属于乳杆菌属的新微生物、以及对青枯雷尔氏菌或假青枯雷尔氏菌引起的植物病害的防治剂及防治方法

技术领域

本发明涉及属于乳杆菌属的新微生物、以及对青枯雷尔氏菌或假青枯雷尔氏菌引起的植物病害的防治剂及防治方法。

背景技术

青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)或假青枯雷尔氏菌(Ralstoniapseudosolanacearum)感染200种以上植物，对番茄、茄子、青椒、马铃薯等的茄科(Solanaceae)植物、黄瓜等的葫芦科(Cucurbitaceae)植物、补血草(statice)、洋桔梗等的花卉等引起青枯病，对烟草等引起立枯病。青枯雷尔氏菌或假青枯雷尔氏菌引起的植物病害在全球范围内发生，经济损失也大。

作为防治植物病害的方法，例如日本特开2009-201459号公报(专利文献1)中公开了含有乳杆菌(Lactobacillus kyotoensis)FERMP-21500或除其之外还含有植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)FERMP-21501的组合物防治欧文氏菌(Erwinia carotovora)引起的软腐病的方法。J Gen Plant Pathol70：115-119(2004)(非专利文献1)中公开了通过与耐性番茄嫁接而抑制番茄感染青枯雷尔氏菌。日本特开2012-211124号公报(专利文献2)中公开了通过使番茄等对象植物吸收L-氨基酸而防治青枯病的方法。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2009-201459号公报

专利文献2：日本特开2012-211124号公报

非专利文献

非专利文献1：J Gen Plant Pathol 70：115-119(2004)

发明内容

发明要解决的课题

迄今为止，对于青枯雷尔氏菌和假青枯雷尔氏菌引起的植物病害，已尝试了使用化学熏蒸剂、杀菌剂、抗性品种或抗性诱导剂的防治。然而，化学熏蒸法由于有效范围有限，对人的毒性或对环境的负担大，因此使用有限。作为杀菌剂，可以对马铃薯的青枯病应用有效霉素(Validamycin)，但是没有报告可以对其他植物的青枯病使用的杀菌剂。使用抗性品种时，存在味道和生产性差的问题，使用砧木时，存在防治效果差的问题。使用抗性诱导剂时，存在对病害菌没有直接的杀菌活性，效果依赖于农作物品种的问题。

本发明的目的在于提供对青枯雷尔氏菌或假青枯雷尔氏菌引起的植物病害的新防治剂及防治方法。

用于解决课题的手段

本发明涉及以下例示的[1]～[14]。

[1]一种细菌，其具有包含与序列号1记载的碱基序列具有98.80％以上同一性的碱基序列的16S rRNA基因，具有甘露醇同化能力，且具有对植物病害的防治能力。

[2]一种细菌，其具有包含与序列号1记载的碱基序列具有99.90％以上同一性的碱基序列的16S rRNA基因，且具有对植物病害的防治能力。

[3]根据[1]或[2]所述的细菌，其具有包含序列号1记载的碱基序列的16S rRNA基因。

[4]一种细菌，其保藏号为NITE BP-03197、NITE BP-03198、NITE BP-03199、NITEBP-03200、NITE BP-03201或NITE BP-03202。

[5]一种[1]～[4]中任一项所述的细菌的菌体或菌体培养物或它们的提取物。

[6]一种对青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)或假青枯雷尔氏菌(Ralstonia pseudosolanacearum)引起的植物病害的防治剂，其包含[1]～[4]中任一项所述的细菌的菌体或菌体培养物或它们的提取物。

[7]一种青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)或假青枯雷尔氏菌(Ralstoniapseudosolanacearum)引起的植物病害的防治方法，其包括施用[6]所述的防治剂的工序。

[8]一种被青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)或假青枯雷尔氏菌(Ralstonia pseudosolanacearum)污染的植物、营养液、土壤、营养液栽培材料或土耕栽培材料的消毒剂，其包含[1]～[4]中任一项所述的细菌的菌体或菌体培养物或它们的提取物。

[9]一种被青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)或假青枯雷尔氏菌(Ralstonia pseudosolanacearum)污染的植物、营养液、土壤、营养液栽培材料或土耕栽培材料的消毒方法，其包括使用[8]所述的消毒剂的工序。

[10]一种青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)或假青枯雷尔氏菌(Ralstonia pseudosolanacearum)的增殖抑制剂，其包含[1]～[4]中任一项所述的细菌的菌体或菌体培养物或它们的提取物。

[11]一种青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)或假青枯雷尔氏菌(Ralstonia pseudosolanacearum)的增殖抑制方法，其包括使用[10]所述的增殖抑制剂的工序。

[12]一种植物的栽培方法，其包括在包含[1]～[4]中任一项所述的细菌的菌体或菌体培养物或它们的提取物的营养液或土壤中栽培植物的工序。

[13]一种对青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)或假青枯雷尔氏菌(Ralstonia pseudosolanacearum)引起的植物病害的防治剂，其包含属于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的细菌的菌体或菌体培养物或它们的提取物。

[14]一种青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)或假青枯雷尔氏菌(Ralstonia pseudoso1anacearum)引起的植物病害的防治方法，其包括施用[13]所述的防治剂的工序。

发明效果

根据本发明，能够防治青枯雷尔氏菌或假青枯雷尔氏菌引起的植物病害。

附图简单说明

[图1]为显示实验2中NITE BP-03197的(A)菌落形状和(B)革兰氏染色结果的图。

[图2]为显示实验3中NITE BP-03198的(A)菌落形状和(B)革兰氏染色结果的图。

[图3]为显示实验4中NITE BP-03199的(A)菌落形状和(B)革兰氏染色结果的图。

[图4]为显示实验5中NITE BP-03200的(A)菌落形状和(B)革兰氏染色结果的图。

[图5]为显示实验6中NITE BP-03201的(A)菌落形状和(B)革兰氏染色结果的图。

[图6]为显示实验7中NITE BP-03202的(A)菌落形状和(B)革兰氏染色结果的图。

[图7]为说明实验8的抗菌活性评价试验的图。

[图8]为实验8中的NITE BP-03197、NITE BP-04198、NITE BP-03199、NITE BP-03200、NITE BP-03201或NITE BP-02202的抗菌活性评价试验的结果。

[图9]为说明实验9的抗菌活性评价试验的图。

[图10]为实验9中的NITE BP-03197、NITE BP-04198、NITE BP-03199、NITE BP-03200、NITE BP-03201或NITE BP-02202的抗菌活性评价试验的结果。

[图11]为实验10中的NITE BP-03197、NITE BP-04198、NITE BP-03199、NITE BP-03200、NITE BP-03201或NITE BP-02202的抗菌活性评价试验的结果。

[图12]为说明实验11的抗菌活性评价试验的图。

[图13]为实验11中的NITE BP-03197、NITE BP-04198、NITE BP-03199、NITE BP-03200、NITE BP-03201或NITE BP-02202的抗菌活性评价试验的结果。

[图14]为显示实验13中NITE BP-03201的培养上清液对青枯病的防治效果的图形。

[图15]为显示实验13中NITE BP-03199或NITE BP-03200的培养上清液对青枯病的防治效果的图形。

发明的具体实施方式

以下，对用于实施本发明的方式进行详细说明。需要说明的是，本发明并不限于以下实施方式。

[属于乳杆菌属的微生物]

本发明的一个实施方式涉及的细菌a，具有包含与序列号1记载的碱基序列具有98.80％以上同一性的碱基序列的16S rRNA基因，具有甘露醇同化能力，且具有对植物病害的防治能力。

