个单菌落接种NB液体培养基中，26℃～30℃下振荡培养16h～24h，振荡频率为100r/min～200r/min；

(3)生防菌液的制备：将步骤(2)所得的种子液以1％～5％(v/v)的比例接种到NB培养基中进行发酵，发酵温度为27℃～30℃，装料量为200～400mL/1000mL，培养基的初始pH为6.5～7.2，搅拌速度为100r/min～180r/min，发酵时间为48h～72h，经平板涂布法计数，发酵液菌体密度大于2.17×10

(4)生防菌剂的制备：在上述步骤(3)制备的发酵液中添加本领域常规的助剂，将pH值调整到4～5左右，然后无菌灌装，室温保存。

本发明生防菌剂制备中常规的助剂可以按照本领域的常规方法进行选择，例如，本发明一种具体的实施例中，是添加表面活性剂脂肪醇聚氧乙烯醚，增稠剂黄原胶，消泡剂聚二甲氧基烷，防腐剂苯甲酸钠，在本发明的一些更具体的实施中，生防菌剂的制备中，助剂加入的质量百分比为脂肪醇聚氧乙烯醚1.0％～2.0％，黄原胶0.2％～0.3％，聚二甲氧基烷0.2％～0.5％，苯甲酸钠0.1％～0.15％。此处仅是对一种实施例的列举，但并不限于这种助剂添加方法，其他可以形成菌剂剂型的方案均可。

在本发明的一些实施中，NB培养基组分为：蛋白胨5g，蔗糖10g，酵母提取物1g，牛肉浸膏3g，加水定容至1000mL，pH 6.8～7.2，121℃条件下灭菌20min。

在本发明的一些实施中，NA固体培养基组分为：蛋白胨5g，蔗糖10g，酵母提取物1g，牛肉浸膏3g，琼脂粉15g，加水定容至1000mL，pH 6.8～7.2，121℃条件下灭菌20min。

本发明还提供所述高地芽孢杆菌YG045、发酵产物、发酵液、无菌发酵滤液、菌悬液或所述生防菌剂在防治水稻白叶枯病或/和水稻细菌性条斑病中的应用。

在一种实施例中，本发明所述防治水稻白叶枯病的应用，具体为：在水稻感染白叶枯病菌前或水稻感染白叶枯病菌后喷雾处理。

在一种实施例中，本发明所述防治水稻细菌性条斑病的应用，具体为：在水稻感染细菌性条斑病之前或感染发生初期进行喷雾处理，间隔7～10d再喷施处理1～2次。

在一些具体的实施例中，喷雾处理所用液体中高地芽孢杆菌YG045的菌体密度为1.0×10

相对现有技术，本发明的优点如下，

本发明提供的高地芽孢杆菌YG045是一种新发现的芽孢杆菌生防资源，对水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、番茄灰霉病菌均具有较高的拮抗活性，对防治水稻细菌病害的3种主要化学杀菌剂表现较强耐受性；利用本发明菌株制备的生防菌剂对水稻白叶枯病和水稻细菌性条斑病均表现较高生防效果，可以替代或减少化学农药用量，提高食品和生态环境安全，具有较好的经济和生态效益。

附图说明

图1为1株初步鉴定的生防菌对3种植物病原细菌的平板拮抗活性；

图2为1株初步鉴定的生防菌对不同水稻白叶枯病菌菌株的拮抗活性；

图3为1株初步鉴定的生防菌对不同水稻细菌性条斑病菌菌株的拮抗活性；

图4为1株初步鉴定的生防菌对番茄灰霉病菌的拮抗活性；

图5为高地芽孢杆菌YG045在NA培养基平板上的菌落、菌体及芽孢形态；

图6为基于高地芽孢杆菌YG045的gyrB基因序列的进化树分析；

图7为高地芽孢杆菌YG045在NB培养基中的生长动态；

图8为高地芽孢杆菌YG045对3种化学杀菌剂的耐受性；

图9为高地芽孢杆菌YG045生防菌剂对水稻白叶枯病的生防效果。

具体实施方式

本发明所涉及的高地芽孢杆菌菌株YG045，已于2020年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为Bacillus altitudinis，菌种保藏编号为CGMCC No.20157。本发明所用的水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)菌株YN1、YN7、YN24、GD414、FUJ、SCYC-6、水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzicola)菌株Rs105、Xoc192、Xoc197、Xoc-S、Xoc-M、Xoc-W、野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)均为本研究室保存菌株，其他单位或个人可以向本研究室索取以上13个病原细菌菌株和1个病原真菌菌株。

