包含聚丙烯亚胺的非病毒载体

发明领域

本发明涉及包含聚丙烯亚胺和核酸的非病毒载体和药物组合物及其在人或兽医学中的用途的领域。更确切地说，本发明涉及用于递送或转染核酸(例如RNA)的包含聚丙烯亚胺的聚合物或共聚物的药物组合物。本文所述的药物组合物特别适用于(核酸)疫苗接种、基于核酸的蛋白质疗法、基于核酸的蛋白质替代疗法、基因编辑、碱基编辑、细胞疗法、免疫疗法、干细胞疗法、再生医学、基因沉默、核酸抑制或蛋白质抑制。

多年来，特别是鉴于基因治疗的进步，引入编码一种或多种多肽的外源核酸用于预防和治疗目的一直是生物医学研究的目标。然而，已经证明外源核酸的引入是有用的，更具体地是在基于核酸的疫苗接种、蛋白质疗法、蛋白质替代疗法、基因编辑、碱基编辑、细胞疗法、免疫疗法、干细胞疗法、再生医学、基因沉默、RNA抑制或蛋白质抑制的背景下有用。核酸递送是具有若干应用的有前景的新工具，其可以治疗目前不可治愈的一些疾病，例如遗传病症、癌症疾病和一些视网膜疾病，并且还可以用于疫苗接种目的。核酸递送包括将核酸(例如RNA和DNA)引入细胞中。由于裸核酸本身通常不能被细胞有效内化，因此核酸递送需要载体系统(载体)。细胞中外源核酸的引入根据靶细胞或生物体、核酸分子的类型和/或递送系统而变化。

受与使用脱氧核糖核酸(DNA)分子相关的安全性和有效性问题的影响，近年来核糖核酸(RNA)分子受到越来越多的关注。已经提出了用于递送RNA的各种方法，例如非病毒或病毒递送载体。在病毒和病毒递送载体中，核酸通常被蛋白质和/或脂质(病毒颗粒)包封。例如，已经提出了衍生自RNA病毒的工程化RNA病毒颗粒作为用于处理植物或用于哺乳动物疫苗接种的递送载体。先前已经描述了用于核酸载体化的多种化合物，即所谓的转染试剂。这些化合物通常是聚阳离子或包含阳离子脂质或脂质样化合物(如类脂质)的组合物。核酸与聚阳离子的复合物被称为聚合复合物(polyplexes)，与阳离子脂质的那些复合物被称为阳离子脂质体(lipoplexes)。

虽然病毒是目前可用的最有效的递送载体，但它们的可能使用引起了安全问题。医学和兽医界不愿将RNA病毒颗粒施用于人或动物。由于所有上述原因，目前正在研究不包含病毒颗粒的其他类型的载体。目前研究的非病毒载体包括聚合物，由于其化学灵活性、易于合成、生物相容性的潜力、简单性和廉价合成，已发现其具有优势。

现有技术公开了聚合物(如PEI和PGA)用于递送生物大分子的用途(WO2018/156617 A2)。还描述了聚合物胶束用于递送各种治疗药物的用途(WO2018/002382 A1)。然而，现有技术中的组合物通常表现出诸如低转染效率或受其细胞毒性限制的缺点。因此，即使非病毒载体已经在核酸递送的背景下进行了广泛研究，但由于各种原因，即毒性、不令人满意的转染效率、技术和监管问题，将非病毒载体方法转化为临床实践并不是很成功。因此，需要用于递送和转染核酸的替代药物组合物。在本发明中，我们已经鉴定了在核酸递送和转染中有效并且克服了上述问题的新型非病毒载体。这些载体的特征在于包含PPI，优选具有低聚合度，更优选为线性PPI。

本发明的一个具体发现是，与具有低PPI含量的L-PEI单体和L-PPI/L-PEI聚合物相比，发现具有高PPI含量的L-PPI单体和L-PPI/L-PEI共聚物更有效地复合RNA。

在第一方面，本发明提供了新型组合物，其包含聚丙烯亚胺聚合物(PPI)和核酸。更具体地，本发明提供了药物组合物，其包含PPI和核酸，其中所述PPI的聚合度为约20-1000，优选约100-500，最优选约200-300。

