一种高效液相色谱法的Fmoc-L-Hyp(tbu)-OH及其异构体的手性检测方法

技术领域

本发明涉及有机化合物的检测技术领域，具体涉及一种高效液相色谱法的Fmoc-L-Hyp(tbu)-OH及其异构体的手性检测方法。

背景技术：

羟脯氨酸(Hydroxyproline,Hyp)又名反式-4-羟基-L-脯氨酸，是胶原蛋白的主要组成成分,不属于20种常见的氨基酸。近些年来,Hyp的研究和开发已经引起医药、生化、食品及美容业等方面的广泛关注。它可以作为化妆品添加剂，具有抗氧化、抗辐射的作用；它具有减肥作用,可望成为比较理想的减肥药物；具有多种生理功能与独特的生物活性,既可作为各种软组织疾病的药物,如结缔组织受损、风湿性关节炎等,又可加快伤口愈合，以及治疗各种皮肤疾病。

Hyp分子式为C5H9NO3，分子量为131.13。通常呈结晶性粉末或白色片状，具苦味中的特殊甜味。熔点为274℃，易溶于水(25℃，36.1％)，而微溶于乙醇。羟脯氨酸有四种同分异构体，包括4-羟脯氨酸的两种异构体和3－羟脯氨酸的两种异构体。

对映异构体的分离在生物化学、医药工业和现代立体选择有机合成方面都具有十分重要的意义。含手性因素的的化学药物的对映体在人体内的药理活性、代谢过程及毒性存在显著的差异。当前手性药物的研究已成为国际新药研究的主要方向之一。绝大多数的药物由手性分子构成，两种手性分子可能具有明显不同的生物活性。药物分子必须与受体(起反应的物质)分子几何结构匹配，才能起到应有的药效，就如右手只能带右手套一样。因此，往往两种异构体中仅有一种是有效的，另一种无效甚至有害，而羟脯氨酸有四种同分异构体对手性分离的难度就更大了。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效液相色谱法的Fmoc-L-Hyp(tbu)-OH及其异构体的手性检测方法，以解决现有技术中缺少对Fmoc-L-Hyp(tbu)-OH及其异构体的手型检测方法的缺陷。

一种高效液相色谱法的Fmoc-L-Hyp(tbu)-OH及其异构体的手性检测方法，所述方法包括如下步骤：

将正己烷和0.1％TFA的离子对溶液按一定比例配置流动相A；

将异丙醇和0.1％TFA的离子对溶液按一定比例配置流动相B；

注入待测溶液，以流动相A和流动相B对色谱柱进行等梯度洗脱；

记录色谱图，并采用面积归一化法计算Fmoc-Hyp(tbu)-OH的手性纯度。

进一步的，所述正己烷的体积含量为60～85％，异丙醇的体积含量为15～35％，0.1％TFA的离子对溶液的体积含量均为0.02～1.5％。

进一步的，所用色谱柱包括chiralpak IC、chiralcel OD-H、chiralpak IA、chiralpak IB以及Chirobiotic R中的一种或多种。

进一步的，所述等梯度洗脱的柱温为20～50℃。

进一步的，所述等梯度洗脱的进样浓度控制在0.25～1.5mg/ml。

进一步的，所述等梯度洗脱时紫外线检测器的检测波长为210～240nm。

进一步的，所述等梯度洗脱时紫外线检测器的检测波长为220nm。

进一步的，所述等梯度洗脱时流动相流速为0.5～1.5ml/min。

进一步的，所述等梯度洗脱时流动相流速为0.7ml/min。

进一步的，所述待测溶液包括Fmoc-L-Hyp(tbu)-OH溶液、异构体Fmoc-D-Hyp(tbu)-OH溶液、异构体Fmoc-L-Cis-Hyp(tbu)-OH溶液和异构体Fmoc-D-Cis-Hyp(tbu)-OH溶液中的一种或多种的结合。

本发明的优点在于：提供了一种新的方法可以检测Fmoc-L-Hyp(tbu)-OH及其异构体的手性检测方法，检测速度较快，结果准确，方法步骤简单，便于操作，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明中Fmoc-L-Hyp(tbu)-OH的分子结构示意图。