细菌a优选具有包含与序列号1记载的碱基序列具有99.00％以上、99.20％以上、99.50％以上、99.80％以上或99.90％以上同一性的碱基序列的16S rRNA基因。细菌a可以具有包含序列号1记载的碱基序列的16SrRNA基因。作为具有包含与序列号1记载的碱基序列具有98.80％以上同一性的碱基序列的16S rRNA基因的细菌，可举出属于乳杆菌(Lactobacillus)属的细菌(乳酸菌)。

细菌a可以具有包含与序列号1记载的碱基序列相比，发生了1个碱基或数个碱基的取代、缺失或添加的碱基序列的16S rRNA基因。1个碱基或数个碱基例如可以为1～18个碱基，优选为1～10个碱基，更优选为1～5个碱基。

细菌a可以具有如下16S rRNA基因，该16S rRNA基因包含序列号1记载的碱基序列中所包含的约15个碱基以上，优选为约18～约500个碱基，更优选为约18～约200个碱基，进一步优选为约18～约50个碱基连续的序列或在严格条件下与其互补序列进行杂交的碱基序列。严格的条件是指不形成非特异性杂交的条件，例如可举出在60℃、1×SSC、0.1％SDS，优选在68℃、0.1×SSC、0.1％SDS中清洗1次以上的条件等。

在本说明书中，16S rRNA基因的碱基序列的分析可以通过例如以下方法进行。首先，使用公知的方法从对象微生物提取基因组DNA并扩增16S rRNA基因。作为扩增16S rRNA基因的方法，没有特别限制，可举出本领域技术人员通常使用的使用了通用引物的PCR法等。可以将通过PCR法得到的扩增产物根据需要纯化，供于DNA测序仪等而确定碱基序列。进行得到的碱基序列与序列号1记载的序列的比较。

在本说明书中，16S rRNA基因优选为细菌本来具有的内源性16SrRNA基因，但也可以是人工突变的16S rRNA基因。16S rRNA基因的突变为不丢失16S rRNA的表达及功能的突变。

细菌a具有甘露醇同化能力。甘露醇同化能力可以基于在微生物鉴定试验中通常进行的糖同化能力试验而判断。例如，在厌氧环境下使用包含甘露醇的培养基培养对象微生物，发生发酵时，可以判断微生物具有甘露醇同化能力。在糖同化能力试验中，可以使用市售的试剂盒，例如可以使用API50CHB(bioMerieux公司制，法国)。

细菌a具有对植物病害的防治能力。对植物病害的防治能力包括预防病原微生物感染植物、预防植物病害、防止植物病害扩大、病害微生物的杀灭、降解和增殖抑制。

在本说明书中，植物病害例如为青枯雷尔氏菌或假青枯雷尔氏菌引起的植物病害。感染青枯雷尔氏菌或假青枯雷尔氏菌的植物会引起青枯病或立枯病并枯死。

对象微生物是否具有对植物病害的防治能力，例如可以通过在对象微生物的存在下培养病害微生物的方法或在对象微生物的菌体培养物的存在下培养病害微生物的方法而验证。如果在上述条件下病害微生物被杀灭或增殖被抑制，则可以判断对象微生物具有对植物病害的防治能力。在植物病害的病原菌的存在下，栽培植物，通过对象微生物，病害微生物对植物的感染被抑制或疾病的发病被抑制，即使在这种情况下，也可以判断对象微生物具有对植物病害的防治能力。

本发明的一个实施方式涉及的细菌b，具有包含与序列号1记载的碱基序列具有99.90％以上同一性的碱基序列的16S rRNA基因，且具有对植物病害的防治能力。细菌b可以具有包含序列号1记载的碱基序列的16SrRNA基因。作为具有包含与序列号1记载的碱基序列具有99.90％以上同一性的碱基序列的16S rRNA基因的细菌，可举出属于乳杆菌属的细菌(乳酸菌)。

细菌b可以具有包含与序列号1记载的碱基序列相比，发生了1个碱基的缺失或添加的碱基序列的16S rRNA基因。

细菌b可以具有如下16S rRNA基因，该16S rRNA基因包含序列号1记载的碱基序列中所包含的约15个碱基以上，优选为约18～约500个碱基，更优选为约18～约200个碱基，进一步优选为约18～约50个碱基连续的序列或在严格条件下与其互补序列进行杂交的碱基序列。严格的条件是指不形成非特异性杂交的条件，例如可举出在60℃、1×SSC、0.1％SDS，优选在68℃、0.1×SSC、0.1％SDS中清洗1次以上的条件等。

细菌b具有对植物病害的防治能力。植物病害例如为青枯雷尔氏菌或假青枯雷尔氏菌引起的植物病害。对植物病害的防治能力可以通过上述方法进行评价。

作为细菌a和细菌b的代表性菌，可举出乳杆菌属物种(Lactobacillus sp.)SC-2001。乳杆菌属物种(Lactobacillus sp.)SC-2001是与马里乳杆菌(Lactobacillus mali)近缘的乳杆菌属的新分离株。乳杆菌属物种(Lactobacillus sp.)SC-2001作为保藏号NITEBP-03197(原保藏日：2020年4月9日)，基于布达佩斯条约国际保藏于独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心(NPMD，地址：邮政编码292-0818千叶县木更津市上总镰足2-5-8122号室)。关于该菌株的细菌学性质，示于后述表1、表2和图1中。

包括细菌a和细菌b的乳杆菌属乳酸菌存在于自然环境中，因此认为其作为食品和饲料安全性高。细菌a和细菌b可以是分离的细菌。细菌a和细菌b可以是相同的细菌。

本发明的一个实施方式涉及的细菌c可以是作为保藏号NITEBP-03198(原保藏日：2020年4月9日)、保藏号NITEBP-03199(原保藏日：2020年4月9日)、保藏号NITEBP-03200(原保藏日：2020年4月9日)、保藏号NITEBP-03201(原保藏日：2020年4月9日)及保藏号NITEBP-03202(原保藏日：2020年4月9日)，基于布达佩斯条约国际保藏于独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心(NPMD，地址：邮政编码292-0818千叶县木更津市上总镰足2-5-8122号室)的细菌中的任一种。细菌c均是属于植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)的细菌。关于该菌株的细菌学性质，示于后述表3～表12和图2～图6中。

细菌c具有对植物病害的防治能力。植物病害例如为青枯雷尔氏菌或假青枯雷尔氏菌引起的植物病害。对植物病害的防治能力可以通过上述方法进行评价。另外，认为细菌c所属的植物乳杆菌具有对青枯雷尔氏菌或假青枯雷尔氏菌引起的植物病害的防治能力。

包括细菌c的乳杆菌属乳酸菌存在于自然环境中，因此认为其作为食品和饲料安全性高。细菌c可以是分离的细菌。

[细菌的菌体或菌体培养物或它们的提取物]

本发明的一个实施方式涉及的细菌的菌体是细菌a、细菌b和细菌c中任一种细菌的菌体。菌体可以是从环境中分离的菌体，也可以是培养的菌体。菌体可以是死菌也可以是活菌。菌体可以是存在于培养液、缓冲液等中的菌体，也可以是将它们浓缩并除去液体的菌体或其冷冻干燥物。细菌a、细菌b和细菌c的菌体分别具有对植物病害的防治能力。

本发明的一个实施方式涉及的细菌的菌体培养物是细菌a、细菌b和细菌c中任一种细菌的菌体培养物。菌体培养物包含细菌的分泌物、代谢物等，包括细菌中产生的肽、蛋白质、糖、酶、有机酸和包含它们的培养基(液体培养基和固体培养基)。菌体培养物可以是培养细菌的上清液。培养上清液例如可以通过离心分离、过滤操作等从培养细菌的液体培养基中除去细菌而得到。细菌a、细菌b和细菌c的菌体培养物分别具有对植物病害的防治能力。