在优选的实施方式中，所述PPI是线性的。

在进一步的实施方式中，组合物还包含聚乙烯亚胺聚合物(PEI)。在另一个实施方式中，所述PEI是线性的。

在进一步的实施方式中，所述PEI的聚合度为约20-1000，优选约100-500，最优选约200-300。

在一个具体实施方式中，所述PPI和所述PEI形成共聚物，其可以是无规共聚物。因此，本发明还提供了包含PPI/PEI共聚物的药物组合物。

在根据本发明的一个具体实施方式中，所述共聚物的聚合度为约20-1000，优选约100-500，最优选约200-300。

在一个具体实施方式中，在本发明的组合物或共聚物中，所述PEI的聚合度与所述PPI的聚合度在约1:1-1:500、优选约1:1-1:100、最优选约1:2-1:10的范围内。

在一个实施方式中，药物组合物还包含脂质。

在另一个实施方式中，核酸是RNA或DNA分子；优选选自mRNA、自复制mRNA(复制子)、环状mRNA、环状RNA、其翻译可由外部或内部分子控制的mRNA或复制子、非编码RNA、siRNA、正义RNA、反义RNA、核酶、RNA适配体、RNA适体酶、saRNA、pDNA、小环、闭合线性DNA、基因组DNA、cDNA、单链和/或双链DNA及其任何组合或化学修饰形式。

在又一个实施方式中，N/P比小于40；优选小于20；更优选小于10。

在另一个实施方式中，根据本发明的药物组合物用于人医学或兽医学，更具体地，药物组合物用于(核酸)疫苗接种、基于核酸的蛋白质疗法、基于核酸的蛋白质替代疗法、基因编辑、碱基编辑、细胞疗法、免疫疗法、干细胞疗法、再生医学、基因沉默、核酸抑制或蛋白质抑制。

本发明的一个优点是与现有技术的非病毒载体相比，该组合物具有高转染效率、低细胞毒性，并且另一个优点是它们的小尺寸使得它们适合体内使用。

现在具体参考附图，要强调的是，所示的细节仅作为示例并且仅出于对本发明的不同实施方式的说明性讨论的目的。它们是为了提供被认为是本发明的原理和概念方面的最有用和容易的描述而呈现的。在这方面，没有试图比对本发明的基本理解所必需的更详细地示出本发明的结构细节。结合附图进行的描述使得本领域技术人员清楚如何在实践中体现本发明的若干形式。

图1(Figure 1)，也缩写为图1(Fig.1)，示出了根据本发明的包含线性PPI(L-PPI)和DP为250的组合物的转染效率，

图2，也缩写为图2，示出了包含线性PEI(L-PEI)和DP为250的组合物的转染效率。

图3，也缩写为图3，示出了包含DP为50/200的线性PEI和线性PPI的共聚物(L-PEI/L-PPI)的组合物的转染效率。

图4，也缩写为图4，示出了包含DP为200/50的线性PEI和线性PPI的共聚物(L-PEI/L-PPI)的组合物的转染效率。

图5，也缩写为图5，示出了包含DP为100/150的线性PEI和线性PPI的共聚物(L-PEI/L-PPI)的组合物的转染效率。

图6，也缩写为图6，示出了包含DP为150/100的线性PEI和线性PPI的共聚物(L-PEI/L-PPI)的组合物的体外转染效率。

图7，也缩写为图7，示出了包含修饰的mRNA和DP为250的线性PEI(L-PEI)的组合物的转染效率。

图8，也缩写为图8，示出了包含siRNA和DP为50/200的线性PEI和线性PPI的共聚物(L-PEI/L-PPI)的组合物在HeLa细胞中的基因沉默效率。

图9，也缩写为图9，示出了包含siRNA和DP为50/200的线性PEI和线性PPI的共聚物(L-PEI/L-PPI)的组合物在SKOV3-Luc细胞中的基因沉默效率。

