一种水稻耐盐相关的OsWRKY18基因及在调控耐盐胁迫中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种水稻耐盐相关的OsWRKY18基因及在调控耐盐胁迫中的应用。

背景技术

土壤盐渍化指土壤中的盐分不断聚积而逐渐形成盐渍的过程，是危害土壤质量和农业生产力的主要环境制约因素之一。由于人类活动所导致的土壤次生盐渍化是目前土壤盐渍化问题不断加重的主要驱动因素。目前，全球至少有100多个国家存在土壤盐渍的问题，全球盐渍土壤覆盖总面积为9.322×10

许多基因和不同的调控机制在植物对非生物胁迫的响应中起着中重要作用。植物NAC、MYB、WRKY等转录因子家族通过调节其下游基因的表达来适应非生物胁迫。WRKY转录因子家族因其在应对干旱、盐和热胁迫等非生物胁迫中的作用而受到广泛关注。通常，WRKY家族的蛋白N端普遍具有高度保守的序列WRKYGQK，在C端常常含有2种非典型的锌指结构域，CX4-5CX22-23HXH(C2-H2)或CX7-CX23-HXC(C2HC)。根据锌指基序的结构和WRKY结构域的数量，WRKY转录因子可分为三组(I、II和III)。根据系统进化的远近关系又可以将WRKY蛋白家族重新分为Ⅰ、Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd、Ⅱe以及Ⅲ，一共六个组群。WRKY转录因子通过与其启动子内的W-box基序(TTGACC/T)特异性结合，具有激活或抑制下游基因表达的潜力。

WRKY转录因子在不同植物的盐胁迫响应中发挥着重要作用。例如，过表达AtWRKY74显著提高了拟南芥对盐胁迫的耐受性。在番茄中，过表达SlWRKY8增强了植物对干旱和盐胁迫的耐受性。ZmWRKY17的异源过表达降低了拟南芥植株对盐胁迫的耐受性，并增加了对ABA的敏感性，表明ZmWRKY17可能通过ABA信号转导通路负调控盐胁迫响应。在小麦中，盐和聚乙二醇(PEG)处理可强烈诱导TaWRKY75-A的表达。在水稻中，OsWRKY50通过ABA信号转导途径正调节盐胁迫反应。最近的一项研究表明，OsWRKY87通过直接调控OsABF1的表达提高水稻干旱和耐盐性。然而，WRKY转录因子在调控水稻盐胁迫中的作用还远不清楚。

发明内容

本发明的目的提供一种水稻耐盐相关的OsWRKY18基因及在调控耐盐胁迫中的应用，不仅为水稻抗逆的分子机制研究提供新的理论证据，也为培育优质的耐盐水稻(作物)新品种提供新的目标基因或新材料。

本发明提供了一种水稻耐盐相关的OsWRKY18基因，所述OsWRKY18基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种水稻耐盐相关的OsWRKY18蛋白，所述OsWRKY18蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种改变水稻对盐胁迫敏感性的方法，调节水稻基因组中OsWRKY18基因的表达量，所述OsWRKY18基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述调节包括提高或降低。

本发明还提供了一种提高水稻耐盐胁迫的方法，在目标水稻种质基因组中表达或超表达OsWRKY18基因的表达量，所述OsWRKY18基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种提高水稻对盐胁迫敏感的方法，在目标水稻种质基因组中降低OsWRKY18基因的表达量，所述OsWRKY18基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

有益效果：本发明提供了一种水稻耐盐相关的OsWRKY18基因，所述OsWRKY18基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述OsWRKY18基因定位于细胞核中，主要在根中表达，并且受盐的高度诱导。本发明实施例中使用CRISPR-Cas9技术构建基因编辑突变体植株，筛选了两个不同突变位点的纯合突变体植株进行植株实验，突变体植株进行NaCl处理实验发现，在盐处理条件下，突变体植株较野生型对盐胁迫更敏感。突变体植株经过盐处理后，其地上部分和木质部汁液中Na