细菌a、细菌b和细菌c可以按照属于乳杆菌属的细菌的常规培养方法进行培养。作为代表性方法，可举出使用MRS(de Man、Rogosa和Sharpe)液体培养基或MRS琼脂培养基在温度30℃下进行培养的方法。

本发明的一个实施方式涉及的提取物是细菌a、细菌b和细菌c中任一种细菌的菌体或菌体培养物的提取物。提取物是以不丧失细菌的菌体或菌体培养物所具有的对植物病害的防治能力的方式制备的。提取物例如可以通过对细菌的菌体或菌体培养物进行超声波破碎、珠磨、冷冻融解、化学溶解等处理而得到。提取物也可以通过对菌体或菌体培养物进行盐析、超滤、离子交换层析或使用有机溶剂的液相提取而得到。这些处理可以适当组合进行。提取物可以包含细菌的菌体片段、核酸、肽、蛋白质和酶。

[对青枯雷尔氏菌或假青枯雷尔氏菌引起的植物病害的防治剂及防治方法]

在本说明书中，细菌的菌体或菌体培养物或它们的提取物也记为“菌体制备物”。菌体制备物可以是选自由细菌的菌体和菌体培养物以及它们的提取物组成的组中的任一种，也可以是多种。本发明的一个实施方式涉及的防治剂包含细菌a～c中任一种的菌体制备物。本发明的一个实施方式涉及的防治剂包含属于植物乳杆菌的细菌(以下也称为“细菌d”。)的菌体制备物。防治剂可以包含选自由细菌a～d组成的组中的两种以上菌体制备物。本发明涉及的防治剂具有对青枯雷尔氏菌或假青枯雷尔氏菌引起的植物病害的防治能力。防治能力可以通过上述方法进行评价。

防治剂的形态可以是通常的农药可采取的固体、液体或气体状的形态，例如粉剂、DL(Driftless)粉剂、粒剂、片剂、水合剂、颗粒水合剂、干悬浮剂、乳剂、液剂、油剂、微囊、悬浮剂、乳液(emulsion)、微乳液(microemulsion)、AL(applicable liquid)剂、熏蒸剂等，没有特别限定，可以制备成任意的剂型，可以根据目的使用。

防治剂在制剂化时可以包含载体、防凝集剂、防降解剂、增量剂、分散剂、结合材料、崩解剂、表面活性剂。作为固体载体，可以使用硅藻土、蛭石、粘土、滑石、膨润土、珍珠岩、白炭、谷壳、骨粉、碳酸钙等。作为液体载体，可举出水、醇类、酮类(丙酮、甲乙酮、环己酮等)、芳香族烃类(例如苯、甲苯、二甲苯、乙苯、甲基萘)、脂肪族烃类(正己烷、灯油等)、酯类、腈类、醚类、酰胺类、卤代烃类。作为气体状载体，可举出LPG、空气、氮、二氧化碳气体、二甲醚等。

作为表面活性剂或分散剂，可以使用烷基硫酸酯类、烷基(芳基)磺酸盐类、聚氧化烯烷基(芳基)醚类、多元醇酯类、木质素磺酸盐等。

防治剂只要不丧失对青枯雷尔氏菌或假青枯雷尔氏菌引起的植物病害的防治能力，可以包含细菌a～d以外的微生物、化学防治物质等。

本发明涉及的防治剂对环境的负担小，对人的毒性也少。认为本发明涉及的防治剂不依赖于农作物的品种，对植物病害微生物具有直接抗菌作用。根据本发明涉及的防治剂，能够实现稳定的农产品生产。

本发明的一个实施方式是在对青枯雷尔氏菌或假青枯雷尔氏菌引起的植物病害的防治剂的制备中的选自由细菌a～d组成的组中至少一种的菌体制备物的应用。

本发明的一个实施方式涉及的防治方法包括施用上述防治剂的工序。根据本发明涉及的防治方法，能够防治青枯雷尔氏菌或假青枯雷尔氏菌引起的植物病害。

作为施用防治剂的工序的例子，可举出向植物施用液体的防治剂的工序。向植物施用液体的防治剂的工序中，包括向植物的种子喷射或浸渍防治剂等、对种子施用防治剂的工序。向植物施用液体的防治剂的工序中，还包括在防治剂中浸渍种植前的苗、从苗生长的植物的根部等的工序，向根、叶、茎等喷射防治剂的工序等。

作为施用防治剂的工序的其他例子，可举出向营养液或土壤施用液体的防治剂的工序。向营养液施用液体的防治剂的工序中，包括向营养液添加防治剂或用营养液稀释防治剂的工序。向土壤施用液体的防治剂的工序中，包括向土壤喷射、散布或灌注防治剂的工序。防治剂向土壤中的施用可以在植物的种植前或种子的播种前进行，也可以在种植后或播种后进行。

作为施用防治剂的工序的其他例子，可举出向植物施用粉末或粒状防治剂的工序。向植物施用粉末或粒状防治剂的工序中，包括使粉末或粒状防治剂附着于种子表面的工序、将粉末或粒状防治剂与种子混合而播种的工序等对种子进行施用的工序。

作为施用防治剂的工序的其他例子，可举出向营养液或土壤施用粉末或粒状防治剂的工序。向营养液施用粉末或粒状防治剂的工序中，包括使防治剂散布或分散在营养液中的工序。向土壤施用粉末或粒状防治剂的工序中，包括将粉末或粒状防治剂混入土壤中的工序、在土壤上散布的工序等。

固体或液体的防治剂可以用水或营养液悬浮或稀释而施用。向营养液施用防治剂时，防治剂优选包含选自由细菌a～d组成的组中至少一种的菌体和/或菌体培养物。向土壤施用防治剂时，防治剂优选包含选自由细菌a～d组成的组中至少一种的菌体和/或菌体培养物，更优选包含选自由细菌a～d组成的组中至少一种的活菌。防治剂的施用可以进行多次，也可以组合上述多个工序进行。

施用防治剂的工序在不丧失防治能力的条件下进行即可，例如，可以在温度为20～40℃的条件下进行，也可以在25～30℃的条件下进行。另外，可以在pH为3.0～8.0的条件下进行，也可以在4.0～6.0的条件下进行。

防治剂中的细菌a～d的合计浓度没有特别限定，可以是1×10

在本说明书中，植物为产生青枯雷尔氏菌或假青枯雷尔氏菌引起的病害的植物。这种植物例如是农园艺用植物，具体而言，可举出茄科(Solanaceae)植物、葫芦科(Cucurbitaceae)植物、十字花科(Brassicaceae)植物、姜科(Zingiberaceae)植物、蔷薇科(Rosaceae)植物、菊科(Asteraceae)植物、豆科(Leguminosae)植物、芭蕉科(Musaceae)植物、唇形科(Labiatae)植物、桃金娘科(Myrtaceae)植物、胡麻科(Pedaliaceae)植物、桑科(Moraceae)植物、旅人蕉科(Strelitziaceae)植物、大戟科(Euphorbiaceae)植物、蓝雪科(Plumbaginaceae)植物、龙胆科(Gentianaceae)植物。作为茄科植物，可举出番茄、茄子、青椒、甜青椒、辣椒、红辣椒、土豆、烟草等。作为葫芦科植物，可举出黄瓜、南瓜、苦瓜、西瓜、甜瓜、西葫芦等。作为十字花科植物，可举出萝卜、芜菁、油菜、青梗菜、小松菜、花椰菜、西兰花、甘蓝等。作为姜科植物，可举出生姜、蘘荷等。作为蔷薇科植物，可举出草莓等。作为菊科植物，可举出茼蒿、莴苣等。作为豆科植物，可举出花生、菜豆、蚕豆、豌豆、大豆等。作为芭蕉科植物，可举出香蕉、芭蕉等。作为唇形科植物，可举出紫苏、罗勒等。作为桃金娘科植物，可举出丁香等。作为胡麻科植物，可举出芝麻等。作为桑科植物，可以举出桑树等。作为旅人蕉科植物，可举出鹤望兰等。作为大戟科植物，可举出木薯等。作为蓝雪科植物，可举出补血草等。作为龙胆科植物，可举出洋桔梗等。作为植物种类的具体例示，主要举出了农作物用植物，但植物也可以是花卉用植物。

