Zmcps基因在制备玉米雄性不育系中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及Zmcps基因在制备玉米雄性不育系中的应用。

背景技术

在实际的粮食生产中，雄性不育现象在玉米、水稻、小麦等高等作物中普遍存在，但大部分玉米不育系并不完全，杂交种中混有大量的自交系种子，使种子质量受到严重影响。而雄性不育系则是保证杂交种纯度、降低种子生产成本的良好材料。

杂种优势利用是玉米高产的主要途径。但是，当玉米中存在有效的和经济的授粉控制方法以保证异花授粉和防止自花授粉时，杂交种才能被利用。授粉控制机制包括机械的、化学的和遗传的方法。

如果植物已空间隔离雄性和雌性的花或者分离雄性和雌性植株，则可以适用杂交种植物生产的机械方法。例如，在玉米植株的顶端花序中具有生产花粉的雄花，雌花在沿着茎的叶轴部。玉米的异交是通过对母本机械去雄以防止自交来确保的。尽管目前去雄被用于植物的杂交种种子生产中，如玉米，但是依据母本去雄的实际去雄成本和产量损失，上述过程是劳动密集型的且是昂贵的。另外，大部分作物植物的功能性雄性和雌性器官均在同一朵花中，因此去雄不是一个简单的过程。尽管可以在散粉前用手除去花粉形成器官，但上述杂交种生产的方法是极端劳动密集型的和昂贵的。

生产杂交植物的化学方法包括使用化学药品杀死或阻止可育花粉的形成。这些化学药品被称为杀配子剂，被用于给予暂时的雄性不育。由于化学药品的费用和有效性、以及应用的持续时长和可靠性，使用杀配子剂进行的杂交植物的商业化生产是受限制的。杀配子剂的一个严重的局限性在于其具有植物毒性的影响，其严重程度取决于基因型。其它局限性包括这些化学药品对于延长花期中的作物不一定是有效的，因为生长的新花可能没有被影响。因此，需要重复应用上述化学药品。

上世纪九十年代，Mariani等人开创了人工制备雄性不育系的新途径，他们利用来自烟草的花药绒毡层的特异启动子(TA29)和核糖核酸酶基因(Barnase)构建表达盒转化烟草和油菜，导致转基因植株的花药绒毡层被破坏，形成雄性不育系，而并影响转基因植株的其它性状。除利用Barnase构建雄性不育系之外，当前很多研究表明其它的功能基因也可被广泛应用于基因工程方法来构建转基因雄性不育植株。

自从Zmcps基因被克隆出来，至今未发现利用转基因技术创制Zmcps雄性不育系的相关报道。因此，提供Zmcps基因在制备玉米雄性不育系中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了Zmcps基因在制备玉米雄性不育系中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种Zmcps基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步，Zmcps基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步，Zmcps基因在制备玉米雄性不育系中的应用。

本发明影响雄性生育力的蛋白质为首次分离自玉米中绒毡层发育调控基因Zmcps，并且能够降解花粉粒中的淀粉，造成玉米转基因花粉不育，准确性高，有效阻止转基因作物通过花粉将转基因元件传播给其他野生作物品种；可用于保持雄性不育植株的纯合隐性状态；同时省去了杂交制种过程中去雄的步骤，减小了劳动力的投入和对产量的影响，具有较大的成本效益。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了Zmcps基因在制备玉米雄性不育系中的应用，本发明影响雄性生育力的蛋白质Zmcps，可以有效实现玉米花粉的完全败育，进而可以用于玉米的雄性化不育制种，提高玉米制种的纯度和降低制种成本，还具有如下有益效果：

(1)首次分离：本发明影响雄性生育力的蛋白质Zmcps为首次分离自玉米品种。

(2)杜绝基因漂移：本发明影响雄性生育力的基因Zmcps来源于玉米，在花粉发育后期，当花粉粒中的淀粉提前被Zmcps降解能够使花粉粒能量来源崩溃，从而花粉发育被遏制，导致转基因花粉不育，有效阻止转基因作物通过花粉将转基因元件传播给其他野生作物品种。

(3)效益好，准确性高：利用本发明影响雄性生育力的基因Zmcps干扰了花粉形成和/或功能，准确性高，可用于保持雄性不育植株的纯合隐性状态；而且省去了杂交制种过程中去雄的步骤，减小了劳动力的投入和对产量的影响，具有较大的成本效益。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明野生型ZmCPS/ZmCPS花粉活力检测结果；

图2附图为本发明转基因后代杂合型ZmCPS/Zmcps花粉活力检测结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1目的片段克隆