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为水稻和拟南芥中WRKY转运蛋白的进化树分析图；

图2为OsWRKY18基因结构图和纯合突变体植株类型；

图3为OsWRKY18在不同组织中的表达水平图；

图4为不同处理时间、不同盐浓度处理对OsWRKY18表达水平的影响结果；

图5为OsWRKY18在水稻原生质体中亚细胞定位结果；

图6为OsWRKY18突变体植株盐耐受性表型及干重测定结果图；

图7为OsWRKY18突变体植株盐胁迫下Na

图8为盐胁迫相关基因在野生型和oswrky18-2(MT)突变体中的表达分析。

具体实施方式

本发明提供了一种水稻耐盐相关的OsWRKY18基因，所述OsWRKY18基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：ATGGCGTCGCCGCGGCTGAAGAGGGAGCAGTCGTTCGACTTCGAGGAGGCGAGCGCGCAGGAAGCCGTGGGATCCGCGTCGGCGTCGTACAGCCCTCCCGGGGGCGGCGGCGTCTTTGGCATCTCGCCGCCGGAGTCCTCGCCGCGCGACGGCCGGAAGAGAAGGAAGGATAGACCATCATTGGTGAAACATACGTTCACACCTCATTTTGATGGTCATTTGTGGAGGAAGTATGGCCAGAAGAACATCAAGGACTCTGCTTTCCCTAGGTTATATTACAGATGCTCTTACCGTGAGGACAGACAGtgccttgcctccaagctggtgcagcaggagaacgacgacgacccgccactgtacagggtcacctacacgtacgagcacacctgcaacaccaCGCCCGTCCCGACCCCCGACGTCGTGGCCGAGCAGCCGCCGCCGGGCGCCGCCGGCGACGCGTACCTCCTCAGGTTCGGCTCCTCCGCTGGCGGCGGCGGCGGCGGCGCTCATCAGCAGCAGACCGAGCGAGAACGACAGCAGCAAAATACAGCGAGAAGAAGGCCATTCATGATGCTGAGCTTCGATTCTAGTAGCAGCCATCAGCTGCACGAGCAGCCGCACGCGTTCCCTCCCGACGGCCAGCTGCCGGCCACGGCCGCGGCCGCGTCGCCGTCGTCGTTCACGGCAGCCGAGGCGTTGGCGGCGCCGCCGCTCACGACGACGATGAACGACGGAGGCGACCTGTTCTCGACGTGGGACGCGCTCAGGTATGGTTTGGACTATGACCACGGGCACCTTGGTAACCATGTTTATCTCCCTGATGACTGTAATGGTGGTGATGATAATTACTGA。

OsWRKY18蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：MASPRLKREQSFDFEEASAQEAVGSASASYSPPGGGGVFGISPPESSPRDGRKRRKDRPSLVKHTFTPHFDGHLWRKYGQKNIKDSAFPRLYYRCSYREDRQCLASKLVQQENDDDPPLYRVTYTYEHTCNTTPVPTPDVVAEQPPPGAAGDAYLLRFGSSAGGGGGGAHQQQTERERQQQNTARRRPFMMLSFDSSSSHQLHEQPHAFPPDGQLPATAAAASPSSFTAAEALAAPPLTTTMNDGGDLFSTWDALRYGLDYDHGHLGNHVYLPDDCNGGDDNY。

在本发明中，亚细胞定位分析显示OsWRKY18定位于细胞核，OsWRKY18的CDS全长为852bp，具有3个外显子和2个内含子，其基因结构图如图2所示。

本发明还提供了一种水稻耐盐相关的OsWRKY18蛋白，所述OsWRKY18蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种改变水稻对盐胁迫敏感性的方法，调节水稻基因组中OsWRKY18基因的表达量，所述OsWRKY18基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明所述调节优选包括提高或降低，本发明对所述提高或降低的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法进行即可，如在实施例中通过CRISPR-Cas9技术构建基因敲除突变体。

本发明还提供了一种提高水稻耐盐胁迫的方法，在目标水稻种质基因组中表达或超表达OsWRKY18基因的表达量，所述OsWRKY18基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种提高水稻对盐胁迫敏感的方法，在目标水稻种质基因组中降低OsWRKY18基因的表达量，所述OsWRKY18基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明实施例中，在OsWRKY18的外显子区选择两个目标靶点，序列分别为TCAAGGACTCTGCTTTCCCT(SEQ ID NO.3)和ACACGTACGAGCACACCTG(SEQ ID NO.4)，构建了具有两个OsWRKY18特异性靶点的pCRISPR-OsWRKY18质粒，并利用遗传转化方法构建得到水稻基因敲除突变体，通过对性状的观察，证实OsWRKY18参与水稻的盐胁迫响应过程。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种水稻耐盐相关的OsWRKY18基因及在调控耐盐胁迫中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1.植物材料和生长条件