本发明的一个实施方式是用于防治青枯雷尔氏菌或假青枯雷尔氏菌引起的植物病害的上述防治剂的应用。本发明的一个实施方式是用于防治青枯雷尔氏菌或假青枯雷尔氏菌引起的植物病害的选自由细菌a～d组成的组中至少一种的菌体制备物的应用。

[被青枯雷尔氏菌或假青枯雷尔氏菌污染的植物、营养液、土壤、营养液栽培材料或土耕栽培材料的消毒剂和消毒方法]

本发明的一个实施方式涉及的消毒剂包含细菌a～c中任一种的菌体制备物。本发明的一个实施方式涉及的消毒剂包含细菌d的菌体制备物。消毒剂可以包含选自由细菌a～d组成的组中的两种以上菌体制备物。本发明涉及的消毒剂，可以消毒被青枯雷尔氏菌或假青枯雷尔氏菌污染的植物、营养液、土壤、营养液栽培材料或土耕栽培材料。如果使用被消毒了的植物、营养液、土壤、营养液栽培材料或土耕栽培材料，栽培植物，则可以抑制青枯雷尔氏菌或假青枯雷尔氏菌引起的植物病害的发生。本发明涉及的消毒剂还具有作为对青枯雷尔氏菌或假青枯雷尔氏菌的杀菌剂的效果。

消毒剂的效果可以通过如下方法进行评价，该方法中，在本发明涉及的消毒剂的存在下，培养青枯雷尔氏菌或假青枯雷尔氏菌，验证青枯雷尔氏菌或假青枯雷尔氏菌是否被杀灭、降解或增殖被抑制。

消毒剂可以使用与上述防治剂相同的消毒剂。消毒剂可以包含用于消毒其他病害微生物的物质等。

植物包含种子、苗、根、块茎、球根、根茎和茎叶部(包含花)。从防止感染病害菌的观点出发，对植物的苗、根等的消毒是特别有用的。

营养液栽培是不使用土，将植物生长所需的营养水分作为液肥(营养液)提供的栽培方法。作为营养液栽培的代表性例子，可举出在营养液中生根的水耕、在代替土的固体培养基种植作物的固体培养基耕、向根喷射营养液的喷射耕。营养液包含氮(N)、磷酸(P

土耕栽培是使用土壤的栽培方法。土壤还包括播种用培土、育苗用培土、砂、轻石、农场的土等。作为土耕栽培材料，包括花盆、育苗盆、栽培板、栽培容器、散布机、灌水管、小农具(修剪剪刀、温度计、湿度计等)等。

本发明的一个实施方式是在被青枯雷尔氏菌或假青枯雷尔氏菌污染的植物、营养液、土壤、营养液栽培材料或土耕栽培材料的消毒剂或杀菌剂的制备中的选自由细菌a～d组成的组中至少一种的菌体制备物的应用。

本发明的一个实施方式涉及的消毒方法包括使用上述消毒剂的工序。根据本发明涉及的消毒方法，可以消毒被青枯雷尔氏菌或假青枯雷尔氏菌污染的植物、营养液、土壤、营养液栽培材料和土耕栽培材料。

消毒剂在被青枯雷尔氏菌或假青枯雷尔氏菌污染或有其可能性的植物、营养液、土壤、营养液栽培材料或土耕栽培材料中使用即可。在对土壤、营养液、植物进行消毒的方法中，使用消毒剂的工序可以与施用上述防治剂的工序同样地进行。在对营养液栽培材料或土耕栽培材料进行消毒的方法中，使用消毒剂的工序包括例如将液体消毒剂或者被稀释或悬浮的消毒剂向营养液栽培材料或土耕栽培材料喷射、散布或使营养液栽培材料或土耕栽培材料浸渍于消毒剂中的工序。使用消毒剂的工序可以与土壤熏蒸法等公知的植物、营养液、土壤、营养液栽培材料或土耕栽培材料的消毒方法等同时进行。

消毒剂中的细菌a～d的合计浓度没有特别限定，可以是1×10

本发明的一个实施方式是用于消毒或杀菌被青枯雷尔氏菌或假青枯雷尔氏菌污染的植物、营养液、土壤、营养液栽培材料或土耕栽培材料的上述消毒剂的应用。本发明的一个实施方式是用于消毒或杀菌被青枯雷尔氏菌或假青枯雷尔氏菌污染的植物、营养液、土壤、营养液栽培材料或土耕栽培材料的选自由细菌a～d组成的组中至少一种的菌体制备物的应用。

[青枯雷尔氏菌或假青枯雷尔氏菌的增殖抑制剂和增殖抑制方法]

本发明的一个实施方式涉及的增殖抑制剂包含细菌a～c中任一种的菌体制备物。本发明的一个实施方式涉及的增殖抑制剂包含细菌d的菌体制备物。增殖抑制剂可以包含选自由细菌a～d组成的组中的两种以上菌体制备物。本发明涉及的增殖抑制剂，能够抑制青枯雷尔氏菌或假青枯雷尔氏菌的增殖。如果抑制青枯雷尔氏菌或假青枯雷尔氏菌的增殖，则抑制由这些引起的植物病害的发生。

增殖抑制剂可以使用与上述防治剂相同的增殖抑制剂。增殖抑制剂可以包含抑制其他病害微生物的增殖的物质等。

增殖抑制剂的效果可以通过如下方法进行评价，该方法中，在增殖抑制剂的存在下，培养青枯雷尔氏菌或假青枯雷尔氏菌，验证青枯雷尔氏菌或假青枯雷尔氏菌的增殖是否被抑制。

本发明的一个实施方式是在青枯雷尔氏菌或假青枯雷尔氏菌的增殖抑制剂的制备中的选自由细菌a～d组成的组中至少一种的菌体制备物的应用。

本发明的一个实施方式涉及的增殖抑制方法包括使用上述增殖抑制剂的工序。根据本发明涉及的增殖抑制方法，能够抑制青枯雷尔氏菌或假青枯雷尔氏菌的增殖，能够抑制青枯雷尔氏菌或假青枯雷尔氏菌引起的植物病害的发生。

作为使用增殖抑制剂的工序，没有特别限定，以增殖抑制剂与青枯雷尔氏菌或假青枯雷尔氏菌接触或接近的方式使用增殖抑制剂即可。增殖抑制剂可以用与上述防治剂相同的方法使用。

增殖抑制剂中的细菌a～d的合计浓度没有特别限定，可以是1×10

本发明的一个实施方式是用于抑制青枯雷尔氏菌或假青枯雷尔氏菌的增殖的上述增殖抑制剂的应用。本发明的一个实施方式是用于抑制青枯雷尔氏菌或假青枯雷尔氏菌的增殖的选自由细菌a～d组成的组中至少一种的菌体制备物的应用。