1)植物总RNA的提取

(1)用锡纸分别将研钵、镊子、药勺和三角瓶包上，然后放入干热灭菌箱内进行灭菌；

(2)玉米抽穗后2天，分别取50-100mg新鲜玉米雄穗于研钵中，加入适量的液氮充分研磨，然后将粉末放入硅化的1.5mL离心管中；

(3)加入1mL Trizol，颠倒5次，室温放置5min；

(4)加入200μL氯仿，剧烈振荡15s，室温放置5min，4℃，12,000×g离心15min；

(5)吸取上清于一个新的硅化的1.5mL离心管中，加入500μL异丙醇，混匀，室温放置10min，4℃，12,000×g离心15min；

(6)移除上清，加1mL 75％乙醇，洗涤沉淀，4℃，7,500×g离心5min；

(7)移除乙醇，加入无菌操作台内进行RNA沉淀干燥；

(8)加入50μL Rnasefree water溶解RNA；

(9)对所提取的RNA进行检测，-80℃保存。

注意事项：为防止RNA降解，所使用的Tip头，离心管等均用0.1％DEPC处理的水浸泡过夜，然后高压灭菌；研钵、玻璃器皿、药匙180℃干热灭菌12h；所使用的溶液均使用无RNase的0.1％DEPC处理的水配制，操作时需十分小心，勤换手套防止外源RNase的污染。

2)cDNA第一链合成

使用天根cDNA第一链合成试剂盒

(1)按以下组分配制反转录反应液

(2)70℃，5min，迅速冰上放置2min。

(3)在上述PCR管中加入5×First-Strand Buffer4μL，TIANScript M-MLV(200U/μL)1μL，RNase(40U/μL)0.5μL，总体积达到20μL。

(4)42℃，50min；95℃，5min终止反应。

3)PCR扩增全长Zmcps基因

根据MaizeGDB上GRMZM2G081554序列设计Zmcps全长基因引物，具体引物序列如下：

Zmcps-F：5’-CCCCCGGGACGTGCCTGCATTGCGAT-3’；SEQ ID NO.1；

Zmcps-R：5’-CCGAGCTCTGCTTCTGCTACCATTACTCCTTA-3’；SEQ ID NO.2。

依次加入下列反应成分：

按如下程序进行PCR扩增：

94℃预变性5min；40个循环：94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min；72℃终延伸10min，4℃保存。

取5μL扩增产物进行琼脂糖电泳检测。

4)电泳凝胶中PCR产物的回收

按照OMEGA公司的小量胶回收试剂盒回收PCR产物：

(1)在紫外灯下迅速切下含目的DNA的琼脂糖块，放入1.5mL离心管中；

(2)向凝胶中加入200-400μL Binding Buffer(XP2)，58℃水浴10min，使凝胶完全溶化；

(3)将溶解液加入到吸附柱中，12,000×g离心30s，移除液体；

(4)加入300μL Binding Buffer(XP2)，12,000×g离心30s，移除液体；

(5)加入500μL Wash Buffer，静置1min后，12,000×g离心30s，移除液体，12,000×g离心1min，重复一次；

(6)加入30μL ElutionBuffer，静置1min，12,000×g离心1min；

(7)重复一次，将含有回收DNA的离心管贮存于-20℃。

5)Zmcps基因与pGM19-T载体的连接

取4μL胶回收产物1％琼脂糖凝胶电泳检测定量，将回收的目的片断与pMD19-TVector连接，反应体系如下：

6)连接产物的转化

(1)将10μL连接产物加入到50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，轻弹管底混匀，冰浴30min；