以下实施例用于说明本发明，但并不限定于本发明。若无特殊说明，下述实施例中所用技术方法均为常规方法；若无特殊说明，下述实施例中所用实验材料，均为常规化学试剂和生化试剂。

以下所述的NB培养基组分为：蛋白胨5g，蔗糖10g，酵母提取物1g，牛肉浸膏3g，加水定容至1000mL，pH 6.8～7.2，121℃条件下灭菌20min；NA为固体培养基，为NB培养基添加琼脂粉15g/L。

以下所述的PDA培养基组分为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉16g/L，加水定容至1000mL，自然pH，121℃条件下灭菌20min。配制PDA培养基前，将马铃薯200g沸水煮20min，利用双层纱布过滤，取滤液配置培养基。

以下所述实施例仅为本发明部分较好的实施例，仅用于描述本发明，不能理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

实施例1：

高地芽孢杆菌菌株YG045的分离与鉴定

(1)待筛选菌种资源的分离：从苹果树根际随机取土壤50g，共取10份土壤样品，混合均匀，取10g土壤放入含有20粒细玻璃珠和100mL灭菌去离子水的250mL锥形瓶中，置于摇床上150r/min、28℃条件下震荡培养1h。静置10min，取上清1mL，利用灭菌去离子水10倍梯度稀释，吸取100μL每个浓度梯度稀释液凃布于NA固体平板，28℃条件下静置培养36h。利用接种环挑取单菌落在NA固体培养基上划线纯化2次，将纯化的不同形态单菌落转接到NA固体平板上，28℃条件下倒置培养48h，保存于4℃备用。

(2)生防菌株的平板拮抗筛选：将保存于NA固体平板上纯化的各菌株在NB液体培养基中培养，培养条件为150r/min、28℃、36h，作为种子液备用；另外，将水稻白叶枯病菌YN1和水稻细菌性条斑病菌Rs105的甘油菌种分别划线接种到NA固体平板上，28℃条件下培养48h，然后挑取单菌落接种到含有50mL NB液体培养基的250mL锥形瓶中，150r/min、28℃条件下培养36h，将培养液(OD

利用内径为4mm的打孔器在新鲜的番茄灰霉病菌菌落边缘打取菌丝块，将菌丝块放置在PDA固体培养基平板中心，28℃条件下倒置培养24h，然后将上述制备的生防菌种子液2μL点到距离番茄灰霉病菌菌丝块约2cm处，每个平板均匀点3个点，另外点2μL NB液体培养基为空白对照，在28℃条件下继续倒置培养96h。结果发现，编号为YG045菌株对番茄灰霉病菌具有显著拮抗活性，如图4所示。

(3)生防菌株YG045的形态观察：利用无菌接种环从4℃保存的YG045平板上调取菌体，在NA固体平板上划线培养，28℃条件下培养24h后的菌落特征：单菌落接近象牙白色，略扁平，形状不规则，直径1.5mm～3.0mm，菌落表面有光泽，边缘不整齐；菌体革兰氏阳性，形态为杆状，直径约0.5μm～0.6μm，长度约1.5μm～2.3μm；28℃条件下，在NA固体营养平板上培养54h，挑取菌体利用透射电镜进行观察，菌体大部分转化为芽孢，芽孢呈杆状或梭状，直径约0.5μm～0.6μm，长度约1.4μm～2.0μm。生防菌YG045菌落、菌体及芽孢形态如图5所示。