本实施例使用的材料有野生型日本晴水稻和两个OsWRKY18突变体植株。

将水稻种子浸泡于自来水中，放于28℃培养箱中黑暗发芽2d后，将种子摆于滤网上，放于含有0.5mM CaCl

2.OsWRKY18基因全序列的获得以及进化树的构建

为了获得OsWRKY18的CDS序列，按照产品的说明书使用Trizol试剂盒(Lifetechnologies)从水稻根中提取总RNA。取1μg总RNA使用Hiscript II Q RT SuperMix Kit(Vazyme)合成试剂盒合成cDNA的第一条。获得的cDNA作为模板，用于下列不同实验中获得OsWRKY18的全序列。

水稻和拟南芥中的WRKY家族蛋白的系统进化树主要通过TAIR(https://www.arabidopsis.org/)和NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)下载该家族的全长氨基酸序列。然后，使用MEGA6软件通过邻近法进行系统进化树的构建(图1)。

3.OsWRKY18突变体植株构建

OsWRKY18基因(SEQ ID NO.1)CDS全长为852bp，具有3个外显子和2个内含子，其基因结构图如图2所示。

使用CRISPR-Cas9基因组编辑系统来构建OsWRKY18基因的突变体植株。首先，在OsWRKY18的外显子区选择两个目标靶点，靶点1和靶点2序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4，通过重叠PCR分别获得了两个与sgRNA相连接的表达盒Pu6a-靶点1-sgRNA和Pu6b-靶点2-sgRNA，并利用Bsa I酶的切割位点和识别位点不重叠的特性把这两个表达盒连入pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体上，产生含有OsWRKY18特异性靶点1和靶点2的pCRISPR-OsWRKY18载体，并转化至DH5α感受态细胞中。将阳性克隆提取质粒后，送至公司进行测序，选择结果正确的pCRISPR-OsWRKY18质粒，利用土壤农杆菌介导的遗传转化方法侵染野生型日本晴水稻构建突变体植株。最后，设计相应引物1(SEQ ID NO.5：5’-ATGGGCAAATCAATTGCATGA-3’和SEQ ID NO.6：5’-TGTTGTTTGACTCCTGGTAGC-3’)和引物2(SEQID NO.7：5’-AACCGCGCGGCGAGATCCTAATC-3’和SEQ ID NO.8：5’-TCAGTAATTATCATCACCACCAT-3’)，利用PCR技术分别对目标靶点1和靶点2位置的序列进行扩增，并经过测序验证后，选择了两个独立的纯合突变体植株(oswrky18-1和oswrky18-2)进行下列实验，结果如图2所示。

3.RNA的提取和基因表达水平分析

为了分析OsWRKY18表达模式，从抽穗期的野生型植株中对根、茎、叶、叶鞘和穗分别进行取样，取样后立刻放入液氮中。使用Trizol试剂试剂盒(Life technologies)提取样品的总RNA。然后，使用Hiscript II Q RT SuperMix Kit(Vazyme)，进行cDNA第一条链的合成。并使用ChanQ

OsWRKY18基因表达所用的引物序列为(SEQ ID NO.9)5’-GGCCGGAAGAGAAGGAAGGAT-3’和(SEQ ID NO.10)5’-CAAGGCACTGTCTGTCCTCAC-3’；内参选择的是组蛋白H3，其引物序列为(SEQ ID NO.11)5’-GGTCAACTTGTTGATTCCCCTCT-3’和(SEQ IDNO.12)5’-AACCGCAAAATCCAAAGAACG-3’，结果如图3所示。

由图3可知，本发明的OsWRKY18基因主要在水稻的根中表达。

为了分析OsWRKY18表达水平对盐的详细响应情况，首先，取5d大野生型水稻幼苗分别使用100mM NaCl分别处理0，1，3，6，12，24h后取主根样品并提取RNA；其次，使用0，25、50、75、100mM NaCl处理12h后取主根样品提取RNA；并使用上述方法进行qRT-PCR分析，每组实验4个重复，结果如图4所示。

由图4中的A可知，随着时间的增加，OsWRKY18基因的表达水平依次增加。由图4中B可知，OsWRKY18基因的表达受NaCl的诱导，且随着NaCl浓度的增加，表达水平依次升高，当NaCl浓度为75、100、150mM时，OsWRKY18表达量相对于50mM处理组无显著差异。