(2)42℃水浴热激90s(不要摇动)，迅速在冰上放置2min；

(3)加入500μL LB液体培养基，37℃，150rpm振荡培养1h；

(4)分别取50μL、100μL菌液涂布于含有30μL Amp(50mg/mL)的LB固体平板上，37℃培养箱内倒置培养12-16h；

(5)挑取单菌落于5mL含有50μL Amp(50mg/mL)的液体LB培养基中，37℃，220rpm振荡培养12h。

7)PCR鉴定目的片段

(1)PCR反应体系的制备：

(2)进行PCR扩增：94℃5min；38个循环：94℃30s，56℃30s，72℃1min；72℃终延伸10min；

(3)每个反应取出8μL进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物；

(4)对鉴定出的阳性克隆，取0.5mL菌液加入0.5mL无菌30％甘油至终浓度为15％，-80℃保存菌种，并送交测序公司测序。

经测序，Zmcps基因的核苷酸序列如下：

ATGAAGCTCCTCTCGCCGGCGGCCGCACCGTCGTCCTCGCCGTTGTTCCCTCCTCGCATCGTCGAAGCTGCAGCTCGTCAATCAGGTCCATGCCGTATCCGCATCCGTATCCGTGGCAAAGCAGCAGCAGCAGGAGGAGGAGGAGGCGCGGGCGCGACGGGGCCCCGCGGCAGCCTCAGGCTCGCCGGGTGGTGGAGAGCGCAGCAGCAGGCCCCGGCCACGGCGACGACAACGCAGCAGCCTGACAACGTCTCCAGTGCTAAAGTGTTCCAGACCAGCCGTGTGGAAACCGAGTCCGAAATTGCGAAATGGCCAGGGAAACCACAAGACCTTGAGGATGAGCACCAGGCTGAGGAGGCAGAGCTGCAGCCACTTATCGACCAGGTGAGGGCGATGCTACGGTCGATGAACGACGGGGATACCAGCGCCTCGGCGTACGACACGGCGTGGGTGGCGATGGTGCCGAAGGTGGGCGGCGACGGCGGCGCCCAGCCCCAGTTCCCGGCCACCGTGCGCTGGATCGTGGACCACCAGCTGCCCGACGGCTCCTGGGGCGACTCGGCCCTGTTCTCCGCCTACGACCGCATGATCAACACCCTCGCCTGCGTCGTCGCGCTGACCAAGTGGTCGCTGGAGCCCGCGAGGTGCGAGGCGGGGCTCTCGTTCCTGCACGAGAACATGTGGAGGCTAGCGGAGGAGGAGGCGGAGTCGATGCCCATCGGCTTCGAGATCGCCTTCCCTTCTCTCATCCAGACGGCTAGGGACCTGGGCGTCGTCGACTTCCCGTACGGACACCCGGCGCTGCAGAGCATATACGCCAACAGGGAAGTCAAGCTGAAGCGGATCCCAAGGGACATGATGCACAGGGTCCCGACGTCCATCCTGCACAGCCTTGAAGGGATGCCTGACCTGGACTGGCCGAGGCTTCTGAACCTCCAGTCCTGCGACGGCTCCTTCTTGTTCTCTCCTTCGGCTACCGCTTACGCGCTGATGCAAACCGGTGACAAGAAGTGCTTCGAATACATCGACAGGATTGTCAAAAAATTCAACGGGGGAGTCCCCAATGTTTATCCGGTCGATCTTTTCGAGCACATCTGGGTTGTGGATCGGTTGGAGCGACTCGGGATCTCCCGCTACTTCCAACGAGAGATTGAGCAGTGCATGGACTATGTGAACAGGCACTGGACTGAAGATGGGATTTGCTGGGCTAGGAAATCCAATGTGAAGGATGTGGATGACACAGCTATGGCTTTCCGACTACTAAGGCTACATGGATACAATGTCTCTCCAAGTGTGTTTAAGAACTTTGAGAAAGATGGAGAGTTCTTTTGTTTTGTGGGCCAATCGACTCAAGCCGTCACTGGGATGTATAACCTCAACAGAGCCTCTCAGATAAGTTTTCAAGGAGAGGATGTATTGCATCGTGCTAGGGTTTTCTCGTATGAGTTTCTGAGACAGAGAGAAGAACAAGGCATGATCCGTGATAAATGGATCGTTGCCAAGGATCTACCTGGCGAGGTGCAATATACACTAGACTTCCCTTGGTATGCAAGCTTGCCTCGTGTAGAGGCAAGAACCTATCTAGATCAATATGGTGGTAAAGATGACGTTTGGATTGGAAAGACACTCTACAGGATGCCTCTTGTGAATAACGACACATATCTAGAGTTGGCAATAAGGGATTTCAACCATTGCCAAGCTCTGCATCAGCTTGAGTGTAATGGGCTGCAAACGTGGTACAAGGATAATTGCCTTGACGCTTTTGGAGTAGAACCACAAGATGTTTTAAGATCTTACTTTTTAGCTGCTGCTTGCATTTTTGAACCTAGCCGTGCTGCTGAGCGGCTTGCATGGGCTAGAACGTCAATGATTGCCAATGCCATTTCTACACATCTTCGTGACATTTCGGAAGACAAAAGATTAATTAACTTATTAGCACAAGAAGCATTGCCAATTCATGAAGGACAAAGATTCATACACAGTCTATTGAGTCTTGCATGGACCGAATGGATGTTGCAAAAGGCAAATAAAGAAGAAAACAAATATCACAAATGCAGTGGTATAGAACCACAATACATGGTTCATGATAGGCAAACATACTTACTTTTAGTTCAGGTTATTGAGATTTGTGCTGGACGAATTGGTGAGGCTGTGTCAATGATAAACAACAAGGATAATGATTGGTTTATTCAACTCACATGTGCTACTTGTGACAGTCTTAACCATAGGATGTTACTGTCCCAGGATACTATGAAGAATGAAGCAAGAATAAATTGGATTGAGAAGGAAATCGAGTTGAATATGCAAGAGCTTGCTCAATCTCTCCTTTTGAGATGTGATGAGAAAACTAGCAATAAGAAGACCAAGAAAACCTTATGGGATGTCCTAAGAAGTTTATACTATGCTACTCATTCCCCACAACATATGATCGATAGACATGTTTCCAGAGTTATCTTTGAGCCTGTTTAA；SEQ ID NO.3。