[植物的栽培方法]

本发明的一个实施方式涉及的植物栽培方法，包括在包含选自由细菌a～c组成的组中至少一种细菌的菌体制备物的营养液或土壤中栽培植物的工序。根据本发明涉及的植物栽培方法，能够抑制青枯雷尔氏菌或假青枯雷尔氏菌引起的植物病害。

使选自由细菌a～c组成的组中至少一种细菌的菌体制备物含在营养液或土壤中的方法，没有特别限定，可以采用与上述的防治剂的施用方法相同的方法。选自由细菌a～c组成的组中至少一种细菌的菌体制备物可以作为上述的防治剂包含在营养液或土壤中。

植物栽培方法是营养液栽培或土壤栽培。植物栽培方法例如包括准备营养液或土壤的工序、进行播种的工序、照射光的工序、进行间苗的工序、使植物生长的工序。可以在这些中的至少一部分工序中，使用包含选自由细菌a～c组成的组中至少一种细菌的菌体制备物的营养液或土壤，也可以在所有工序中使用。

本发明的一个实施方式是在营养液或土壤中栽培植物的方法中的上述防治剂的应用。本发明的一个实施方式是在营养液或土壤中栽培植物的方法中的选自由细菌a～d组成的组中至少一种的菌体制备物的应用。

实施例

以下，举出实施例对本发明进行更详细说明，但本发明并不限于这些实施例。

[实验1：新微生物的分离]

将分离源(袍栎)与灭菌水一起磨碎。将磨碎液适当稀释，添加到1/2MRS液体培养基中，进行富集培养。将富集培养液涂布在含有碳酸钙的MRS琼脂培养基，分离形成了光晕的微生物。以下，将该分离株称为分离株A。在过氧化氢中悬浮分离株A的培养液时，并没有产生气泡。由于分离株A不具有过氧化氢酶活性，因此确认到其是乳酸菌。

[实验2：分离株A的鉴定]

通过16S rRNA基因分析、形态观察及生理·生化学性状试验，鉴定分离株A。

(1)16S rRNA基因分析

从分离株A提取基因组DNA，将得到的基因组DNA作为模板，使用克隆用正向引物9F和克隆用反向引物1510R(中川恭好他：基因分析法16SrRNA基因的碱基序列确定法，日本放线菌学会编，放线菌的分类和鉴定，88-117pp.日本学会事务中心，2001)，进行16S rRNA基因的PCR扩增。PCR扩增使用Tks Gflex DNA聚合酶(Takara Bio公司制)进行，对PCR后的扩增产物进行纯化。

使用经纯化的PCR后的扩增产物，进行循环测序反应。循环测序反应使用BigDye终止子v3.1循环测序试剂盒进行。将得到的反应液纯化，对纯化液进行DNA测序分析(3130×1DNA分析仪)，确定了从分离株A提取的模板DNA的16S rRNA基因的碱基序列(序列号1)。作为测序分析用引物，使用9F、515F、1099F、536R、926R、1510R(中川恭好他：基因分析法16SrRNA基因的碱基序列确定法，日本放线菌学会编，放线菌的分类和鉴定，88-117pp.日本学会事务中心，2001)。

使用微生物鉴定系统“ENKI”(TechnoSuruga Laboratory公司制)，在微生物鉴定数据库DB-BA15.0(TechnoSuruga Laboratory公司制)、国际碱基序列数据库(DDBJ/ENA(EMBL)/GenBank)上，对分离株A的16S rRNA基因的碱基序列进行BLAST同源性检索时，相对于马里乳杆菌(Lactobacillus mali，NBRC 102159)的16S rRNA基因的碱基序列同一性显示为99.87％，相对于可可乳杆菌(Lactobacillus cacaonum，LMG24285)的16S rRNA基因的碱基序列同一性显示为98.72％，相对于乳杆菌(Lactobacillus aquatius，IMCC1736)的16S rRNA基因的碱基序列同一性显示为97.58％。但是，并没有存在具有与分离株A的16SrRNA基因的碱基序列完全一致的16SrRNA基因的微生物。

(2)形态观察及生理·生化学性状试验

在MRS琼脂培养基涂布分离菌A，在温度30℃下好氧培养48小时，用以下方法观察细胞形态、革兰氏染色性、运动性和菌落形态。使用API50CHB试剂盒(bioMerieux公司制，法国)，检查细菌的生理·生化学性状反应。

利用立体显微镜SMZ800N(尼康公司制)进行菌落观察，利用光学显微镜BX50F4(Olympus公司制)进行形态观察，基于Barrow&Feltham(Cowan and Steel′s Manual forthe Identification of Medical Bacteria，3rd ed.Cambridge：Cambridge UniversityPress；1993.)中所记载的方法，对过氧化氢酶反应、氧化酶反应、来自葡萄糖的酸/气体产生及葡萄糖的氧化/发酵(O/F)进行试验。在革兰氏染色中使用了Favor G“NISSUI”(日水制药公司制)。如图1(A)所示，分离株A形成了圆形的菌落。如图1(B)所示，分离株A的革兰氏染色性为阳性。分离株A的生理·生化学性状试验及发酵性试验的结果如表1及表2所示。分离株A为呈运动性的革兰氏阳性杆菌，发酵葡萄糖，过氧化氢酶反应和氧化酶反应显示阴性。这些性状与通过16SrDNA部分碱基序列分析而示出归属的乳杆菌(Lactobacillus)属的性状一致。使用API CHL50试剂盒进行发酵性试验的结果是，分离株A发酵果糖、甘露糖、甘露醇及水杨苷等，不发酵半乳糖、乳糖等。另外，在15℃下生长，没有显示精氨酸二氢酶活性。这些性状与马里乳杆菌(Lactobacillus mali)的性状几乎一致，16SrDNA部分碱基序列分析的结果，启示两者近缘，但在发酵甘露醇的点上不同(Hammes WP and HertelC.Lactobacillus.In：Whitman WB，Rainey F，KampferP，Trujillo M，Chun J et al.(editors).Bergey′s Manual of Systematics of Archaea and Bacteria.Chichester：John Wiley&Sons；2015.doi：10.1002/9781118960608.gbm00604)。如上所述，分离株A包含于乳杆菌(Lactobacillus)属中，在已知种中与马里乳杆菌(Lactobacillus mali)最为近缘，但16SrDNA碱基序列分析及生理·生化学性状试验的结果，启示分离株A与马里乳杆菌(Lactobacillus mali)略有不同，因此可知其为与马里乳杆菌(Lactobacillus mali)近缘的新分离株。将分离株A命名为乳杆菌属物种(Lactobacillus sp.)SC-2001，作为NITE BP-03197国际保藏。

[表1]

+：阳性、-：阴性

[表2]

+：阳性、-：阴性

[实验3：分离株B的分离和鉴定]

作为分离源，使用咸墨鱼，除此之外，通过与实验1相同的方法分离分离株B。分离株B的鉴定通过与实验2相同的方法进行。

分离株B的16S rRNA基因的碱基序列，相对于戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus，JCM1558)的16S rRNA基因的碱基序列同一性显示为99.87％，相对于植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarumsub sp.plantarum，JCM1149)的16S rRNA基因的碱基序列同一性显示为99.87％，相对于类植物乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum，DSM10667)的16S rRNA基因的碱基序列同一性显示为99.73％。但是，并没有存在具有与分离株B的16S rRNA基因的碱基序列完全一致的16S rRNA基因的微生物。

