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一种用于冠心病的标志物及其治疗药物

文献发布时间：2023-06-19 12:04:09

技术领域

本发明属于心血管疾病技术领域，尤其涉及一种用于冠心病的标志物及其治疗药物。

背景技术

随着人口老龄化的不断加剧，心血管疾病的死亡率快速增加，不仅给患者带来了极大的痛苦，而且造成了沉重的社会负担。在心血管疾病中，冠心病是最为常见的一种疾病。冠心病全称为冠状动脉粥样硬化心脏病（CAD），其主要由冠状动脉血管发生粥样硬化病变引起的管腔狭窄或堵塞，导致心肌缺血、缺氧或坏死而引发的心脏病。尽管最近几年，人们对于冠心病的诊断和治疗手段有了很大的进步，但是冠心病依然是全球人口死亡的主要原因。

目前，临床上关于冠心病的诊断手段依然少，目前主要是依靠有创性的抽血检测血浆生化标志物如心肌酶和肌钙蛋白等以及无创性的常规心电图，但是这些诊断手段只在心绞痛、血管狭窄、血供不足等临床症状出现后才存在诊断意义。因此，实现冠心病的准确诊断对于有效的治疗冠心病具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于针对临床上缺乏高特异性和高灵敏度的冠心病诊断标志物去提供一种能够有效诊断冠心病的标志物。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：检测长链非编码RNANONHSAG020448.2表达量的试剂在制备冠心病检测产品中的应用，其特征在于，所述长链非编码RNA NONHSAG020448.2的序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述产品包括芯片，试剂盒，或高通量测序平台。

优选地，所述试剂为检测长链非编码RNA NONHSAG020448.2表达量水平的PCR引物。

优选地，所述PCR引物的序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

其次，本发明提供了如下技术方案：扩增长链非编码RNA NONHSAG020448.2的PCR引物在制备冠心病试剂盒中的应用，所述引物的序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

进一步的，本发明提供了抑制长链非编码RNA NONHSAG020448.2表达的制剂在制备冠心病治疗药物中的应用。

优选地，所述长链非编码RNA NONHSAG020448.2的序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述制剂为抑制长链非编码RNA NONHSAG020448.2表达的siRNA，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7。

最后，本发明提供了如下技术方案：抑制长链非编码RNA NONHSAG020448.2表达的制剂在制备缺氧环境下HUVEC细胞活性促进剂中的应用。

优选地，所述长链非编码RNA NONHSAG020448.2的序列如SEQ ID NO.1所示；所述制剂为抑制长链非编码RNA NONHSAG020448.2表达的siRNA，所述siRNA的序列如SEQ IDNO.6和SEQ ID NO.7。

本发明的有益效果是：

本发明提供的长链非编码RNA NONHSAG020448.2可以作为冠心病诊断的标志物，实现冠心病的早诊断和早治疗。而且，本发明发现抑制长链非编码RNA NONHSAG020448.2能够有效的提高缺氧模拟条件下的HUVEC细胞的活性，因此，可将长链非编码RNANONHSAG020448.2表达的抑制剂用于制备冠心病治疗药物。

附图说明

图1为长链非编码RNA NONHSAG020448.2在冠心病患者血浆及正常人血浆中的表达；

图2为长链非编码RNA NONHSAG020448.2为冠心病患者血浆及正常人血浆中差异的ROC曲线；

图3为长链非编码RNA NONHSAG020448.2在常氧和缺氧培养的HUVEC细胞中的表达；

图4为长链非编码RNA NONHSAG020448.2的siRNA的抑制效果；

图5为MTT实验的检测结果；

图6为Western印迹法的检测结果。

具体实施方式

为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。

实施例1

研究对象

（1）收集济宁医学院附属医院2020年1月至2020年10月期间经冠状动脉造影检查明确为冠状动脉患者（CAD）的血浆42例，以及健康人体的血浆40例。

（2）纳入标准：冠状动脉患者的纳入标准为经冠状动脉造影术后证实存在1支或1支以上冠状动脉血管狭窄程度≥50%的患者；

（3）排除标准：（1）血液系统疾病，已知的出血或凝血障碍；或具备脑出血或蛛网膜下腔出血史、脑中风的患者；（2）患有慢性阻塞性肺病、先天性心脏病、心脏瓣膜病及心律失常的患者；（3）患有周围血管性疾病即自身免疫系统疾病的患者；（4）急性感染或炎症性疾病患者；（5）急性或慢性肾功能不全和肝功能损伤的患者；（6）血液系统疾病，如具有脑出血或蛛网膜下腔出血史或脑中风史的患者。