Zmcps基因编码蛋白的氨基酸序列如下：

MKLLSPAAAPSSSPLFPPRIVEAAARQSGPCRIRIRIRGKAAAAGGGGGAGATGPRGSLRLAGWWRAQQQAPATATTTQQPDNVSSAKVFQTSRVETESEIAKWPGKPQDLEDEHQAEEAELQPLIDQVRAMLRSMNDGDTSASAYDTAWVAMVPKVGGDGGAQPQFPATVRWIVDHQLPDGSWGDSALFSAYDRMINTLACVVALTKWSLEPARCEAGLSFLHENMWRLAEEEAESMPIGFEIAFPSLIQTARDLGVVDFPYGHPALQSIYANREVKLKRIPRDMMHRVPTSILHSLEGMPDLDWPRLLNLQSCDGSFLFSPSATAYALMQTGDKKCFEYIDRIVKKFNGGVPNVYPVDLFEHIWVVDRLERLGISRYFQREIEQCMDYVNRHWTEDGICWARKSNVKDVDDTAMAFRLLRLHGYNVSPSVFKNFEKDGEFFCFVGQSTQAVTGMYNLNRASQISFQGEDVLHRARVFSYEFLRQREEQGMIRDKWIVAKDLPGEVQYTLDFPWYASLPRVEARTYLDQYGGKDDVWIGKTLYRMPLVNNDTYLELAIRDFNHCQALHQLECNGLQTWYKDNCLDAFGVEPQDVLRSYFLAAACIFEPSRAAERLAWARTSMIANAISTHLRDISEDKRLINLLAQEALPIHEGQRFIHSLLSLAWTEWMLQKANKEENKYHKCSGIEPQYMVHDRQTYLLLVQVIEICAGRIGEAVSMINNKDNDWFIQLTCATCDSLNHRMLLSQDTMKNEARINWIEKEIELNMQELAQSLLLRCDEKTSNKKTKKTLWDVLRSLYYATHSPQHMIDRHVSRVIFEPV；SEQ IDNO.4。

实施例2构建植物表达载体pCAMBIA3300-35s-Zmcps

1)pMD19-T-Zmcps质粒的提取

小量法提取质粒，方法参照OMEGA质粒小量提取试剂盒：

(1)取适量的过夜培养的目标菌液于1.5mL的离心管中，12,000×g离心1min弃滤液；

(2)加250μL的SolutionI/RNase重悬沉淀；

(3)加250μL的SolutionII，温和并充分的翻转数次，充分裂解菌体；

(4)加350μL的SolutionIII，温和并充分的翻转数次，12,000×g离心10min；

(5)吸取步骤(4)的上清并转移到制备管中，12,000×g离心1min，移除液体；

(6)加500μL的Buffer HB，12,000×g离心1min，移除液体；

(7)加700μL的Wash Buffer，12,000×g离心1min，移除液体，并重复一次；

(8)将制备管放到一个新的1.5mL离心管中，在制备管膜中央加30μL ElutionBuffer室温静置1min，12,000×g离心1min，重复一次，得到pMD19-T-Zmcps质粒。

2)重组质粒和中间载体pCAMBIA3300-35s双酶切鉴定及目标DNA片断的胶回收

质粒的酶切反应体系如下：

将双酶切后的目标DNA片断进行胶回收。

3)植物表达载体与目的Zmcps片段的连接

连接反应体系的确定：根据琼脂糖凝胶电泳条带的亮度，与Marker对比确定大致的回收片断的浓度，估计相对浓度，按插入DNA的目标片段与载体的DNA片段摩尔比为3：1或1：1的比例建立连接体系，22℃温浴5h，16℃温浴过夜，连接产物转化大肠杆菌。