图10，也缩写为图10，示出了包含DP为250的线性PPI(L-PPI)的组合物的Z电位的测定。

图11，也缩写为图11，示出了包含DP为50/200的线性PEI和线性PPI的共聚物(L-PEI/L-PPI)的组合物的Z电位的测定。

图12，也缩写为图12，示出了包含DP为250的线性PPI(L-PPI)和复制子RNA的组合物的尺寸测定。

图13，也缩写为图13，示出了包含DP为250的线性PPi(L-PPi)和修饰的非复制型mRNA的组合物的尺寸测定。

图14，也缩写为图14，示出了包含DP为50/200的线性PEI和线性PPI的共聚物(L-PEI/L-PPI)和复制子RNA的组合物的尺寸测定。

图15，也缩写为图15，示出了包含DP为250的线性PPI的组合物的细胞活力(cellavailability)。

图16，也缩写为图16，示出了包含DP为250的线性PEI的组合物的细胞活力。

图17，也缩写为图17，示出了包含DP为50/200(比率为1：4)的线性PEI和线性PPI的共聚物(L-PEI/L-PPI)的组合物的细胞活力。

图18，也缩写为图18，示出了如果组合物包含DP为200/50(比率4：1)的线性PEI和线性PPI的共聚物(L-PEI/L-PPI)的细胞活力。

图19，也缩写为图19，示出了包含DP为100/150(比率2：3)的线性PEI和线性PPI的共聚物(L-PEI/L-PPI)的组合物的细胞活力。

图20，也缩写为图20，示出了包含DP为150/100(比率为3：2)的线性PEI和线性PPI的共聚物(L-PEI/L-PPI)的组合物的细胞活力。

图21，也缩写为图21，示出了使用现有技术的转染试剂lipofectamineMessengerMax(MM)进行的转染效率的体外测试的转染结果。

图22，也缩写为图22，示出了包含比率为2:1(μl MM：μg mRNA)的lipofectamineMessengerMax(MM)的组合物的细胞活力。

现在将进一步描述本发明。在以下段落中，更详细地定义了本发明的不同方面。除非明确相反地指出，否则如此定义的每个方面可以与任何其他一个或多个方面组合。特别地，被指示为优选或有利的任何特征可以与被指示为优选或有利的任何其他一个或多个特征组合。

当描述本发明的化合物时，除非上下文另有规定，否则所使用的术语应根据以下定义来解释。

本发明描述了药物组合物，其包含：(a)聚乙烯亚胺聚合物PPI；和(b)核酸，其中所述PPI的聚合度为约20-1000，优选约100-500，最优选约200-300。我们已经发现，根据本发明的组合物具有比目前可用的其他非病毒载体更高的转染效率。此外，所述组合物具有小粒径使得其适合体内使用。因此，本发明的一个优点是该组合物具有高转染效率，并且另一个优点是其小尺寸使得其有利于体内使用。此外，所述组合物比基于现有技术的非病毒载体的组合物引起更小的细胞毒性作用。

根据本发明的药物组合物可以是或包含聚合物共混物、共聚物、均聚物、嵌段共聚物、梯度共聚物和无规共聚物。药物组合物可以进一步包含活性药物成分和其他赋形剂。

术语“核酸”是指由5碳糖、磷酸基团和含氮碱基组成的生物分子。术语核酸包括单链和/或双链的DNA和RNA，及其任何组合或化学修饰形式。

除非另有说明，否则如本文所用的术语“聚合度”或“DP”是指数均聚合度。它可以使用以下等式计算:Mn/M0，其中Mn是聚合物的数均分子量，M0是单体单元的分子量。例如，PPI由重复的丙胺单元组成，因此丙胺是PPI的单体单元。所述的PPI的单体单元的分子量约为57.1g/mol。基于上式，DP为200的PPI聚合物的数均分子量可以计算为在其游离碱形式下等于约11.400g/mol。聚合物也可以由质子化形式组成，其中重复单元的质量随盐的质量增加，例如对于HCl盐，PPI-HCl重复单元的质量为约93.6g/mol。

当提及诸如参数、量、持续时间等的可测定值时，如本文所用的术语“约”或“大约”意指涵盖指定值的+/-10％或更小，优选+/-5％或更小，更优选+/-1％或更小，并且还更优选+/-0.1％或更小的变化，只要此类变化适合在所公开的发明中执行。应当理解，修饰语“约”或“大约”所指的值本身也是具体地且优选地公开的。

如在说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。举例来说，“一种化合物”是指一种化合物或多于一种化合物。

根据本发明的具体实施方式，组合物还可以进一步包含聚乙烯亚胺聚合物(PEI)。

聚乙烯亚胺(PEI)和聚丙烯亚胺(PPI)是具有高阳离子电荷密度的有机大分子。聚乙烯亚胺，也称为PEI或聚(乙烯亚胺)(poly(ethylene imine))，是由重复的乙胺单元组成的聚合物。聚丙烯亚胺，也称为PPI或聚(丙烯亚胺)(poly(propylene imine))，是由重复的正丙胺单元组成的聚合物。由于带电氨基的存在，它们有被质子化的潜力，特别是以其线性形式，从而包含PEI和/或PPI的聚合组合物可以结合和压缩核酸。PEI和PPI可以将核酸压缩成带正电荷的颗粒，所述带正电荷的颗粒能够与细胞表面的阴离子蛋白聚糖相互作用并促进颗粒的进入。

根据本发明的一个具体实施方式，PPI或PEI或两者都是线性的。在本申请中，线性PPI也称为L-PPI，线性PEI也称为L-PEI。使用线性PPI和/或线性PEI的优点是所得药物组合物可以带正电荷，并且与核酸形成的复合物具有小尺寸。聚合物的另一个优点是它们很短，因此将更容易被肾脏清除。