实施例2

血浆样本获取

（1）采集入选者清晨空腹外周静脉血5ml，置于离心机中，3000min，离心10min；

（2）吸取上层的血清，分装至无RNA酶的EP管中（200ul），置于-80℃冰箱中备用。

实施例3

RNA提取

（1）将1ml RNA提取液加入到含有血清的EP管中，轻轻震荡后，使用移液枪吹打混匀；

（2）加入200ul三氯甲烷，充分混匀后，室温静置5min；

（3）将EP管放入到离心机中，4℃ 12000rpm离心10min；

（4）将EP管取出，将上清转移至新的EP管中，加入等体积的异丙醇，充分混合后，室温静置10min；

（5）置于离心机中，4℃ 12000rpm离心10min，去掉上清加入75%乙醇洗涤2次，再次置于离心机中，4℃ 8000rpm 离心5min；

（6）去除上清，晾干，加入30ul DEPC水，使用紫外分光光度计测定各组RNA浓度后，-80℃保存。

实施例4

cDNA合成

1.残留基因组DNA去除

在RNase free离心管中配制如下混合液，用移液器轻轻吹打混匀。42℃孵育2min。

2.逆转录反应体系配制

在第1步的反应管中纸浆加入4×Hifair® Ⅲ SuperMix plus，用移液器轻轻吹打混匀。

3.逆转录反应

实施例5

实时荧光定量RT-PCR检测长链非编码RNA NONHSAG020448.2的相对表达量

（1）设计长链非编码RNA NONHSAG020448.2，SEQ ID NO.1和β-actin的引物：

长链非编码RNA NONHSAG020448.2的引物序列如下：

上游引物：5’-CAGGAAGGGAAAGAGAGGCG-3’（SEQ ID NO.2）

下游引物：5’-GCCAGTCGTCATGGAGAGTG-3’（SEQ ID NO.3）

β-actin的引物序列如下：

上游引物：5’-CGTGGACATCCGCAAAGAC-3’（SEQ ID NO.4）

下游引物5’-CTGCTGTCACCTTCACCGTTC-3’（SEQ ID NO.5）

（2）在冰上配置如下反应体系：H

（3）实时荧光定量RT-PCR反应

（4）采用2

长链非编码RNA NONHSAG020448.2在对照组和冠心病组中的表达差异如图1所示，长链非编码RNA NONHSAG020448.2在冠心病组的相对表达量为2.529±1.006， P <0.0001。

该结果说明冠心病患者血浆中长链非编码RNA NONHSAG020448.2的表达量显著高于对照组正常人血浆中的表达量。

实施例6 检测长链非编码RNA NONHSAG020448.作为标志物的灵敏度和特异度

（1）对长链非编码RNA NONHSAG020448.2在对照组和冠心病组中的表达差异绘制ROC曲线，绘制的ROC曲线如图2所示。

ROC的结果如下所示：

曲线下面积为0.896，置信区间为0.830-0.961，灵敏度为0.714，特异度为0.968。

上述结果说明长链非编码RNA NONHSAG020448.2作为对照组和冠心病组预测变量时具有优异的诊断价值。

实施例7

缺氧处理人脐静脉血管内皮细胞HUVEC检测长链非编码RNA NONHSAG020448.2的表达差异。

（1）将HUVEC细胞接种到细胞培养皿中，加入ECM完全培养基，待细胞密度达到70-80%的时候，加入ECM基础培养基，37℃饥饿12h；

（2）将内皮细胞放入缺氧细胞培养箱（1% O

实验的结果如图3所示，其中，缺氧组中长链非编码RNA NONHSAG020448.2的相对表达量为9.730±1.549，P=0.0006。

该结果说明缺氧损伤HUVEC时，长链非编码RNA NONHSAG020448.2的相对表达量显著升高，与临床检测的数据相符合。

实施例8

设计和检测长链非编码RNA NONHSAG020448.2的siRNA

1.本发明提供的长链非编码RNA NONHSAG020448.2的siRNA的序列如下所示：

正义链：5’-UCUAAUUACUGCAGAAUGG-3’，（SEQ ID NO.6）；

反义链：5’-CCAUUCUGCAGUAAUUAGA-3’,（SEQ ID NO.7）；

2.将HUVEC接种于细胞培养板中，转染siRNA和NC，同时将未处理组作为对照，转染48h之后，提取RNA，检测长链非编码RNA NONHSAG020448.2的相对表达量。