10μL连接体系如下：

4)转化E.coli DH5α感受态细胞和阳性克隆的鉴定

筛选重组子的平板为含有50mg/L Kan的LB固体培养基，37℃培养过夜。挑选在含Kan的培养基上能够正常生长的单菌落，进行菌液PCR，小量提取阳性菌液的质粒。将重组表达质粒pCAMBIA3300-35s-Zmcps进行Xma I和Sac I双酶切鉴定，证明Zmcps基因已经连接到pCAMBIA3300-35s双元植物表达载体上。

实施例3pCAMBIA3300-35s-Zmcps转化农杆菌

1)CaCl

(1)从YEP平板(Rif

(2)取2ml过夜活化的对数生长期的菌液，接种于50mL液体YEP中，20℃培养菌液OD

(3)将菌液转移到冰预冷的50mL无菌离心管中，冰浴30min，4℃，4,000×g离心10min，富集菌体；

(4)用10mL冰预冷0.05M CaCl

(5)用1mL冰预冷0.05M CaCl

2)冻融法转化根癌农杆菌感受态细胞

(1)取出农杆菌感受态(200μL)，置于冰上，待刚解冻时加入质粒DNA(1μg)，放入液氮中1min，而后放入37℃金属浴中5min。

(2)取出离心管，加入1mL YEB液体培养基(不含抗生素)，置于摇床上，28℃，180r/min培养35h。

(3)3000rpm离心1min，取出多余上清液，保留100μL，重悬，倒入YEB平板培养基(含kan，rif抗性)上，涂抹均匀，在恒温培养箱中28℃培养36-48h；

(4)挑取单克隆，检测，保留阳性菌落。菌液PCR鉴定。

实施例4玉米遗传转化

N6盐和维生素、Timentin(蒂门汀)、MS(Murashige and Skoog)盐均购自sigma。

(1)取胚材料为玉米自交系C01，在授粉后第九天开始观察玉米幼胚，待其长到1.5mm左右时，将果穗取回实验室进行取胚工作。

(2)准备农杆菌侵染液，经过活化的农杆菌在YEB液体培养基中摇菌至特定浓度时(OD

(3)将(1)中取出的幼胚用inf+AS(同上)液体培养基洗涤2次，然后加入农杆菌侵染液，侵染20min-30min。

(4)将侵染过后的幼胚转移到共培养培养基(每升组成：N6盐和维生素4克，蔗糖40克，葡萄糖30克，L-proline 0.7克，MES 0.5g，1mg/ml 2,4-d 1.5ml，琼脂糖(低EEO)5g，8.5mg/ml硝酸银0.1ml，100mg/ml L-半胱氨酸0.4g，0.5M/L DTT 0.154g)中，幼胚的盾片朝上，胚轴与培养基表面接触，用封口膜封住培养皿，在20℃培养箱中暗培养3天。

(5)把幼胚从共培养培养基转移到静息培养基(每升组成：N6盐和维生素4克，蔗糖40克，葡萄糖30克，L-proline 0.7克，MES 0.5g，1mg/ml 2,4-d 1.5ml，8.5mg/ml硝酸银0.1ml，100mg/ml L-半胱氨酸0.4g，0.5M/L DTT0.154g，Timentin 100mg)中，用封口膜封住培养皿，放在28℃条件下暗培养7天。

(6)再将所有的幼胚转移到选择培养基Ⅰ(每升组成：N6盐和维生素4克，蔗糖40克，葡萄糖30克，L-proline 0.7克，MES 0.5g，1mg/ml 2,4-d 1.5ml，8.5mg/ml硝酸银0.1ml，100mg/ml L-半胱氨酸0.4g，0.5M/L DTT 0.154g，Tim 100mg，3mg/ml Bialaphos 0.5ml)上，28℃暗培养两周。

(7)将所有的幼胚转移到选择培养基Ⅱ(每升组成：N6盐和维生素4克，蔗糖40克，葡萄糖30克，L-proline 0.7克，MES 0.5g，1mg/ml 2,4-d 1.5ml，8.5mg/ml硝酸银0.1ml，100mg/ml L-半胱氨酸0.4g，0.5M/L DTT 0.154g，Tim 100mg，3mg/ml Bialaphos 1ml)上，此时可以进行挑选，挑选颜色鲜艳的幼胚28℃暗培养两周。