图2为本发明中Fmoc-L-Hyp(tbu)-OH异构体的分子结构示意图。

图3为本发明中对比例1的高效液相色谱示意图。

图4为本发明中对比例2的高效液相色谱示意图。

图5为本发明中对比例3的高效液相色谱示意图。

图6为本发明中实施例1的高效液相色谱示意图。

具体实施方式

为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。

如图1至图6所示，一种高效液相色谱法的Fmoc-L-Hyp(tbu)-OH及其异构体的手性检测方法，所述方法包括如下步骤：

步骤一：将正己烷和0.1％TFA的离子对溶液按一定比例配置流动相A；

步骤二：将异丙醇和0.1％TFA的离子对溶液按一定比例配置流动相B；

其中，所述0.1％TFA的离子对溶液的体积含量为0.02～1.5％、正己烷的体积含量为60～85％，异丙醇的体积含量为体积含量为15～35％；

步骤三：注入待测溶液，以流动相A和流动相B对色谱柱进行等梯度洗脱，梯度洗脱的柱温为20～50℃，进样浓度控制在0.25～1.5mg/ml，流动相流速为0.5～1.5ml/min，所用的手性柱包括chiralpak IC、chiralcel OD-H、chiralpak IA、chiralpak IB以及Chirobiotic R；

步骤四：记录色谱图，并采用面积归一化法计算Fmoc-Hyp(tbu)-OH的手性纯度；

所述等梯度洗脱时紫外线检测器的检测波长为210～240nm，优选的的检测波长为220nm，优选的流动相流速为0.7ml/min。

以下通过实施例和对比例进一步阐述本发明的方案：

对比例1：

色谱条件采用：

色谱柱：4.6*250mm，CHIROBIOTIC T柱；

流动相：MeOH:AcOH:TEA＝100:0.03:0.03；

波长：220nm样品配置:5mg/10ml流动相；

进样量：10ul；

流速：0.6ml/min；

注入Fmoc-L-Hyp(tbu)-OH与异构体Fmoc-D-Hyp(tbu)-OH，异构体Fmoc-L-Cis-Hyp(tbu)-OH，异构体Fmoc-D-Cis-Hyp(tbu)-OH的混合溶液，从图3看，有3个异构体没有分离开。

对比例2：

色谱条件采用：

色谱柱:4.6*250mm,CHIROBIOTIC T柱；

流动相A相:100％H2O；

流动相B:MeOH:AcOH:TEA＝100:0.03:0.03；

等梯度：A:B＝50:50；

波长:220nm；

样品配置:5mg/10ml流动相；

进样量:5ul；

流速:0.4ml/min；

注入Fmoc-L-Hyp(tbu)-OH与异构体Fmoc-D-Hyp(tbu)-OH，异构体Fmoc-L-Cis-Hyp(tbu)-OH，异构体Fmoc-D-Cis-Hyp(tbu)-OH的混合溶液，从图4看，有2个异构体没有分离开。

对比例3：

色谱条件采用：

色谱柱:4.6*250mm,chiralpak IC；

流动相A相:0.1％TFA in 100％Hex；

流动相B相:0.1％TFA in 100％IPA；

等梯度A:B＝90:10；

波长:220nm；

样品配置:5mg/10ml IPA；

进样量:10ul；

流速:0.8ml/min；

注入Fmoc-L-Hyp(tbu)-OH与异构体Fmoc-D-Hyp(tbu)-OH，异构体Fmoc-L-Cis-Hyp(tbu)-OH，异构体Fmoc-D-Cis-Hyp(tbu)-OH的混合溶液，从图5看，有1个异构体没有分离开。

实施例1：

色谱条件采用：

色谱柱:4.6*250mm,chiralpak IC；

流动相A相:0.1％TFA in 100％Hex；

流动相B相:0.1％TFA in 100％IPA；

等梯度A:B＝80:20；

波长:220nm；

样品配置:5mg/10ml IPA；

进样量:10ul；

流速:0.7ml/min；

注入Fmoc-L-Hyp(tbu)-OH与异构体Fmoc-D-Hyp(tbu)-OH，异构体Fmoc-L-Cis-Hyp(tbu)-OH，异构体Fmoc-D-Cis-Hyp(tbu)-OH的混合溶液，从图6看，四种同分异构体的成功分离。

再分别进样Fmoc-L-Hyp(tbu)-OH与异构体Fmoc-D-Hyp(tbu)-OH，异构体Fmoc-L-Cis-Hyp(tbu)-OH，异构体Fmoc-D-Cis-Hyp(tbu)-OH，确定各出峰时间，得出Fmoc-L-Hyp(tbu)-OH在12.9min左右，Fmoc-D-Hyp(tbu)-OH在15min左右，异构体Fmoc-L-Cis-Hyp(tbu)-OH再21min左右，异构体Fmoc-D-Cis-Hyp(tbu)-OH在40min左右。

本方法能够很好的分离Fmoc-L-Hyp(tbu)-OH的四种同分异构体，从而有效的控制Fmoc-L-Hyp(tbu)-OH的手性纯度。

由技术常识可知，本发明可以通过其它的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现。因此，上述公开的实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所有在本发明范围内或在等同于本发明的范围内的改变均被本发明包含。