实验结果如图4所示，siRNA的抑制率为81.1%，P= 0.0002，因此，本发明提供的siRNA能够有效的抑制长链非编码RNA NONHSAG020448.2的表达。

实施例9

检测siRNA对于缺氧环境下HUVEC细胞的细胞活性的影响

（1）将实验分为三组分别是空白对照组：将未转染的1×10

（2）培养结束后添加MTT检测490nm吸光度；

不同实验组的吸光度差异如图5所示，其中，空白对照组的吸光度为0.617±0.016，NC组的吸光度为0.328±0.025，实验组的吸光度为0.449±0.024，NC组和实验组之间的P值为0.0037，差异具有统计学意义。

说明使用本发明的siRNA抑制长链非编码RNA NONHSAG020448.2的表达后可以有效的提高HUVEC细胞的活性。

实施例10

Western印迹法检测Cleaved Caspase3的蛋白表达水平

（1）将HUVEC细胞接种于6孔培养板中，待细胞密度达到越80%时，空白对照组不做处理，NC组转染si-NC，实验组转染siRNA，转染6小时后，将NC组和实验组置于1% O

（2）培养48h之后，每孔加入100μL PIPA裂解液，细胞充分裂解后，使用细胞刮刀将细胞刮下，并将细胞收集至离心管中；

（3）冰上放置30min，使细胞完全裂解；

（4）4℃，12000rpm离心20分钟，吸取上清，使用BCA法检测蛋白浓度，调整蛋白浓度为2μg/ml，放入沸水煮5min，即得到蛋白样品；

（5）配置12% SDS-PAGR胶，每孔加入10μL蛋白样品，并加入蛋白Marker；

（6）恒压90V电泳，待电泳条带跑出浓缩胶时，将电压调整至120V，直至溴酚蓝到达分离胶底部；

（7）按照海绵-滤纸-分离胶-膜-滤纸-海绵的模型放置转膜夹，250mA电转1.5h；

（8）电转结束后，将膜取出放于5%的脱脂奶粉中，摇床封闭1h；

（9）孵育Cleaved Caspase3和GAPDH一抗，4℃，摇床封闭过夜；

（10）加入TBST进行洗膜， 3次每次10min，孵育二抗，室温摇床孵育1h；

（11）加入TBST进行洗膜， 3次每次10min，洗好后，进行曝光，得到的结果如图6所示的结果。

从图中可以看出，缺氧能够提高HUVEC细胞中Cleaved Caspase3蛋白的表达量，而转染siRNA之后则可以一定程度的降低Cleaved Caspase3蛋白的表达量。

说明本发明的siRNA抑制长链非编码RNA NONHSAG020448.2的表达后可以通过降低HUVEC细胞的凋亡来提高细胞的活性。

序列表

<110> 郭道通

<120> 一种用于冠心病的标志物及其治疗药物

<130> 2021.6.18

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 340

<212> DNA

<213> 人源(Human)

<400> 1

cctcagctcc acggggagct cttggacgct ccgcagcgct ttcgcagagt ccccagttct 60

cccgtcccgc cgggactcca ggaagggaaa gagaggcgtg gaattggcag agccctggca 120

gcgtgatgag gaaacagacc ccattctgca gtaattagaa aacgtcatga tacaatgcca 180

cgtgaagcac acaccagcac ctggcaaaac gctcaacctg gatcaaatta ctgggaaaca 240

tcagatgggt ccagattacg caggacactc tccatgacga ctggcctgga atcctcaaaa 300

acagcaatgc tgtgaaagac ataaataaaa cagaaaaaaa 340

<210> 2

<211> 20

<212> DNA