(8)经过两次选择之后，开始进行再生，在再生培养基I(每升组成：MS(Murashigeand Skoog)盐4.3g，蔗糖60g，凝胶2.5克，2mg/ml甘氨酸1毫升，Tim 100mg)中进行发芽生根，待见到明显叶片及根生长出来时转移到再生培养基Ⅱ(每升组成：MS salts 2.9g，蔗糖30g，凝胶2.5g，2mg/ml甘氨酸1ml，Tim 100mg)上。从此步骤开始，进行光照培养。

(9)待再生苗长出3-4片叶时，将其转移至温室，并进行检查，阳性植株保留，缓苗2-3天后转移到土中，而后进行正常的玉米生长管理，开花后1-2天取花粉进行花粉活力检测，结果见图1-2。

玉米花粉测定方法(碘-碘化钾法)：

(1)田间取样：采用套袋的方法，自雄穗散粉开始，每天上午9：00时定时采集花粉，混合均匀后，一部分冷藏于冰壶中，5分钟内迅速带回室内进行鉴定。

(2)花粉活力的室内测定

配制碘-碘化钾溶液：将1.3g碘化钾溶解在水中，再加入0.3g碘结晶，然后定容到100mL；

取少量花粉置于干净的载玻片上，滴上2滴碘-碘化钾溶液，置于30℃恒温箱中20-30分钟后，显微镜下观察，统计同一视野内可育花粉和败育花粉的数目，并进行遗传分析。

野生型ZmCPS/ZmCPS，开花期花粉活力检测结果见图1；结果表明，野生型花粉全部可育。

杂合型ZmCPS/Zmcps，开花期花粉活力检测结果见图2；结果表明，杂合型花粉50％可育，50％不育，表明Zmcps突变型控制玉米花粉育性。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 吉林省农业科学院

<120> Zmcps基因在制备玉米雄性不育系中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

cccccgggac gtgcctgcat tgcgat 26

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ccgagctctg cttctgctac cattactcct ta 32