此外，发现具有高PPI含量的L-PPI单体和L-PPI/L-PEI共聚物比具有低PPI含量的L-PEI单体和L-PPI/L-PEI聚合物更有效地复合RNA。

根据本发明的具体实施方式，所述PEI的聚合度为约20-1000，优选约100-500，最优选约200-300。

术语“平均直径”是指通过动态光散射测定的颗粒的平均流体动力学直径，使用所谓的累积量算法进行数据分析，其提供具有长度尺寸的所谓的“Z平均值”作为结果。这里，颗粒的“平均直径”、“直径”或“尺寸”与Z平均值同义使用。

根据本发明，“N/P比”是指聚合物中的氮原子(N)与核酸中的磷原子(P)的摩尔比。N/P比反映了给定量的聚合物中的氮与给定量的核酸中的磷酸盐的输入摩尔比。在一个具体实施方式中，所述N/P比小于40；优选小于20；更优选小于10，例如5、4、3、2、1或更小，例如0.5或0.2。在一个具体实施方式中，N/P比可以例如为约在0.2和10之间；例如在1和10之间，或在1和5之间。或者，所述比率也可以在1和20之间。具体地，较低的N/P比可有益于降低所用组合物的毒性。这可以是例如在具有相对高PPI含量的组合物中的情况。

根据本发明的另一个具体实施方式，所述PPI和所述PEI或所述L-PPI和L-PEI形成共聚物，优选无规共聚物。

L-PPI和L-PEI的共聚物可以例如表示如下：

本发明人惊奇地发现，当共聚物优选具有约20-1000、更优选约100-500、最优选约200-300的聚合度时，RNA被有效地复合并转染至细胞。更具体地，可以在具有相对高的L-PPI与L-PEI比率的共聚物中实现更高的RNA复合。

本发明特别优选的组合物的特征在于包含一种或多种下列物质：

-具有高PPI含量的PPE/PEI共聚物

-DP为250的PPI

-DP为250的PPI/PEI共聚物

-PPI/PEI比为至少1.5：1，优选至少4：1的PPI/PEI共聚物

-N/P比大于1；优选大于5；更优选在5和20之间

本发明的特别优选的组合物包含：

-DP为250的L-PPI，和

-RNA，N/P比为约在0.2和10之间；优选1和10之间；最优选在1和5之间。

这些组合物的特征特别在于具有高转染效率、低粒径、良好稳定性和低毒性。

本发明的另一个特别优选的组合物包含：

-L-PEI和L-PPI的共聚物，其DP为250

-RNA，N/P比为约1和20之间

-PPI/PEI比为至少1.5：1；优选至少4：1

这些组合物的特征特别在于具有高转染效率、低粒径、良好稳定性和低毒性。

如本文所用的术语“无规共聚物”是指统计共聚物，其中在链中的特定点处发现给定类型的单体残基的概率与该单体残基在链中的摩尔分数相似。这通常由用作L-PEI/PPI前体的母体聚合物的统计共聚的竞聚率(reactivity ratio)来描述。在此，我们将无规共聚物定义为共聚的竞聚率(r

在本发明的上下文中，合成并测试了具有L-PEI与L-PPI的不同摩尔比的L-PEI和L-PPI的共聚物。根据本发明的实施方式，所述PEI的聚合度(DP)与所述PPI的聚合度(DP)在1：1-1：500、优选约1：1-1：100、最优选约1：2-1：10的范围内。根据本发明的一个具体实施方式，已经发现包含富含PPI的PEI和PPI的组合物显示出比其它核酸载体更高的转染效率。富含PPI的组合物是其中PPI的量超过组合物中任何其它聚合物组分(例如PEI)的量的组合物。根据本发明，所述核酸是RNA或DNA分子；优选选自mRNA、自复制mRNA(复制子)、环状mRNA、环状RNA、其翻译可由外部或内部分子控制的mRNA或复制子、非编码RNA、siRNA、正义RNA、反义RNA、核酶、RNA适配体、RNA适体酶、saRNA、pDNA、小环、闭合线性DNA、基因组DNA、cDNA、单链和/或双链DNA及其任何组合或化学修饰形式。