如图2(A)所示，分离株B形成了圆形的菌落。如图2(B)所示，分离株B的革兰氏染色性为阳性。分离株B的生理·生化学性状试验及发酵性试验的结果如表3及表4所示。分离株B为不呈运动性的革兰氏阳性杆菌，不形成芽孢，过氧化氢酶反应和氧化酶反应显示阴性，发酵葡萄糖。这些性状与通过16SrDNA部分碱基序列分析而示出归属可能性的乳杆菌(Lactobacillus)属的性状一致。使用API试剂盒进行发酵性试验的结果是，分离株B发酵半乳糖、果糖和松三糖等，不发酵甘油、D-木糖等。另外，没有显示精氨酸二氢酶活性，在15℃下生长。这些性状与通过16SrDNA部分碱基序列分析而启示归属的戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中的植物乳杆菌的性状一致，在不显示甘油和D-木糖的发酵的点上，与戊糖乳杆菌不同。因此可知，分离株B是属于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的新分离株。将分离株B作为NITE BP-03198国际保藏。

[表3]

+：阳性、-：阴性

[表4]

+：阳性、-：阴性

[实验4：分离株C的分离和鉴定]

作为分离源，使用莲雾，除此之外，通过与实验1相同的方法分离分离株C。分离株C的鉴定通过与实验2相同的方法进行。

分离株C的16S rRNA基因的碱基序列，相对于戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus，JCM1558)的16S rRNA基因的碱基序列同一性显示为100.0％，相对于植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarumsub sp.plantarum，JCM1149)的16S rRNA基因的碱基序列同一性显示为100.0％，相对于类植物乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum，DSM10667)的16S rRNA基因的碱基序列同一性显示为99.80％。

如图3(A)所示，分离株C形成了圆形的菌落。如图3(B)所示，分离株C的革兰氏染色性为阳性。分离株C的生理·生化学性状试验及发酵性试验的结果如表5及表6所示。分离株C为不呈运动性的革兰氏阳性杆菌，不形成芽孢，过氧化氢酶反应和氧化酶反应显示阴性，发酵葡萄糖。这些性状与通过16SrDNA部分碱基序列分析而示出归属可能性的乳杆菌(Lactobacillus)属的性状一致。使用API试剂盒进行发酵性试验的结果是，分离株C发酵半乳糖、果糖、α-甲基-D-甘露糖苷和松三糖等，不发酵甘油、D-木糖等。另外，没有显示精氨酸二氢酶活性，在15℃下生长。这些性状与通过16SrDNA部分碱基序列分析而启示归属的戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中的植物乳杆菌的性状一致，在不显示甘油和D-木糖的发酵的点上，与戊糖乳杆菌不同。因此可知，分离株C是属于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的新分离株。将分离株C作为NITEBP-03199国际保藏。

[表5]

+：阳性、-：阴性

[表6]

+：阳性、-：阴性

[实验5：分离株D的分离和鉴定]

作为分离源，使用露兜树(Pandanus odoratissimus)，除此之外，通过与实验1相同的方法分离分离株D。分离株D的鉴定通过与实验2相同的方法进行。

分离株D的16S rRNA基因的碱基序列，相对于戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus，JCM1558)的16S rRNA基因的碱基序列同一性显示为99.87％，相对于植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarumsub sp.plantarum，JCM1149)的16S rRNA基因的碱基序列同一性显示为99.87％，相对于类植物乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum，DSM10667)的16S rRNA基因的碱基序列同一性显示为99.66％。但是，并没有存在具有与分离株D的16S rRNA基因的碱基序列完全一致的16S rRNA基因的微生物。

如图4(A)所示，分离株D形成了圆形的菌落。如图4(B)所示，分离株D的革兰氏染色性为阳性。分离株D的生理·生化学性状试验及发酵性试验的结果如表7及表8所示。分离株D为不呈运动性的革兰氏阳性杆菌，不形成芽孢，过氧化氢酶反应和氧化酶反应显示阴性，发酵葡萄糖。这些性状与通过16SrDNA部分碱基序列分析而示出归属可能性的乳杆菌(Lactobacillus)属的性状一致。使用API试剂盒进行发酵性试验的结果是，分离株B发酵半乳糖、果糖、α-甲基-D-甘露糖苷和松三糖等，不发酵甘油、D-木糖等。另外，没有显示精氨酸二氢酶活性，在15℃下生长。这些性状与通过16SrDNA部分碱基序列分析而示出近缘的戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中的植物乳杆菌的性状一致，在不显示甘油和D-木糖的发酵的点上，与戊糖乳杆菌不同。因此可知，分离株D是属于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的新分离株。将分离株D作为NITEBP-03200国际保藏。

[表7]

+：阳性、-：阴性

[表8]

+：阳性、-：阴性

[实验6：分离株E的分离和鉴定]

作为分离源，使用杂色榕(Ficus variegata)，除此之外，通过与实验1相同的方法分离分离株E。分离株E的鉴定通过与实验2相同的方法进行。

分离株E的16S rRNA基因的碱基序列，相对于戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus，JCM1558)的16S rRNA基因的碱基序列同一性显示为99.93％，相对于植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarumsub sp.plantarum，JCM1l49)的16S rRNA基因的碱基序列同一性显示为99.93％，相对于类植物乳杆菌(Lactobaci1lus paraplantarum，DSM10667)的16S rRNA基因的碱基序列同一性显示为99.73％。但是，并没有存在具有与分离株E的16S rRNA基因的碱基序列完全一致的16S rRNA基因的微生物。

如图5(A)所示，分离株E形成了圆形的菌落。如图5(B)所示，分离株E的革兰氏染色性为阳性。分离株E的生理·生化学性状试验及发酵性试验的结果如表9及表10所示。分离株E为不呈运动性的革兰氏阳性杆菌，不形成芽孢，过氧化氢酶反应和氧化酶反应显示阴性，发酵葡萄糖。这些性状与通过16SrDNA部分碱基序列分析而示出归属可能性的乳杆菌(Lactobacillus)属的性状一致。使用API试剂盒进行发酵性试验的结果是，分离株E发酵半乳糖、果糖和松三糖等，不发酵甘油、D-木糖等。另外，没有显示精氨酸二氢酶活性，在15℃下生长。这些性状与通过16SrDNA部分碱基序列分析而启示归属的戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中的植物乳杆菌的性状一致，在不显示甘油和D-木糖的发酵的点上，与戊糖乳杆菌不同。因此可知，分离株E是属于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的新分离株。将分离株E作为NITE BP-03201国际保藏。

[表9]

+：阳性、-：阴性

[表10]

+：阳性、-：阴性

[实验7：分离株F的分离和鉴定]

作为分离源，使用松果，除此之外，通过与实验1相同的方法分离分离株F。分离株F的鉴定通过与实验2相同的方法进行。

分离株F的16S rRNA基因的碱基序列，相对于戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus，JCM1558)的16S rRNA基因的碱基序列同一性显示为99.93％，相对于植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarumsub sp.plantarum，JCM1149)的16S rRNA基因的碱基序列同一性显示为99.93％，相对于类植物乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum，DSM10667)的16S rRNA基因的碱基序列同一性显示为99.73％。但是，并没有存在具有与分离株F的16S rRNA基因的碱基序列完全一致的16S rRNA基因的微生物。