<210> 3

<211> 2469

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

atgaagctcc tctcgccggc ggccgcaccg tcgtcctcgc cgttgttccc tcctcgcatc 60

gtcgaagctg cagctcgtca atcaggtcca tgccgtatcc gcatccgtat ccgtggcaaa 120

gcagcagcag caggaggagg aggaggcgcg ggcgcgacgg ggccccgcgg cagcctcagg 180

ctcgccgggt ggtggagagc gcagcagcag gccccggcca cggcgacgac aacgcagcag 240

cctgacaacg tctccagtgc taaagtgttc cagaccagcc gtgtggaaac cgagtccgaa 300

attgcgaaat ggccagggaa accacaagac cttgaggatg agcaccaggc tgaggaggca 360

gagctgcagc cacttatcga ccaggtgagg gcgatgctac ggtcgatgaa cgacggggat 420

accagcgcct cggcgtacga cacggcgtgg gtggcgatgg tgccgaaggt gggcggcgac 480

ggcggcgccc agccccagtt cccggccacc gtgcgctgga tcgtggacca ccagctgccc 540

gacggctcct ggggcgactc ggccctgttc tccgcctacg accgcatgat caacaccctc 600

gcctgcgtcg tcgcgctgac caagtggtcg ctggagcccg cgaggtgcga ggcggggctc 660

tcgttcctgc acgagaacat gtggaggcta gcggaggagg aggcggagtc gatgcccatc 720

ggcttcgaga tcgccttccc ttctctcatc cagacggcta gggacctggg cgtcgtcgac 780

ttcccgtacg gacacccggc gctgcagagc atatacgcca acagggaagt caagctgaag 840

cggatcccaa gggacatgat gcacagggtc ccgacgtcca tcctgcacag ccttgaaggg 900

atgcctgacc tggactggcc gaggcttctg aacctccagt cctgcgacgg ctccttcttg 960

ttctctcctt cggctaccgc ttacgcgctg atgcaaaccg gtgacaagaa gtgcttcgaa 1020

tacatcgaca ggattgtcaa aaaattcaac gggggagtcc ccaatgttta tccggtcgat 1080

cttttcgagc acatctgggt tgtggatcgg ttggagcgac tcgggatctc ccgctacttc 1140

caacgagaga ttgagcagtg catggactat gtgaacaggc actggactga agatgggatt 1200

tgctgggcta ggaaatccaa tgtgaaggat gtggatgaca cagctatggc tttccgacta 1260

ctaaggctac atggatacaa tgtctctcca agtgtgttta agaactttga gaaagatgga 1320

gagttctttt gttttgtggg ccaatcgact caagccgtca ctgggatgta taacctcaac 1380

agagcctctc agataagttt tcaaggagag gatgtattgc atcgtgctag ggttttctcg 1440

tatgagtttc tgagacagag agaagaacaa ggcatgatcc gtgataaatg gatcgttgcc 1500

aaggatctac ctggcgaggt gcaatataca ctagacttcc cttggtatgc aagcttgcct 1560

cgtgtagagg caagaaccta tctagatcaa tatggtggta aagatgacgt ttggattgga 1620

aagacactct acaggatgcc tcttgtgaat aacgacacat atctagagtt ggcaataagg 1680

gatttcaacc attgccaagc tctgcatcag cttgagtgta atgggctgca aacgtggtac 1740

aaggataatt gccttgacgc ttttggagta gaaccacaag atgttttaag atcttacttt 1800

ttagctgctg cttgcatttt tgaacctagc cgtgctgctg agcggcttgc atgggctaga 1860

acgtcaatga ttgccaatgc catttctaca catcttcgtg acatttcgga agacaaaaga 1920

ttaattaact tattagcaca agaagcattg ccaattcatg aaggacaaag attcatacac 1980

agtctattga gtcttgcatg gaccgaatgg atgttgcaaa aggcaaataa agaagaaaac 2040

aaatatcaca aatgcagtgg tatagaacca caatacatgg ttcatgatag gcaaacatac 2100

ttacttttag ttcaggttat tgagatttgt gctggacgaa ttggtgaggc tgtgtcaatg 2160

ataaacaaca aggataatga ttggtttatt caactcacat gtgctacttg tgacagtctt 2220

aaccatagga tgttactgtc ccaggatact atgaagaatg aagcaagaat aaattggatt 2280

gagaaggaaa tcgagttgaa tatgcaagag cttgctcaat ctctcctttt gagatgtgat 2340

gagaaaacta gcaataagaa gaccaagaaa accttatggg atgtcctaag aagtttatac 2400

tatgctactc attccccaca acatatgatc gatagacatg tttccagagt tatctttgag 2460

cctgtttaa 2469

<210> 4

<211> 822

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 4

Met Lys Leu Leu Ser Pro Ala Ala Ala Pro Ser Ser Ser Pro Leu Phe

1 5 10 15

Pro Pro Arg Ile Val Glu Ala Ala Ala Arg Gln Ser Gly Pro Cys Arg

20 25 30

Ile Arg Ile Arg Ile Arg Gly Lys Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly

