一种乌鳢源金属硫蛋白基因、检测引物、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及水生动物质量安全检测技术领域，特别涉及一种乌鳢源金属硫蛋白基因、检测引物、试剂盒及检测方法。

背景技术

乌鳢（Ophiocephalus argus）属鲈形目攀鲈亚目醴科醴属，俗称黑鱼、乌鱼等，属肉食性鱼类，是目前我国淡水池塘养殖的主要鱼类品种之一。作为一种底栖鱼类，乌鳢处于水生食物链的上层，易通过呼吸、体表接触及摄食等方式富集环境中的重金属，研究发现其体内重金属含量显著高于其他养殖品种，可能存在一定的食用安全风险。因此，了解评估重金属对乌鳢等水生生动物的毒性效应并探求对其有效的解毒机制就显得尤为重要。

金属硫蛋白（Metallothioneins，MT）是一类分子质量为6-7kDa，富含半胱氨酸（约含30%）的可诱导的多功能蛋白。MT在生物体内对缓解重金属的毒性，参与微量元素的储存、运输，以及增强机体免疫与应激能力、清除自由基等方面担负着重要的生理功能。其中金属可诱导性是MT参与重金属解毒的基础，其丰富的巯基（-SH）可强力螯合有毒重金属离子并将其排出体外从而终止对机体的毒害，且MT对Hg、Cd、Cu、Zn均具有解毒能力。金属亲和分析法、电化学法、免疫法、色谱法等是目前较为成熟的金属硫蛋白检测技术，然而上述技术在实际检测工作中，存在以下问题：一是精密度、检出限不能满足要求；二是操作繁琐、费时；三是仪器设备昂贵，基层难以推广；四是放射性同位素的使用可能会影响操作人员的身体健康。

研究显示，MT在转录水平上易被环境中的重金属所诱导，且这种诱导与重金属浓度具有相关性，金属硫蛋白作为监测水环境重金属污染的一个重要标志物，已经得到广泛关注随着分子生物学等新兴技术手段在环境领域的应用。因此可以通过实时荧光定量PCR技术检测MT，从而指示环境中重金属污染物水平。特异性引物该技术的关键，目前已经筛选到多种鱼类的MT特异性引物,这为水生动物的重金属毒性效应及解毒机制研究提供了技术支撑。但是乌鳢的金属硫蛋白基因，特异性检测引物均未报道过，亟需建立基于乌鳢金属硫蛋白的评估体系。

发明内容

本发明的目的在于提供一种乌鳢源金属硫蛋白基因、检测引物、试剂盒及检测方法，引物具有特异性强、重复性好的特点，可用于定性定量分析乌鳢源MT基因的表达量，进而评估乌鳢体内重金属的含量。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种乌鳢源金属硫蛋白基因，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。发明人经过长期探索研究，发现了金属硫蛋白编码基因，并对其进行测序和报道，该基因属于功能性基因，可用于评估乌鳢体内重金属含量。

本发明采用随机扩增筛选技术获得乌鳢MT基因片段，依据所获得基因序列完成乌鳢MT基因特异性引物的设计和筛选，在此基础上利用实时荧光定量PCR技术分析乌鳢不同组织中MT的表达水平。本发明设计的引物具有良好的特异性和重复性，利用上述引物进行实时荧光定量PCR法检测乌鳢源MT操作简便、耗时少（仅一个多小时）、特异性高、易于判断等优点， MT基因的表达量直接反应了MT在乌鳢体内的含量，而MT含量与乌鳢体内重金属含量呈正相关，这样就能为快速准确定量乌鳢体内重金属含量的研究提供新的途径。

一种用于检测乌鳢源金属硫蛋白基因的引物，所述引物包括：

正向引物W1MT-F：5’-GGATGTGATGAATCTAATCTGCC-3’，

反向引物W1MT-R：5’-GCTTTAAATAAGTTTGTTTGTGCTG-3’。

该引物具有特异性强，重复性好的特点，可用于定性定量分析乌鳢源MT基因的表达量，进而评估乌鳢体内重金属的含量，该方法克服现有检测方法在水产动物质量安全监测中无法直接应用的问题，适合乌鳢中金属硫蛋白检测，对于重金属在鱼体内的沉积量可以定量评估。