如图6(A)所示，分离株F形成了圆形的菌落。如图6(B)所示，分离株F的革兰氏染色性为阳性。分离株F的生理·生化学性状试验及发酵性试验的结果如表11及表12所示。分离株F为不呈运动性的革兰氏阳性杆菌，不形成芽孢，过氧化氢酶反应和氧化酶反应显示阴性，发酵葡萄糖。这些性状与通过16SrDNA部分碱基序列分析而示出归属可能性的乳杆菌(Lactobacillus)属的性状一致。使用API试剂盒进行发酵性试验的结果是，分离株F发酵半乳糖、果糖、α-甲基-D-甘露糖苷和松三糖等，不发酵甘油、D-木糖等。另外，没有显示精氨酸二氢酶活性，在15℃下生长。这些性状与通过16SrDNA部分碱基序列分析而启示归属的戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中的植物乳杆菌的性状一致，在不显示甘油和D-木糖的发酵的点上，与戊糖乳杆菌不同。因此可知，分离株F是属于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的新分离株。将分离株F作为NITEBP-03202国际保藏。

[表11]

+：阳性、-：阴性

[表12]

+：阳性、-：阴性

[实验8：细菌菌体培养物的抗菌活性评价试验]

验证NITE BP-03197、NITE BP-03198、NITE BP-03199、NITE BP-03200、NITE BP-03201或NITE BP-03202的菌体培养物是否具有抗菌活性。根据图7说明实验8的步骤。实验中使用了表13所示的青枯病菌1～6。在600nm的波长下测定各青枯病菌的前培养液的浊度，以青枯病菌1为0.1OD单位、其他青枯病菌为0.4OD单位的方式在软琼脂培养基11中混合稀释。此外，将OD600为1的培养液1mL中含有的细菌量设为1OD单位。将含有各青枯病菌的软琼脂培养基11层叠在琼脂培养基12上，使表面干燥，准备各青枯病菌的生长培养基。将NITEBP-03197、NITE BP-03198、NITE BP-03199、NITE BP-03200、NITE BP-03201和NITE BP-03202分别在MRS液体培养基以温度30℃培养，通过离心分离使菌体沉淀，将培养上清液(菌体培养物)作为试样13准备。将10μL的试样13滴加到各青枯病菌的生长培养基中，以温度30℃在好氧条件下培养20小时。细菌的培养上清液具有对青枯病菌的抗菌活性时，形成生长抑制圆14。作为对照实验，使用了具有抗菌活性的四环素(50μg/mL)。

[表13]

将实验8的结果示于图8中。NITE BP-03197、NITE BP-03198、NITE BP-03199、NITEBP-03200、NITE BP-03201或NITE BP-03202的培养上清液均在青枯病菌1～6的生长培养基上形成了生长抑制圆。NITE BP-03197、NITE BP-03198、NITE BP-03199、NITE BP-03200、NITE BP-03201或NITE BP-03202的菌体培养物均示出可以抑制青枯雷尔氏菌或假青枯雷尔氏菌的增殖。

[实验9：细菌的菌体和菌体培养物的混合物的抗菌活性评价试验]

验证NITE BP-03197、NITE BP-03198、NITE BP-03199、NITE BP-03200、NITE BP-03201或NITE BP-03202的菌体和菌体培养物是否具有抗菌活性。作为试样13，使用菌体和培养上清液的混合物，除此之外，实验9与实验8相同。将实验步骤示于图9中。首先，用与实验8相同的方法，准备各青枯病菌的生长培养基。将NITE BP-03197、NITE BP-03198、NITEBP-03199、NITE BP-03200、NITE BP-03201和NITE BP-03202分别在MRS液体培养基以温度30℃培养，将菌体和培养上清液(菌体培养物)的混合物作为试样13准备。将浸渍60μL的试样13的过滤器15静置于各青枯病菌的生长培养基中，以温度30℃在好氧条件下培养20小时。培养后，确认是否形成生长抑制圆。

将实验9的结果示于图10中。NITE BP-03197、NITE BP-03198、NITE BP-03199、NITE BP-03200、NITE BP-03201或NITE BP-03202的菌体和培养上清液的混合物均在青枯病菌1～6的生长培养基上形成了生长抑制圆。NITE BP-03197、NITE BP-03198、NITE BP-03199、NITE BP-03200、NITE BP-03201或NITE BP-03202的菌体和菌体培养物的混合物均示出可以抑制青枯雷尔氏菌或假青枯雷尔氏菌的增殖。

[实验10：细菌的菌体和菌体培养物的混合物的长期抗菌活性评价试验]

验证NITE BP-03197、NITE BP-03198、NITE BP-03199、NITE BP-03200、NITE BP-03201或NITE BP-03202的菌体和菌体培养物是否长期具有抗菌活性。作为青枯病菌，使用表13中记载的青枯病菌5，将从过滤器15静置在青枯病菌的生长培养基中开始的培养期间延长到3天、7天或15天，除此之外，实验10与实验9相同的方法进行。作为对照实验，使用了乳酸菌培养基、无处理或四环素(50μg/mL)。

将实验10的结果示于图11中。即使从浸渍NITE BP-03197、NITE BP-03198、NITEBP-03199、NITE BP-03200、NITE BP-03201或NITE BP-03202的菌体和培养上清液的过滤器静置在青枯病菌的生长培养基开始经过15天，也形成了生长抑制圆。可知NITE BP-03197、NITE BP-03198、NITE BP-03199、NITE BP-03200、NITE BP-03201或NITE BP-03202的菌体和菌体培养物的混合物均可以长期抑制青枯病菌的增殖。

[实验11：对营养液中的青枯病菌的抗菌活性评价试验]

验证NITE BP-03197、NITE BP-03198、NITE BP-03199、NITE BP-03200、NITE BP-03201或NITE BP-03202的菌体培养物是否可以抑制营养液中的青枯病菌的增殖。根据图12说明实验步骤。将NITE BP-03197、NITE BP-03198、NITE BP-03199、NITE BP-03200、NITEBP-03201和NITE BP-03202分别在MRS液体培养基以温度30℃培养，通过离心分离使菌体沉淀，将培养上清液(菌体培养物)作为试样23准备。作为营养液22，使用了OAT Agrio公司、OAT A处方(包含OAT house 1号1.5g/L和OAT house2号1.0g/L的水溶液)。以青枯病菌21为0.01OD单位的方式使其悬浮在营养液22中，准备被青枯病菌污染的营养液22。将10μL的试样23滴加到90μL的营养液22中，进行搅拌后，在温度30℃下培养5小时。将该培养液稀释100倍，涂布在用于检测青枯病菌的琼脂培养基24上，进一步在温度30℃下培养48小时。对培养后的琼脂培养基24上的菌落25的数进行计测。作为青枯病菌，使用了表13中记载的青枯病菌5。作为对照实验，代替试样使用了乳酸菌培养基或四环素(50μg/mL)。

将实验11的结果示于图13中。在滴加了NITE BP-03197、NITE BP-03198、NITE BP-03199、NITE BP-03200、NITE BP-03201或NITE BP-03202的培养上清液的营养液中，青枯病菌的菌落的发生得到抑制。可知通过NITEBP-03197、NITEBP-03198、NITEBP-03199、NITEBP-03200、NITEBP-03201或NITEBP-03202的菌体培养物，可杀灭营养液中的青枯病菌或抑制其增殖。

[实验12：对土壤中的青枯病菌的抗菌活性评价试验]