术语“RNA”是指包含核糖核苷酸残基并且优选完全或基本上由核糖核苷酸残基组成的分子并且包含本文所述的所有RNA类型。术语“RNA”包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA例如部分或完全纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成的RNA和重组产生的RNA例如通过一个或多个核苷酸的添加、缺失、取代和/或改变而不同于天然存在的RNA的修饰的RNA。这样的改变可以包括添加非核苷酸材料，例如添加到RNA的末端或内部，例如在RNA的一个或多个核苷酸处。RNA分子中的核苷酸还可以包含非标准核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可以称为类似物，特别是天然存在的RNA的类似物。根据本发明使用的RNA可以具有已知的组成，或者RNA的组成可以是部分或完全未知的。

术语“DNA”是指包含脱氧核糖核苷酸残基并且优选完全或基本上由脱氧核糖核苷酸残基组成的分子并且包含本文所述的所有DNA类型。术语“DNA”包括pDNA、小环、闭合线性DNA、基因组DNA、cDNA、单链和/或双链DNA及其任何组合或化学修饰形式。

在一个实施方式中，药物组合物还包含脂质。为了进一步改善根据本发明的药物组合物的性质，可以实现具有脂质和/或带负电荷的聚合物包衣的共制剂。

术语“脂质”是指不溶于水的脂肪物质，包括脂肪、油、蜡和相关化合物。脂质可以在血液中产生(内源性)或在饮食中摄取(外源性)。脂质对于正常的身体功能是必需的，并且无论是从外源性还是从内源性来源产生，它们都必须被运输然后释放以供细胞使用。供细胞使用的脂质的产生、运输和释放被称为脂质代谢。虽然存在几类脂质，但两个主要类别是胆固醇和甘油三酯。胆固醇可以在饮食中摄入并由体内大多数器官和组织的细胞产生，主要是在肝脏中。胆固醇可以以其游离形式存在，或者更常见的是与脂肪酸结合，即所谓的胆固醇酯。

根据本发明的药物组合物可用于人或兽医学。根据另一个实施方式，根据本发明的药物组合物可用于核酸递送有用的方法中，例如但不限于(核酸)疫苗接种、或基于核酸的蛋白质疗法、基于核酸的蛋白质替代疗法、基因编辑、碱基编辑、细胞疗法、免疫疗法、干细胞疗法、再生医学、基因沉默、核酸抑制或蛋白质抑制。

实施例

材料和方法

合成mRNA产生

使用

通过用N1-甲基假尿苷-5’-三磷酸盐(Trilink Biotechnologies，San Diego，USA)替换IVT混合物中的所有尿苷-5’-三磷酸盐，由I-SceI线性化质粒通过IVT产生编码荧光素酶的N1-甲基假尿苷(1mΨ)修饰的非复制型mRNA(mod-mRNA)。接下来，纯化mRNA并使用痘苗病毒加帽酶和2’-O-甲基转移酶(Cellscript，Wisconsin，USA)对mRNA加帽以产生cap1，然后使用RNeasy mini kit(Qiagen，Germany)再次纯化。使用A-Plus Poly(A)聚合酶加尾试剂盒(Cellscript)将这些mod-mRNA的poly(A)尾(其长度为40个腺苷)延伸至约200个腺苷，然后纯化。最后，通过分光光度法(NanoDrop，Thermo Fisher Scientific，Massachusetts，US)测定mod-mRNA浓度。

小干扰RNA

靶向萤火虫荧光素酶(pGL3)的小干扰RNA(siRNA)或对照siRNA购自Dharmacon(Lafayette，USA)，并以16.5μM的浓度溶于无RNA酶的水中，并以20μl的等分试样储存在-20℃。

聚合物生产

如下合成DP为250的聚合物L-PEI、DP为250的聚合物L-PPI及其共聚物(DP为200/50-150/100-100/150-50/200的L-PEI/L-PPI)。首先，使用甲苯磺酸甲酯作为引发剂，总单体与引发剂的比率为250，在4M总单体浓度下制备2-乙基-2-噁唑啉(EtOx)和2-异丙基-2-噁嗪(iPrOzi)的共聚物(不同比率的单体(EtOx：iPrOzi＝250：0、0：250、200：50、150：100、100：150和50：200)以制备不同的共聚物)，以获得DP为250的聚合物。聚合在Biotage微波反应器中在140℃下进行，通过气相色谱法证实完全单体转化。尺寸排阻色谱法证实形成分散度低于1.4的相当限定的共聚物，并且