4.OsWRKY18的亚细胞定位分析

为了分析OsWRKY18的亚细胞定位情况，构建了OsWRKY18-GFP融合表达载体。

使用OsWRKY18特异的引物SEQ ID NO.13(5’-GGCAAGCTTCGATGGCGTCGCCGCGGCTGAAG-3’)和SEQ ID NO.14(5’-AATGTCGACTCAGTAATTATCATCACCACCAT-3’)使用PCR扩增出OsWRKY18的全长序列(SEQ ID NO.1)(去终止子)。然后，将扩增的片段克隆到pYL322-GFP载体上GFP编码区的前面，产生OsWRKY18-GFP重组质粒。

利用PEG介导转化的方法，将得到的质粒OsWRKY18-GFP重组质粒或GFP空载体分别与细胞核标记质粒Ghd7共同转化于水稻原生质体细胞中，在室温下孵育后，利用激光共聚焦扫描显微镜(TCS SP8；Leica)进行拍照，结果如图5所示。

由图5中的A-D所示，GFP空载体(绿色荧光)定位于细胞质和细胞核等位置，而细胞核标记蛋白Ghd7(红色荧光)只定位于细胞核上。然而，由图5中的E-H所示，OsWRKY18-GFP重组质粒与Ghd7共定位结果发现，绿色荧光和红色荧光可以融合，说明OsWRKY18定位于细胞核。

5.OsWRKY18突变体植株的表型分析及离子含量分析

为了研究OsWRKY18突变体植株对盐的耐受性，取15d天大的野生型和2个OsWRKY18突变体植株幼苗分别转移至含有0和75mM NaCl的1/2Kimura B营养液中培养14d，每3天更换一次营养液。处理结束后，进行拍照、取样。然后，将样品放在70℃的烘箱中干燥5天后，称量干重。加入适量的浓硝酸，并使用石墨消解仪进行消解后，使用ICP-MS(Plasma QuantMS；Analytik JenaAG)测定离子浓度，结果如图6所示。

由图6中的A可以看出，在正常条件下，突变体植株和野生型日本晴植株的长势基本一致，突变体的根和地上部分的干重与野生型日本晴相比无明显差异。当用100mM的NaCl处理14d后，突变体植株与野生型日本晴植株相比，表现为突变体长得更矮小，叶片萎蔫甚至黄化(图6中B)，oswrky18-1突变体的根的干重相对于野生型无明显的差异，但地上部分的干重显著低于野生型(图6中D)；oswrky18-2突变体植株的根和地上部分的干重显著低于野生型日本晴的干重(图6中D)。此结果更进一步说明OsWRKY18参与水稻的盐胁迫响应过程。

离子含量分析发现，在正常的条件下，突变体的Na

钠离子主要通过木质部从根向地上部转运，将35d大的野生型和两个突变体植株使用30mM NaCl的营养液处理6h后，收集木质部汁液。测定Na

同时，在正常培养和含有100mM NaCl的盐胁迫条件下，比较野生型和o swrky18-2突变体植株根的转录组数据发现OsWRKY18调控许多胁迫相关基因的表达。实时荧光定量PCR验证结果表明，OsLEA3-1(SEQ ID NO.15：AATGA TTTCCCTTTGGGTC和SEQ ID NO.16：CATCAGTACACATCACCCA)、RA B21(SEQ ID NO.17：CACACCACAGCAAGAGCTAAGTG和SEQ IDNO.18：TTAGGCTTGGGATCTGCTGG)、SALP1(SEQ ID NO.19：CGCAATCCCTT GCTCATTCG和SEQ IDNO.20：GGCACGTAAGCCATCTCCTC)、OsHOX22(SEQ ID NO.21：GTGTCGGTGGAGTCGGATCA和SEQ IDNO.22：CAA GCCACCGCATTCCACTC)、RePPR2.1(SEQ ID NO.23：GTGACAACGAGA TGAGGAGATC和SEQ ID NO.24：TTAGGCTTGGGATCTGCTGG)、OsHKT 1；5(SEQ ID NO.25：CGTCGAGGTTATCAGTGCGT和SEQ ID NO.26：GCT TCCCTTGTTTGCTCCAC)在oswrky18-2突变体植株中的表达量相对于野生型植株显著下降(图8)。表明在盐胁迫条件下，这些基因的表达可能直接或间接地受到OsWRKY18的调控。

由以上实施例可以得出，OsWRKY18是一个定位于细胞核的转录因子蛋白，通过调控地上部的Na

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。