(4)生防菌株YG045的分子鉴定：利用灭菌牙签挑取YG045单菌落于含有50mL NB液体培养基的250mL锥形瓶中，150r/min、28℃条件下培养36h，利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取YG045的总基因组DNA。利用细菌gyrB基因的通用引物UP-1(5’-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3’)和UP-2r(5’-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3’)PCR扩增DNA片段；利用测序引物UP-1S(5’-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA-3’)和UP-2Sr(5’-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC-3’)对PCR产物进行测序，YG045 gyrB基因序列如SEQ ID NO.1所示。基于获得的gyrB基因序列和GenBank数据库，利用MEGA 7.0软件对YG045进行进化树分析，该菌株与高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)聚合在一起，属于高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)，如图6所示。

实施例2：

高地芽孢杆菌YG045在NB培养基中的生长动态

从-70℃超低温冰箱取出甘油保存的YG045菌株，划线接种到NA固体平板上，28℃条件下培养36h；利用灭菌牙签挑取YG045单菌落接种到含有50mL NB液体培养基的250mL锥形瓶中，150r/min、28℃条件下培养36h，作为种子液；将种子液按照1％(v/v)的比例接种到含有50mL NB液体培养基的250mL锥形瓶中，180r/min、28℃条件下培养84h，于接种后每间隔6h测定1次发酵液的吸光值(OD

实施列3：

高地芽孢杆菌YG045对3种化学杀菌剂的耐受性

噻唑锌、噻霉酮和三氯异氰尿酸是目前生产上防治水稻白叶枯病和水稻细菌性条斑病的三种主要化学杀细菌剂。本实验在室内测定了高地芽孢杆菌YG045对三种化学杀菌剂的耐受性，并以水稻细菌性条斑病菌Rs105为对照，具体方法如下：首先，分别将噻唑锌和噻霉酮溶于DMSO，配置20mg/mL噻唑锌和6.4mg/mL噻霉酮母液；将三氯异氰尿酸溶于无菌水，配置7.1mg/mL母液；然后，分别制备噻唑锌终浓度为0μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL的NA固体平板，噻霉酮终浓度为0μg/mL、0.125μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL的NA固体平板，三氯异氰尿酸终浓度为0μg/mL、64μg/mL、128μg/mL、256μg/mL的NA固体平板。将高地芽孢杆菌YG045培养液(OD

实施例4：

高地芽孢杆菌YG045生防菌剂的制备

取本发明高地芽孢杆菌YG045的甘油菌种，划线接种到NA固体平板上，28℃条件下培养36h；利用灭菌牙签挑取YG045单菌落接种到含有50mL NB液体培养基的250mL锥形瓶中，180r/min、28℃条件下培养16h，作为种子液；将种子液以1％(v/v)的比列接种到装有200mL NB培养基的1000mL锥形瓶中，160r/min、28℃条件下培养60h。在发酵液中添加脂肪醇聚氧乙烯醚1.0％，黄原胶0.2％，聚二甲氧基烷0.3％，苯甲酸钠0.1％，利用稀盐酸将pH值调整到4.5左右，即为YG045生防菌剂，然后无菌分装，室温保存。

实施例5：

高地芽孢杆菌YG045生防菌剂对水稻白叶枯病的温室防治试验

从-70℃超低温冰箱取出甘油保存的水稻白叶枯病菌菌株YN1，划线接种到NA固体平板上，28℃条件下培养48h；利用灭菌牙签挑取YN1单菌落接种到含有50mL NB液体培养基的250mL锥形瓶中，150r/min、28℃条件下培养48h，利用无菌水将菌体浓度调整到1.0×10

选取孕穗期的感病水稻品种IR24，设置5个生防试验处理：处理1，首先喷施实施例4制备的生防菌剂40倍稀释液，24h后剪叶接种水稻白叶枯病菌种子液，试验开始后第7d再喷施1次生防菌剂40倍稀释液；处理2，首先喷施实施例4制备的生防菌剂60倍稀释液，24h后剪叶接种水稻白叶枯病菌种子液，试验开始后第7d再喷施1次生防菌剂60倍稀释液；处理3，首先剪叶接种水稻白叶枯病菌种子液，24h后喷施实施例4制备的生防菌剂40倍稀释液，试验开始后第7d再喷施1次生防菌剂40倍稀释液；处理4，首先剪叶接种水稻白叶枯病菌种子液，24h后喷施实施例4制备的生防菌剂60倍稀释液，试验开始后第7d再喷施1次生防菌剂60倍稀释液；处理5，剪叶接种水稻白叶枯病菌种子液，作为对照处理。每个处理接种15株水稻，每株剪叶接种上部2张叶片，接种后14d随机调查20张叶片的病斑长度。结果发现，仅接种病原菌的对照处理叶片病斑平均长度达10.98cm，相对于对照处理，4个喷施生防菌剂处理的叶片病斑长度下降67.9％～80.2％，且接种病原菌前喷施生防菌剂处理的生防效果好于接种病原菌后再喷施生防菌剂的处理，如图9所示。