自扩增和修饰的mRNA纳米复合物的制备和表征

为了制备纳米复合物，将等体积的RNA溶液加入到聚合物溶液中,温和混合并在室温下孵育30分钟。将聚合物和RNA都溶解在20mM乙酸钠缓冲液(pH＝5.2)中。使用不同的聚合物与mRNA比率来产生纳米复合物。对于自扩增mRNA纳米复合物，N/P比为N/P40-20-10-5-1和0.2，对于mod-mRNA纳米复合物，N/P为30-15-8-4-0.8-0.2。随后使用动态光散射(Zetasizer Nano，Malvern Instruments，Malvern，UK)测定自扩增和修饰的mRNA纳米复合物的尺寸和ζ电位。ζ电位是表面电荷的典型量度，因此是悬浮液中带电颗粒的稳定性的典型量度。通常，至少约20的ζ电位表明所述颗粒具有良好稳定性。

细胞培养和转染程序

将HeLa细胞在培养基中培养并维持在37℃和5％CO2的湿润培养箱中。培养基由补充有10％胎牛血清(Biowest，California，US)、5.000单位/mL青霉素和5.000μg/mL链霉素(Thermo Fisher Scientific，Massachusetts，US)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)(Gibco，Thermo Fisher Scientific，Massachusetts，US)组成。在用自扩增或修饰的mRNA转染前一天，将HeLa细胞以50000个细胞/孔的密度接种在24孔板中。第二天(即24小时后)，将培养基更换为Opti-MEM，并向每个孔中加入20μL含有500ng RNA的聚合物：RNA复合物溶液。转染24小时后，通过生物发光成像分析荧光素酶的表达。为此，将细胞用胰蛋白酶消化，并将一部分中和的细胞悬浮液(60％)转移到黑色96孔板中。向每个孔中加入D-荧光素溶液(50mg/mL；最终孔体积的10％)并孵育10分钟。随后，使用IVIS Lumina II(XenogenCorporation，Alameda，California，US)测定发射的生物发光。每24孔使用500ng RNA，类似的方式进行以不同比率的参考载体Lipofectamine MessengerMax(ThermoFischerScientific)的转染。

siRNA纳米复合物的制备和体外沉默效率

为了评价聚合物递送siRNA的能力，通过向聚合物溶液中加入等体积的siRNA溶液并温和混合并在室温下孵育30分钟来制备siRNA-纳米复合物。将聚合物和siRNA都溶解在20mM乙酸钠缓冲液(pH＝5.2)中。siRNA的最终浓度为10nM。使用不同的聚合物(DP为50/200的PEI/PPI)与siRNA比率来产生siRNA-纳米复合物。随后，在两个方案中测试这些siRNA-纳米复合物。

在第一组实验中，我们在HeLa细胞中进行荧光素酶复制子与PEI/PPI siRNA纳米复合物的共转染。如上所述培养HeLa。在用基于PEI/PPI(50/200)的复制子mRNA和siRNA纳米复合物共转染前一天，将HeLa细胞以50,000个细胞/孔的密度接种在24孔板中。第二天(即24小时后)，将培养基更换为Opti-MEM，并使用PEI/PPI(DP50/200)以N/P为5的条件下用500ng编码荧光素酶的复制子转染细胞。30分钟后，将含有6pmol siRNA的PEI/PPI siRNA-纳米复合物加入细胞中。24后，我们使用如上所述用于mRNA的IVIS Lumina II成像系统测定荧光素酶。我们使用仅用荧光素酶复制子或用荧光素酶复制子加PEI/PPI纳米复合物处理的细胞作为对照，其中PEI/PPI纳米复合物含有以最高研究N/P比制备的对照siRNA(scrambled siRNA)。预期后一比率具有最高的细胞毒性。

在第二组实验中，使用稳定表达萤火虫荧光素酶的SKOV3-luc细胞。将这些细胞在37℃和5％CO2的湿润培养箱中培养，其使用补充有10％胎牛血清(Biowest，California，US)，5.000单位/mL青霉素和5.000μg/mL链霉素(Thermo Fisher Scientific，Massachusetts，US)的McCoy's 5A(改良)培养基(Gibco，Thermo Fisher Scientific，Massachusetts，US)。在用基于PEI/PPI(50/200)的siRNA-纳米复合物转染前一天，将SKOV-3-Luc细胞以50,000个细胞/孔的密度接种在24孔板中。第二天(即24小时后)，将培养基更换为Opti-MEM，并向每个孔中加入含有6pmol siRNA的20μL PEI/PPI(50/200)聚合物siRNA-纳米复合物溶液。转染36小时后，使用如上所述的用于mRNA的IVIS Lumina II成像系统分析荧光素酶表达。

细胞活力

使用细胞增殖试剂WST-1(Roche)测定转染实验24小时后的细胞活力。胰蛋白酶消化后，将一部分中和体积(6.66％)转移到透明ELISA板中，并根据制造商的说明书加入WST-1溶液。孵育30分钟后，将板在板振荡器上振荡1分钟，并使用EZ Read 400酶标仪(Biochrom)测定450nm(620nm参考)处的吸光度。