35 40 45

Gly Ala Gly Ala Thr Gly Pro Arg Gly Ser Leu Arg Leu Ala Gly Trp

50 55 60

Trp Arg Ala Gln Gln Gln Ala Pro Ala Thr Ala Thr Thr Thr Gln Gln

65 70 75 80

Pro Asp Asn Val Ser Ser Ala Lys Val Phe Gln Thr Ser Arg Val Glu

85 90 95

Thr Glu Ser Glu Ile Ala Lys Trp Pro Gly Lys Pro Gln Asp Leu Glu

100 105 110

Asp Glu His Gln Ala Glu Glu Ala Glu Leu Gln Pro Leu Ile Asp Gln

115 120 125

Val Arg Ala Met Leu Arg Ser Met Asn Asp Gly Asp Thr Ser Ala Ser

130 135 140

Ala Tyr Asp Thr Ala Trp Val Ala Met Val Pro Lys Val Gly Gly Asp

145 150 155 160

Gly Gly Ala Gln Pro Gln Phe Pro Ala Thr Val Arg Trp Ile Val Asp

165 170 175

His Gln Leu Pro Asp Gly Ser Trp Gly Asp Ser Ala Leu Phe Ser Ala

180 185 190

Tyr Asp Arg Met Ile Asn Thr Leu Ala Cys Val Val Ala Leu Thr Lys

195 200 205

Trp Ser Leu Glu Pro Ala Arg Cys Glu Ala Gly Leu Ser Phe Leu His

210 215 220

Glu Asn Met Trp Arg Leu Ala Glu Glu Glu Ala Glu Ser Met Pro Ile

225 230 235 240

Gly Phe Glu Ile Ala Phe Pro Ser Leu Ile Gln Thr Ala Arg Asp Leu

245 250 255

Gly Val Val Asp Phe Pro Tyr Gly His Pro Ala Leu Gln Ser Ile Tyr

260 265 270

Ala Asn Arg Glu Val Lys Leu Lys Arg Ile Pro Arg Asp Met Met His

275 280 285

Arg Val Pro Thr Ser Ile Leu His Ser Leu Glu Gly Met Pro Asp Leu

290 295 300

Asp Trp Pro Arg Leu Leu Asn Leu Gln Ser Cys Asp Gly Ser Phe Leu

305 310 315 320

Phe Ser Pro Ser Ala Thr Ala Tyr Ala Leu Met Gln Thr Gly Asp Lys

325 330 335

Lys Cys Phe Glu Tyr Ile Asp Arg Ile Val Lys Lys Phe Asn Gly Gly

340 345 350

Val Pro Asn Val Tyr Pro Val Asp Leu Phe Glu His Ile Trp Val Val

355 360 365

Asp Arg Leu Glu Arg Leu Gly Ile Ser Arg Tyr Phe Gln Arg Glu Ile

370 375 380

Glu Gln Cys Met Asp Tyr Val Asn Arg His Trp Thr Glu Asp Gly Ile

385 390 395 400

Cys Trp Ala Arg Lys Ser Asn Val Lys Asp Val Asp Asp Thr Ala Met

405 410 415

Ala Phe Arg Leu Leu Arg Leu His Gly Tyr Asn Val Ser Pro Ser Val

420 425 430

Phe Lys Asn Phe Glu Lys Asp Gly Glu Phe Phe Cys Phe Val Gly Gln

435 440 445

Ser Thr Gln Ala Val Thr Gly Met Tyr Asn Leu Asn Arg Ala Ser Gln

450 455 460

Ile Ser Phe Gln Gly Glu Asp Val Leu His Arg Ala Arg Val Phe Ser

465 470 475 480

Tyr Glu Phe Leu Arg Gln Arg Glu Glu Gln Gly Met Ile Arg Asp Lys

485 490 495

Trp Ile Val Ala Lys Asp Leu Pro Gly Glu Val Gln Tyr Thr Leu Asp

500 505 510

Phe Pro Trp Tyr Ala Ser Leu Pro Arg Val Glu Ala Arg Thr Tyr Leu

515 520 525

Asp Gln Tyr Gly Gly Lys Asp Asp Val Trp Ile Gly Lys Thr Leu Tyr

530 535 540

Arg Met Pro Leu Val Asn Asn Asp Thr Tyr Leu Glu Leu Ala Ile Arg

545 550 555 560

Asp Phe Asn His Cys Gln Ala Leu His Gln Leu Glu Cys Asn Gly Leu

565 570 575

Gln Thr Trp Tyr Lys Asp Asn Cys Leu Asp Ala Phe Gly Val Glu Pro

580 585 590

Gln Asp Val Leu Arg Ser Tyr Phe Leu Ala Ala Ala Cys Ile Phe Glu

595 600 605

Pro Ser Arg Ala Ala Glu Arg Leu Ala Trp Ala Arg Thr Ser Met Ile

610 615 620

Ala Asn Ala Ile Ser Thr His Leu Arg Asp Ile Ser Glu Asp Lys Arg

625 630 635 640

Leu Ile Asn Leu Leu Ala Gln Glu Ala Leu Pro Ile His Glu Gly Gln

645 650 655

Arg Phe Ile His Ser Leu Leu Ser Leu Ala Trp Thr Glu Trp Met Leu

660 665 670

Gln Lys Ala Asn Lys Glu Glu Asn Lys Tyr His Lys Cys Ser Gly Ile

675 680 685

Glu Pro Gln Tyr Met Val His Asp Arg Gln Thr Tyr Leu Leu Leu Val

690 695 700

Gln Val Ile Glu Ile Cys Ala Gly Arg Ile Gly Glu Ala Val Ser Met

705 710 715 720

Ile Asn Asn Lys Asp Asn Asp Trp Phe Ile Gln Leu Thr Cys Ala Thr

725 730 735

Cys Asp Ser Leu Asn His Arg Met Leu Leu Ser Gln Asp Thr Met Lys

740 745 750

Asn Glu Ala Arg Ile Asn Trp Ile Glu Lys Glu Ile Glu Leu Asn Met

755 760 765

Gln Glu Leu Ala Gln Ser Leu Leu Leu Arg Cys Asp Glu Lys Thr Ser

770 775 780

Asn Lys Lys Thr Lys Lys Thr Leu Trp Asp Val Leu Arg Ser Leu Tyr

785 790 795 800

Tyr Ala Thr His Ser Pro Gln His Met Ile Asp Arg His Val Ser Arg

805 810 815

Val Ile Phe Glu Pro Val

820