加州鲈蛙虹彩病毒疾病的防控方法

技术领域

本发明涉及水生动物疾病防控技术，主要是针对加州鲈蛙虹彩病毒疾病精准防控的整体解决技术方案。

背景技术

加州鲈是我国名优淡水养殖品种。随着加州鲈人工繁殖和育苗技术的成功，加州鲈养殖业得到较快发展，与此同时病害问题也日益严重。加州鲈病害主要有病毒病、细菌病和寄生虫病。其中，病毒病流行快、发病率高，并且目前尚无有效控制措施，严重影响加州鲈养殖业的发展。近年来，养殖加州鲈发生大面积的暴发性流行病，导致加州鲈大量死亡，造成严重的损失。目前加州鲈鱼的养殖产量较大，主要养殖区均有发病，夏季高发，发病时水温为 25～30℃，危害成鱼，致死率高，给加州鲈鱼养殖业造成了重大的经济损失，严重威胁该产业的健康发展。其中蛙虹彩病毒(Largemouth bass ranavirus)对加州鲈鱼养殖影响较严重。加州鲈鱼感染该病毒后，通常症状不明显，或体表有出血、眼球突出或者肝上有明显凝血。如何预防和治疗加州鲈鱼虹彩病毒病已成为当今加州鲈鱼养殖业急需解决的重要问题。

目前对于加州鲈病毒病还未有特效的治疗方法，推行加州鲈的健康养殖是最有效的预防措施，而这主要依赖于早期的快速检测。水生动物不同疾病表现的症状可能很相似，且疾病发生早期很难观察到症状，大多凭经验或者病原检测难以准确预测疾病发生。传统水产疾病检测时间长、检测指标少、信息传递不及时等现状，检测水平和手段参差不齐，检测方法和结果不稳定，限制了水产疫病的快速、准确的检测，导致病情处理延误，造成重大经济损失。目前对于加州鲈病毒的检测方法主要包括传统组织学方法、电子显微技术、生物指示法、生化检测法、免疫学方法(主要有荧光抗体技术、酶联免疫吸附实验(ELISA)、免疫电镜技术、细胞培养方法、分子生物学方法(主要有分子杂交方法、聚合酶链式反应(PCR))等。这些检测方法有些对技术条件要求高，检测时间长，有些所需要的材料制备麻烦，费用高，有些方法灵敏度不高，特异性不强，因此广大养殖户掌握关键的技术难度很大，难以推广，限制了这些技术的应用和发展。

水产疾病具有易于传染、流行速度快等特点，其病原微生物种类多样、更新变异快。传统检测方法如镜检、涂板等，由于其技术限制无法对病原进行快速诊断和定量检测，已无法满足现阶段水产病原的检测需求。目前市场上出现的快速检测技术LAMP法，由于假阳性率高，引物设计困难等问题，无法对现有疾病进行准确而全面的检测。通过查阅了大量有关分子检测的相关文献、专利和标准等，对普通PCR、RAA、LAMP和qPCR等检测方法的原理、反应时间、检测方式、操作性等做了比对分析和归纳，确定qPCR是最适于基层养殖场水产重要疫病快速精准诊断的检测方法。荧光定量PCR检测仪操作简单，检测快速，仪器触屏操作，人机界面友善，可同时完成多种病原检测。检测仪器移动便携，野外操作，配套箱体运输方便，整机检测前无需校正。检测试剂开发和定制服务，后续耗材成本较低，可根据用户需求自主开发。

当前水产动物包括加州鲈疾病防控技术较多只满足于检测到和检测出相关的病原，严重缺乏相应防治措施一系列的全面技术，急需建立“定量快速检测+中药技术干预(或微生态干预)”精准防控疾病的整体解决技术方案。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中的上述不足，提供一种加州鲈蛙虹彩病毒疾病精准防控的整体解决技术方案。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

加州鲈蛙虹彩病毒疾病精准防控的整体解决技术方案，步骤如下：

1.病毒DNA/RNA提取；

2.荧光定量快速检测；

3.现代中药技术和微生态技术干预。

其中，步骤1病毒DNA/RNA提取优选如下操作方法：：

(1)转移1mL溶解液至装有100μL或100mg样品的离心管中。充分涡旋以溶解混匀样品。

(2)10,000rpm离心3分钟，转移200μL上清液至新的离心管中，加入15μL磁珠混合液及400μL裂解液，涡旋30秒混匀，静置3分钟，混匀后上磁力架，静置聚集磁珠后，弃上清。