验证NITE BP-03197、NITE BP-03198、NITE BP-03199、NITE BP-03200、NITE BP-03201或NITE BP-03202的菌体是否可以抑制土壤中的青枯病菌的增殖。向50g的土壤(Akagi园艺、草花和野菜的培养土)中，添加用蒸馏水(Otsuka制药工厂制)调整为0.06OD单位的青枯病菌5的菌液2.5mL，准备被污染的土壤。将还原材料(糖蜜等有机物、Sunpillars公司制、Omalass 95)1g和NITE BP-03197、NITE BP-03198、NITE BP-03199、NITE BP-03200、NITE BP-03201或NITE BP-03202的菌体与土壤混合，以温度30℃在厌氧条件下培养14天。对于菌体，将以温度30℃在MRS液体培养基培养各细菌的产物用蒸馏水(Otsuka制药工厂制)调整为0.5OD单位，每50g土壤中混合2.5mL菌体。还原材料作为土壤熏蒸剂使用。使用土壤DNA提取试剂盒(ISOIL for Beads Beating Kit，NIPPON GENE公司制)，从该土壤中纯化土壤中所含的微生物DNA，使用青枯病菌共同引物组(759：GTCGCCGTCAACTCAACTTTCC(序列号2)、760：GTCGCCGTCAGCAATGCGGAATCG(序列号3))和与青枯病菌5特异性的PCR引物组(Nmult21：1F CGTTGATGAGGCGCGCAATTT(序列号4)、Nmult21：RRTTCGCTTGACCCTATAACGAGT(序列号5))，进行PCR扩增。PCR扩增使用KOD-Plus-Ver.2DNA聚合酶(东洋纺公司制)进行，纯化PCR后的扩增产物。用4％E-Gel(Thermo Fisher公司制)，对纯化的PCR扩增产物进行电泳，用图像分析仪LAS-3000(FUJIFILM公司制)，观察利用与青枯病菌5特异性的PCR引物组扩增的144个碱基对的带。

在混合了NITEBP-03197、NITEBP-03198、NITEBP-03199、NITEBP-03200、NITEBP-03201或NITEBP-03202的菌体的土壤中，与青枯病菌5特异性的144个碱基对的带减少。通过NITEBP-03197、NITEBP-03198、NITEBP-03199、NITEBP-03200、NITEBP-03201或NITEBP-03202的菌体，可杀灭土壤中的青枯病菌或抑制其增殖。

[实验13：营养液栽培中的青枯病的防治效果试验]

验证在营养液栽培中，通过向营养液中添加NITE BP-03199、NITE BP-03200或NITE BP-03201的菌体培养物，能否防治青枯病。首先，使用LED栽培机(LED PlanterGreenteria，DeAGOSTINI公司制)，在OAT A处方的营养液中，在温度25℃、湿度20～30％、光周期：明16小时/暗8小时的条件下，将番茄(品种：丽容)栽培至4～5叶期。试验区和对照区中，分别使用了8株番茄。

在试验区中，在接种青枯病菌之前，将由OD600值为10的NITE BP-03201培养液制备的培养上清液以1/100量添加到营养液中。在对照区中，在接种青枯病菌之前，将MRS培养基以1/100量添加到营养液中。接着，将青枯病菌5的菌液以成为2×10

0：无发病

1：1叶枯萎

2：2叶以上枯萎

3：除顶叶外枯萎

4：全身枯萎、枯死

病情指数＝(0×N0+1×N1+2×N2+3×N3+4×N4)/4×(N0+N1+N2+N3+N4)

NO～N4是表示该数值的个体的数。病情指数表示由疾病引起的损害程度，病情指数的值越大，意味着疾病进展越快。

图14显示了接种青枯病菌后的病情指数随时间的变化。在对照区中出现了严重的病征，相反在试验区中未出现此类病征。因此可知，NITE BP-03201的菌体培养物在营养液栽培中具有青枯病的防治效果。

用同样的方法，将NITE BP-03199或NITE BP-03200的培养上清液以1/100量添加到营养液中，将检查能否防治青枯病的结果示于图15中。在对照区中出现了严重的病征，相反在试验区中病情指数明显低。因此可知，NITE BP-03199或NITE BP-03200的菌体培养物在营养液栽培中也具有青枯病的防治效果。

[实验14：土耕栽培中的青枯病的防治效果试验]

验证在土耕栽培中，通过施用NITE BP-03200的菌体培养物，能否防治青枯病。在种植1周前，将NITE BP-03200的培养上清液稀释10倍、50倍或100倍，每株灌注50mL。接着，通过在青枯病菌污染农场种植番茄苗，接种青枯病菌。在农场种植后，将NITE BP-03200的培养上清液稀释10倍、50倍或100倍，每隔1周，每株灌注500mL。在本制剂处理区和无处理区，比较植物体出现的病征，评价防治效果。

在无处理区中出现了枯死和枯萎，相反在NITE BP-03200的培养上清液的灌注处理区中，可抑制此类病征。因此可知，NITE BP-03200的菌体培养物在土耕栽培中具有青枯病的防治效果。

符号说明

11：软琼脂培养基；12：琼脂培养基；13：试样；14：生长抑制圆；15：过滤器；21：青枯病菌；22：营养液；23：试样；24：琼脂培养基；25：菌落。

序列表

<110> 住友化学株式会社

<120> 属于乳杆菌属的新微生物、以及对青枯雷尔氏菌或假青枯雷尔氏菌引起的植物病害的防治剂及防治方法

<130> S44637WO01

<150> JP2020-111696

<151> 2020-06-29

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1485

<212> DNA

<213> 乳杆菌属物种(Lactobacillus sp.) SC-2001 (NITE BP-03197)

<400> 1

gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgaac gcaaaacttt caccgaatgc 60

ttgcattcac cggaagtttt gagtggcgaa cgggtgagta acacgtgggt aacctgccca 120

gaagaggggg ataacacttg gaaacaggtg ctaataccgc ataacaataa aaaccgcatg 180

gtttttattt aaaagatggt tttgctatca cttctggatg gacccgcggc gtattagcta 240

gttggtaagg taaaggctta ccaaggcaat gatacgtagc cgaactgaga ggttgatcgg 300

ccacattggg actgagacac ggcccaaact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc 360

acaatggacg aaagtctgat ggagcaacgc cgcgtgagtg aagaaggttt tcggatcgta 420

aaactctgtt gttagagaag aacgtgtgtg agagtaactg ctcatgcagt gacggtatct 480

aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg 540

ttgtccggat ttattgggcg taaagggaac gcaggcggtt ttttaagtct gatgtgaaag 600

ccttcggctt aaccgaagtc atgcattgga aactgaaaga cttgagtgca gaagaggaga 660

gtggaactcc atgtgtagcg gtgaaatgcg tagatatatg gaagaacacc agtggcgaaa 720

gcggctctct ggtctgtaac tgacgctgag gttcgaaagt gtgggtagca aacaggatta 780

gataccctgg tagtccacac cgtaaacgat gaatgctaag tgttggaggg tttccgccct 840

tcggtgctgc agctaacgca ttaagcattc cgcctgggga gtacgaccgc aaggttgaaa 900

ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa 960

cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatct tctgacaacc taagagatta ggtgttccct 1020

tcggggacag aatgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg 1080

ttaagtcccg caacgagcgc aacccttatt attagttgcc agcattaagt tgggcactct 1140

agtgagactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc 1200

ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggacggtaca acgagtcgcg aaaccgcgag 1260

gtttagctaa tctcttaaag ccgttctcag ttcggattgt aggctgcaac tcgcctacat 1320

gaagtcggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct 1380

tgtacacacc gcccgtcaca ccatgagagt ttgtaacacc caaagccggt gaggtaacct 1440

ttatggaacc agccgtctaa ggtgggacag atgattgggg tgaag 1485

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PCR引物 759

<400> 2

gtcgccgtca actcaacttt cc 22

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PCR引物 760

<400> 3

gtcgccgtca gcaatgcgga atcg 24

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PCR引物 Nmult21:1F

<400> 4

cgttgatgag gcgcgcaatt t 21

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PCR引物 Nmult21:RR

<400> 5

ttcgcttgac cctataacga gt 22