一种用于检测乌鳢源金属硫蛋白基因的试剂盒，包括扩增体系，所述扩增体系包括10×PCR buffer、2.5mM的dNTP、5 U/μl rTaq酶及10μM的引物。

25μl扩增体系组成为：10×PCR buffer 2.5μl，2.5mM的dNTP 2μL，5 U/μl rTaq酶0.25μl，10μM的引物各0.25μL，模板DNA 1-3μL，灭菌双蒸水补至25μL。

所述引物包括：

正向引物W1MT-F：5’-GGATGTGATGAATCTAATCTGCC-3’，

反向引物W1MT-R：5’-GCTTTAAATAAGTTTGTTTGTGCTG-3’。

一种乌鳢源金属硫蛋白基因的定量检测方法，包括如下步骤：

（1）DNA提取：取25～50mg的鱼肌肉或肝脏，加入50～100μL组织裂解液匀浆混合，56℃温育30～60min，95℃变性5min，8000rpm 离心1min，取离心上清液作为模板DNA；

（2）荧光定量PCR：反应体系如下：10μL SYBR，10μM 引物各1μl，1×ROX 0.2μl，模板DNA 1μl，用无菌水补至20μl；

（3）结果判断：仪器自动收集荧光信号，并自动制作熔解曲线，计算△CT值，在Excel中产生柱状图，分析乌鳢中金属硫蛋白基因的表达量。

扩增条件为：94℃预变性1min , 94℃ 20s, 58℃ 30s, 72℃ 15s, 进行40个循环。

本发明的有益效果是：采用本发明的试剂盒和检测方法首次用于检测乌鳢金属硫蛋白基因，同时检测过程所需时间短、特异性强、灵敏度高。本发明避免了无法采用分子方法来分析评估乌鳢组织中的重金属含量，常规测量乌鳢组织中的重金属高低，方法存在操作繁琐、耗时长等缺点。因此，本发明所涉及的利用乌鳢组织中的金属硫蛋白基因表达量来评估乌鳢养殖过程中受到有害重金属污染情况，具有较好的独创性和实用性。同时，本发明检测靶点具有单一特异性，检测结果特异，易于判定。

附图说明

图1为PCR方法扩增乌鳢金属硫蛋白基因的特异性试验。M：DL2000 DNA Marker(TaKaRa公司)；泳道1：草鱼；泳道2：鲢鱼；泳道3：青鱼；泳道4：鲫鱼；泳道5：对虾；泳道6：罗氏沼虾；泳道7-12：乌鳢。

图2为养殖周期中乌鳢肝脏组织中金属硫蛋白基因荧光定量实验结果图。

图3为养殖周期中乌鳢肝脏组织中重金属汞的含量。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

根据乌鳢金属硫蛋白MT基因特异性序列，利用软件Primer primer5设计4对特异性引物，经过多次筛选分析，最终获得引物具体为：

正向引物W1MT-F：5’-GGATGTGATGAATCTAATCTGCC-3’ （SEQ ID No.2）

反向引物W1MT-R：5’-GCTTTAAATAAGTTTGTTTGTGCTG-3’ （SEQ ID No.3）。

该特异性引物具有无非特异扩增、无二聚体等特征。

实施例1

乌鳢金属硫蛋白基因定性分析：

取25～50mg的鱼肌肉或肝脏，加入50～100μL组织裂解液（50～800mM Tris-HClpH8.0～8.3, 20mM EDTA，pH7.0～8.0,40～80μg/mL蛋白酶K，0.5%～1.5% SDS）匀浆混合，56℃温育30～60min，95℃变性5min，8000rpm 离心1min。。PCR检测体系为：25μl反应体系具体为，10×PCR buffer 2.5μl，2.5mM的dNTP 2μL，5 U/μl rTaq酶0.25μl，10μM引物各0.25μL，模板DNA1-3μL，最后用灭菌双蒸水补至25μL；PCR检测反应程序为：94℃预变性5min；94℃30s, 58℃ 30s, 72℃ 30s,循环35次；72℃ 10 min；反应结束12℃保存。