实施列6：

高地芽孢杆菌YG045生防菌剂对水稻细菌性条斑病的防治试验

2020年度，利用上述实施例4制备的YG045生防菌剂进行田间防治水稻细菌性条斑病小区试验，试验设置4个处理：YG045生防菌剂750mL/亩、YG045生防菌剂1000mL/亩、3％噻霉酮悬浮剂100mL/亩、清水对照，每亩用水40kg，均匀喷雾。水稻品种为C两优0861，于8月7日(水稻孕穗期)调查见病。于8月10日第1次施药并调查病情基数，8月19日第2次施药，于第2次用药后第11d调查病情指数，统计分析防治效果。结果如表1所示，第2次用药后第11d，YG045生防菌剂1000mL/亩剂量的防效为62.4％，与化学药剂3％噻霉酮悬浮剂的防效相近(67.4％)；YG045生防菌剂750mL/亩剂量的防效为53.0％。

表1 YG045生防菌剂防控水稻细菌性条斑病田间试验结果

上述实施例说明本发明涉及的高地芽孢杆菌菌株YG045对水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌和番茄灰霉病菌具有较强的拮抗活性，对防治水稻细菌病害的3种主要化学杀菌剂具有较强耐受性，对水稻白叶枯病和水稻细菌性条斑病具有较好的防控效果，可以替代或减少化学农药使用量，提高食品和生态环境安全，具有良好的开发应用前景。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种高地芽孢杆菌YG045及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1133

<212> DNA

<213> 高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)

<400> 1

gtgctttctc taaagtgaag tcttctccga ttccagtccc tagcgctgta atcattgaac 60

gaacctcgtt gttagataaa attttatcta gtcgggcttt ttcaacgttt aggatcttcc 120

ctcttaacgg taagatcgct tggaaatgtc gatcacgacc ttgcttagca gatccgcccg 180

cagaatctcc ctctacgata taaagctcag agatggaagg atctttagaa gaacagtctg 240

ccagtttccc aggcaagcta gagacttcca gtgcactttt acgtcttgtc agctcacgtg 300

cctttttggc agccattctt gcacgagctg ccatcacacc tttctccaca attttctttg 360

cagcatcagg gttctctaag aggaatttct caagtgcttc ggagaagagg gagtcggtaa 420

tggttcttgc ttctgagtta ccgagctttg tcttcgtttg tccttcaaat tgagggtctg 480

gatgtttgat agagataatg gctgttaagc cttctcgtac atcttctccg ctcaaattcg 540

agtcaccatc tttgaatacg ccatttttac gagcataatc attgatgaca cgcgtcagac 600

cggttttaaa gccagcttcg tgtgatccac cttcatatgt gttgatgtta ttggcgaaag 660

aataaatatt gcttgtatag gaatcgttgt attgcagtgc aacttcaacg gtgattccgt 720

ctttttcacc ctcgatgtaa actggttctt catgaacgac ttccttcgag cgattcaaat 780

gttctacata gctcttaata ccgccttcat agcagtattc gtttcttcgt tctttgcctt 840

cacgtaagtc ttcaatgatg atgttgacgc cttttgttaa gaaagctaac tcacgtacac 900

ggttagcaag tgtgtcgtaa tcaaattcaa tggtttcagt gaaaatttct ggatctggca 960

caaaatgagt ggttgtccct gttacatctg tttcaccgat gatctctaaa tctccaactg 1020

gaacaccgcg tttgaattgt tgataatgaa tttttccatc acggtataca gtcacgtcta 1080

aggtcgtaga taacgcatta acaacagatg cccctacacc atgcagaccg cca 1133