体内转染

在鸡的颈部或翅膀局部注射后，在鸡中研究包含自扩增mRNA和L-PEI/PPI聚合物(DP为50/200)的纳米复合物的体内转染效率。为此，如体外实验所述，以N/P比为5制备自扩增mRNA-PEI-PPI纳米复合物。随后将含有5μg自扩增mRNA(编码荧光素酶)的纳米复合物注射到颈部或翅膀中。两天后，给鸡注射D-荧光素，随后安乐死并用IVIS Lumina II成像。

结果

转染效率的测定

图1至7示出了用自扩增mRNA纳米复合物或修饰的mRNA纳米复合物进行的转染效率的体外测试的结果。制备包含具有不同N/P比的聚合物和核酸的组合物。更具体地，0.2、1、5、10、20和40。还制备了仅具有缓冲液并因此不含纳米复合物的对照溶液(对照(control)、对照(ctrl))。

图1示出了包含自扩增mRNA和DP为250的线性PPI(L-PPI)的组合物的转染结果，表明与对照相比，在每种情况下，转染效率都增加了。对于N/P比在1和10之间的组合物；特别是在5和10之间，实现了特别增加的转染效率。

图2示出了包含自扩增mRNA和DP为250的线性PEI(L-PEI)的组合物的转染结果。重要的是要注意N/P为10和N/P为5的第一组合物的生物发光强度以及因此的转染效率显著超过第二组合物的荧光强度。与PPI获得的结果相反，对于PEI，与对照相比，除了N/P为40之外，没有观察到不同的组合物的转染效率增加。

图3示出了包含自扩增mRNA和DP为50/200的线性PEI和线性PPI的共聚物(L-PEI/L-PPI)的组合物的转染结果。因此，所述PEI的聚合度与所述PPI的聚合度的比率为1：4。再次，与对照相比，观察到所有组合物的转染效率增加，其中N/P比高于5的组合物的转染效率特别增加。

图4示出了包含自扩增mRNA和DP为200/50(比率4：1)的线性PEI和线性PPI的共聚物(L-PEI/L-PPI)的组合物的转染结果。重要的是要注意，对于每个测试的N/P比，富含PPI的第一组合物的生物发光强度显著超过第二组合物的生物发光强度。因此，富含L-PPI的第一组合物显示出比包含L-PPI但不包含L-PEI的组合物(其结果如图1左侧所示)更高的转染效率。

图5示出了包含自扩增mRNA和DP为100/150(比率2：3)的线性PEI和线性PPI的共聚物(L-PEI/L-PPI)的组合物的转染结果。该图再次显示过量的PPI对测试组合物的转染效率具有有益效果。

图6示出了包含自扩增mRNA和DP为150/100(比率为3：2)的线性PEI和线性PPI的共聚物(L-PEI/L-PPI)的组合物的转染结果。该图证实，组合物中过量的PEI并不可观地影响测试组合物的转染效率。

图7示出了包含修饰的mRNA和DP为250的线性PPI(L-PPI)的组合物的转染结果，表明与对照(Ctrl)相比，在N/P为0.8和30之间时，转染效率增加。对于N/P比为1和10之间的组合物，实现了特别增加的转染效率。该图还示出了用现有技术的转染试剂lipofectamineMessengerMax(MM)进行的体外转染结果。包含该脂质载体和修饰的mRNA(以2μl MM：1μgmod-mRNA的比率)的组合物通常导致在1x10

图8示出了包含siRNA和DP为50/200的线性PEI和线性PPI的共聚物(L-PEI/L-PPI)的组合物在HeLa细胞中的转染结果，表明当与对照siRNA或仅接受编码荧光素酶的复制子(neg.ctrl.)的HeLa细胞相比时，siRNA介导的沉默在N/P为1和0.2之间最有效。通过将siRNA-纳米复合物加入到用编码荧光素酶的复制子共转染的HeLa细胞中以获得数据。较低的表达(总通量)表明siRNA的良好细胞内递送和随后的靶荧光素酶mRNA的信号传导。

图9示出了包含siRNA和DP为50/200的线性PEI和线性PPI的共聚物(L-PEI/L-PPI)的组合物在SKOV-3-Luc细胞中的转染结果，表明siRNA介导的沉默在N/P比为5或更低时是最有效的。SKOV-3-Luc细胞稳定表达荧光素酶。较低的表达(总通量)表明siRNA的良好细胞内递送和随后的靶荧光素酶mRNA的信号传导。