取5~8μl PCR扩增产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测，判断样品中金属硫蛋白基因的表达情况；所述判断具体为：凝胶电泳检测扩增产物，紫外灯照射下观察电泳结果，如果出现265 bp的单一扩增条带，则说样品中含有金属硫蛋白基因（图1）；反之，则样品中不含。图1的结果表明本发明特异性引物的特异性好。扩增的目的基因序列为：

GGATGTGATGAATCTAATCTGCCTTGTATATTTCTGTTTAGCTGGAACCTGCAACTGCGGTGAATCCTGTACCTGCACAAAGTGCTCCTGCACCACCTGCAAGAAAAGTAAGTTAAATGTATATATTTTTTTTTCAACCATAGCACGTCCAAGGCCATTTATTAACGACATTAATCTAGTCTAAGTTAACTTGGTTTTAGTACATCGTATATTTTAATATCATTTTTGATTTAACTTGGACAGCACAAACAAACTTATTTAAAGC（SEQ ID No.1）。

实施例2（实时荧光定量分析）：

1、材料

乌鳢样品采集自浙江省嘉兴市某乌鳢养殖场；所用引物与探针由上海生工生物公司合成；荧光定量PCR试剂购自TaKaRa公司；其他试剂购自sigma公司。

2、乌鳢样品DNA的提取：

（1）分别取50 mg的乌鳢组织（肌肉、肝脏、肾脏），加入100μl组织裂解液（50～800mM Tris-HCl pH8.0～8.3, 20mM EDTA，pH7.0～8.0,40～80μg/mL蛋白酶K，0.5%～1.5%SDS）匀浆混合，56℃孵育60 min，95℃变性5 min，8000rpm 离心1 min。

（2）取20μl离心上清进行10

3、乌鳢金属硫蛋白MT基因的荧光定量扩增：

（1）根据待检样品数，配制相应倍数的核酸检测反应液（10μl SYBR，10μM 引物W1MT-F/R各1μl，1×ROX 0.2μl，其余为无菌双蒸水），每管检测预反应液体积为19μL；

（2）分别吸取1μl不同待检样品DNA加入核酸检测反应管中，混合均匀；

（3）标记清楚后，将检测反应管置于荧光定量PCR仪中，反应条件：94℃预变性1min, 94℃ 20s, 58℃ 30s, 72℃ 15s, 进行40个循环。

4、结果分析：根据仪器自动收集的荧光信号，自动制作熔解曲线，根据CT值计算△CT值，在Excel中产生柱状图，分析乌鳢中MT的具体表达量，结果如图2所示。

利用本发明所述的特异性引物和检测方法检测乌鳢金属硫蛋白基因，经过实时荧光定量PCR检测，由图2可见表达水平存在差异性；该结果与同一时期样品中重金属汞的含量变化趋势（图3）基本吻合。这表明本检测方法具有较好的特异性和灵敏度，可以一定程度上反应鱼体中重金属的含量变化。根据以上实验结果表明，乌鳢金属硫蛋白基因特异性引物和检测方法可以为乌鳢养殖过程中的重金属携带量提供快速、简便、灵敏的检测评估。

本发明的乌鳢源金属硫蛋白基因（SEQ ID No.1）经NCBI BLAST比对，同源性分析结果表明无显著性相似序列存在。

本发明检测方法具有简便快速、特异性好、灵敏度高的特点，而且可用于研究分析乌鳢中重金属含量与金属硫蛋白之间的关系，有利于养殖中水产品重金属含量的诊断与预防。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江省淡水水产研究所

<120> 一种乌鳢源金属硫蛋白基因、检测引物、试剂盒及检测方法

<130> 2021.02

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 265

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

ggatgtgatg aatctaatct gccttgtata tttctgttta gctggaacct gcaactgcgg 60

tgaatcctgt acctgcacaa agtgctcctg caccacctgc aagaaaagta agttaaatgt 120

atatattttt ttttcaacca tagcacgtcc aaggccattt attaacgaca ttaatctagt 180

ctaagttaac ttggttttag tacatcgtat attttaatat catttttgat ttaacttgga 240

cagcacaaac aaacttattt aaagc 265

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

ggatgtgatg aatctaatct gcc 23

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

gctttaaata agtttgtttg tgctg 25