(3)将离心管从磁力架取下，加入500μL洗涤液1，涡旋10秒。

(4)将离心管放置于磁力架静置30秒，磁珠完全吸附后，小心吸弃液体。

(5)将离心管从磁力架取下，加入500μL洗涤液2，涡旋10秒。

(6)将离心管放置于磁力架静置30秒，磁珠完全吸附后，小心吸弃液体。

(7)短暂离心，将离心管放置于磁力架上静置10秒，吸尽残液。

(8)将离心管放于磁力架上，打开盖子，室温晾干5分钟。

(9)将离心管取下，加入100μL洗脱液，涡旋10秒。

(10)将离心管放于磁力架上，静置吸磁2分钟，转移洗脱液至新的离心管保存于 -20℃。

步骤2荧光定量快速检测优选如下操作方法：

(1)将检测试剂盒拿出充分解冻后，分别向PCR反应管中加入PCR反应液23μL。

(2)然后再分别加入2μL待检样品DNA/RNA提取液，剩下两个PCR反应管分别加入2μL阴性对照和阳性对照，

(3)最后分别向反应管加入20μL矿物油。

(4)短暂离心后放入荧光定量PCR仪中，按照检测试剂盒要求设置运行反应程序：

55℃运行1个循环5min，95℃运行1个循环30s，

95℃运行5s和60℃运行20s共运行40个循环，最后荧光收集。

(5)运行反应结束后，点击数据分析，根据最后扩增曲线循环值来判断检测样品是否携带病害基因以及携带量的多少。

步骤3现代中药技术和微生态技术干预优选如下操作方法：

加州鲈蛙虹彩病毒处理方案：

针对养殖过程中，如经过荧光定量PCR检测养殖加州鲈鱼发现携带蛙虹彩病毒并导致鲈鱼出现大量死亡时，可以如下方式来处理治疗。

首先停止投喂饲料。

第1、2天，用“善泽一号500mL/亩十本草神露1000mL/亩”，连泼两天；(此过程主要是提高加州鲈鱼抗应激能力和免疫能力)

第3、4天，用“善毒清2号40g/亩”，连泼两天。(此过程主要是对加州鲈鱼携带蛙虹彩病毒进行针对处理，降低加州鲈鱼携带病毒含量。)

第5、6天，用″聚维酮碘溶液(水产用)330mL/亩+本草神露1000mL/亩，连续泼两天。(此过程主要是进一步对加州鲈蛙虹彩病毒进行处理，降低蛙虹彩病毒含量，增强加州鲈鱼免疫力，从而增加针对蛙虹彩病毒的抗体，降低死亡量。)

上述方式处理治疗加州鲈蛙虹彩病毒后，死鱼数量会得到大大降低，甚至降低为零死亡。

步骤4在于步骤(1)、(2)、(3)首次提出了基于“定量快速检测+中药技术干预(或微生态干预)”精准防控加州鲈蛙虹彩病毒病疾病的整体解决技术方案。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的方法采用磁珠法病毒DNA/RNA核酸提取试剂盒(LBT-VDEK)，利用16孔荧光定量PCR仪(LBT-16QPCR)及其配套设备，采用PCR-荧光探针技术，对加州鲈蛙虹彩病毒的特异性DNA核酸片段进行定量检测，简便快速，特异性好，灵敏度高；采用现代中药技术和微生态技术，针对检测出携带蛙虹彩病毒的加州鲈进行防治，可有效降低死亡率，达到精准防控，全面、系统、整体解决加州鲈蛙虹彩病毒疾病，具有十分广阔的应用前景，有很高的实用价值。

附表、附图说明

表1荧光定量PCR检测加州鲈蛙虹彩病毒循环出峰值对应定量数值表

图1荧光定量PCR检测加州鲈蛙虹彩病毒循环出峰值图

具体实施方式

实施例1

2020年12月9日，中山某养殖户养殖20天左右的加州鲈鱼出现死亡，每天死亡数量400 条左右，后经荧光定量PCR检测出是由于蛙虹彩病毒导致的死亡，按照下面治疗方案处理：首先停止投喂饲料。

第1、2天，用“善泽一号500mL/亩十本草神露1000mL/亩”，连泼两天；

第3、4天，用“善毒清2号40g/亩”，连泼两天。

第5、6天，用″聚维酮碘溶液(水产用)330mL/亩+本草神露1000mL/亩，连续泼两天。客户反馈：用药后6天内的死亡数量变化：400来尾/200来尾/100来尾/几十尾/几尾，死亡量最终降至几尾以内。

实施例2

2020年9月2日，河南商丘某养殖户养殖2个月左右的加州鲈鱼出现死亡，每天死亡数量300条左右，后经荧光定量PCR检测出是由于蛙虹彩病毒导致的死亡，按照下面治疗方案处理：

首先停止投喂饲料。

第1、2天，用“善泽一号500mL/亩十本草神露1000mL/亩”，连泼两天；

第3、4天，用“善毒清2号40g/亩”，连泼两天。

第5、6天，用″聚维酮碘溶液(水产用)330mL/亩+本草神露1000mL/亩，连续泼两天。

客户反馈：用药后6天内的死亡数量变化明显：由最开始每天死亡300多条减少到一天死亡几条，死亡量最终降至零。

实施例3

2020年8月28日，广东顺德某养殖户养殖50多天左右的加州鲈鱼出现死亡，每天死亡数量600条左右，后经荧光定量PCR检测出是由于蛙虹彩病毒导致的死亡，按照下面治疗方案处理：

首先停止投喂饲料。

第1、2天，用“善泽一号500mL/亩十本草神露1000mL/亩”，连泼两天；

第3、4天，用“善毒清2号40g/亩”，连泼两天。

第5、6天，用″聚维酮碘溶液(水产用)330mL/亩+本草神露1000mL/亩，连续泼两天。客户反馈：用药后6天内的死亡数量变化明显：由最开始每天死亡600多条减少到死亡量最终降至几条每天。

上述案列分析可以得出：本套针对加州鲈蛙虹彩病毒的定量快速检测+中药技术干预治疗方案在实际养殖过程中得到有效验证，可在加州鲈鱼蛙虹彩病毒的预防，判断及治疗方面来推广使用，从而能大大减少养殖过程中蛙虹彩病毒对于加州鲈鱼养殖造成的损失。