总之，结果显示，与富含L-PEI的组合物相比，富含L-PPI的组合物的转染效率更高。此外，结果表明，该组合物在体内以及修饰的mRNA和siRNA上也有效。

化合物的物理化学性质

ζ电位

图10示出了包含自扩增mRNA和DP为250的线性PPI(L-PPI)的组合物的ζ电位的测定。如图所示，N/P比为至少5的组合物具有优异的ζ电位，并且被认为是稳定的制剂。

图11示出了包含自扩增mRNA和DP为50/200(比率1：4)的线性PEI和线性PPI的共聚物(L-PEI/L-PPI)的组合物的ζ电位的测定。如图所示，N/P比为至少5的组合物具有优异的ζ电位，并且被认为是稳定的制剂。

尺寸测定

图12示出了包含DP为250的线性PPI(L-PPI)和复制子RNA(自扩增mRNA)的组合物的尺寸测定。与N/P比较高的组合物相比，N/P比为1或更小的组合物显示出具有更高的Z-平均值。对于一些应用，颗粒的低平均直径可能是有益的。

图13示出了包含修饰的mRNA和具有DP 250的线性PPI(L-PPI)的组合物的尺寸测定。与具有较高N/P比的组合物相比，具有0.2或更小的N/P比的组合物显示出具有更高的Z-平均值。对于一些应用，颗粒的低平均直径可能是有益的。

图14示出了包含自扩增mRNA和DP为50/200(比率1：4)的线性PEI和线性PPI的共聚物(L-PEI/L-PPI)和复制子RNA的组合物的尺寸测定。对于富含PPI的共聚物，N/P为5-20的组合物获得低平均直径的颗粒。

细胞活力

图15示出了用包含自扩增mRNA和DP为250的线性PPI(L-PPI)的组合物转染24小时后的细胞活力。从图中可以明显看出，N/P比越低，组合物的毒性越小。

图16示出了用包含自扩增mRNA和DP为250的线性PEI(L-PEI)的组合物转染24小时后的细胞活力。与PPI获得的结果相反，N/P比不会显著影响包含大量PEI的组合物的毒性。

图17示出了用包含自扩增mRNA和DP为50/200(比率为1：4)的线性PEI和线性PPI的共聚物(L-PEI/L-PPI)的组合物转染24h后的细胞活力。对于共聚物，也是N/P比越低，组合物的毒性越小。

图18示出了用包含自扩增mRNA和DP为200/50(比率4：1)的线性PEI和线性PPI的共聚物(L-PEI/L-PPI)的组合物转染24h后的细胞活力。与PPI获得的结果相反，N/P比不会显著影响包含大量PEI的组合物的毒性。

图19示出了用包含自扩增mRNA和DP为100/150(比率2：3)的线性PEI和线性PPI的共聚物(L-PEI/L-PPI)的组合物转染24小时后的细胞活力。对于共聚物，也是N/P比越低，组合物的毒性越小。

图20示出了用包含自扩增mRNA和DP为150/100(比率3：2)的线性PEI和线性PPI的共聚物(L-PEI/L-PPI)的组合物转染24h后的细胞活力。与PPI获得的结果相反，N/P比不会显著影响包含大量PEI的组合物的毒性。

图21示出了用现有技术的转染试剂lipofectamine MessengerMax(MM)进行的转染效率的体外测试的转染结果。制备包含该脂质载体和核酸(不同比率)的组合物。由此说明的比率是μl MM：μg mRNA。还制备了仅具有缓冲液并因此不含纳米复合物的对照溶液(对照)。用MM观察到的典型转染效率在1×10

图22示出了用包含比率为2:1(μl MM：μg mRNA)的lipofectamine MessengerMax(MM)的组合物转染24小时后的细胞活力。MM显示仅具有约30％的细胞活力，相比之下，并且如图11至16所示，通过本发明的组合物可以实现高于50％、甚至接近100％的细胞活力。重要的是要注意细胞活力是在24小时转染期后测定。

体内实验

此外，我们使用包含编码荧光素酶的自扩增mRNA和DP为50/200的线性PEI和线性PPI的共聚物(L-PEI/L-PPI)的组合物在鸡中进行了体内转染实验。生物发光图像是在安乐死后不久拍摄的，因为可见的生物发光信号通常是对真实信号的低估，因为D-荧光素的发光酶促转化需要ATP，其已知在安乐死后显示快速下降。结果显示，与未注射的对照鸡相比，转染的鸡中有清晰的生物发光信号(数据未显示)。