一种突变基因的富集方法
文献发布时间：2023-06-19 19:33:46
技术领域
本发明涉及核酸检测技术领域，特别是涉及一种突变基因的富集方法及其应用。
背景技术
肿瘤是一种遗传因素与环境因素相互作用导致的疾病。恶性肿瘤因发病率和死亡率高，严重威胁着人类的生命健康。大量的医学分子生物学研究已证明，基因突变与肿瘤的形成和恶化密切相关。基因突变不仅是引发肿瘤的重要因素，也为治疗干预提供了重要靶标。例如，临床上针对发生表皮生长因子受体（epithermal growth factor receptor,EGFR）基因突变的非小细胞肺癌患者优先采用靶向治疗药物EGFR酪氨酸激酶抑制剂（如吉非替尼、厄洛替尼等）进行治疗。突变基因的检测已在现代肿瘤的筛查、诊断、治疗监测、预后评估等方面发挥了积极有效的作用。
目前已报道的突变基因的检测方法有很多，如基因测序法、实时荧光定量PCR法、数字PCR法、液相芯片法等。它们都有自己独特的优势，但在实验操作、检测条件、检测成本、灵敏度等方面也存在不同程度的缺陷。基因测序法检测通量高，可对未知基因进行检测，但其操作复杂、耗时、成本高、灵敏度低。实时荧光定量PCR法特异性好、操作简单，已被广泛用于临床医学分子检测，因该方法是对已知基因的检测，且扩增与检测同时进行，因此需要高效的反应体系来实现突变基因的特异性检测，特别是涉及点突变基因的检测。数字PCR可实现单分子检测，对核酸分子进行绝对定量，该方法与荧光定量PCR法有些许相似之处，即其也需要高效的反应体系来实现已知突变基因的高特异、超灵敏检测。液相芯片技术可实现高通量检测，因其依赖于分子杂交过程，因此针对突变基因的高灵敏检测需要探针和靶序列高特异结合。
突变基因在DNA样品中的含量极少，这使得突变基因检测技术面临巨大挑战，而且大量的野生型（正常）基因也会大大干扰突变基因的检测，特别是点突变基因的检测。对突变基因进行特异性扩增是当前突变基因检测方法所采取的主要手段。蝎形探针扩增阻滞突变系统（Scorpion amplification refractory mutation system, Scorpion ARMS）是一种将等位基因特异性PCR（allele-specific PCR，AS-PCR）和scorpion荧光信号探针联合应用的实时荧光定量PCR法，该方法已被广泛用于临床突变基因的检测。AS-PCR是基于特异等位基因引物，即引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA完全互补，以及
突变基因的特异性扩增对于先扩增后检测的突变基因检测技术平台影响极大，特别是依赖于分子杂交的纳米技术检测平台。然而，当前的突变基因富集方法仍存在缺陷。因此，优化和开发突变基因的富集方法对于改善或提高痕量突变基因的检测非常重要。
发明内容
鉴于现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于构建一种富集突变基因的PCR体系，以利于简单、快速的用于突变基因的富集。
本发明的再一目在于：提供一种特异性好、稳定性好、操作简单快速的突变基因的富集方法。
为实现上述目的，本发明提供一种富集突变基因的PCR体系，为包括EGFR T790M靶向点突变基因结合的特异等位基因引物组成的PCR反应体系，包括不对称浓度的特异等位基因引物对、特异的靶向野生型基因结合的肽核酸和/或
优选的，针对EGFR T790M靶向基因不对称PCR反应体系包括不对称浓度的特异等位基因引物对为上游引物Seq NO.4，下游引物Seq NO.5，和肽核酸Seq NO.6。
优选的，针对EGFR T790M靶向基因不对称PCR反应体系，包括针对EGFR T790M的特异引物上游引物5’端标记荧光分子Cy5 Seq NO.1，下游引物Seq NO.2和肽核酸Seq NO.3。
本发明还提供了一种根据上述PCR体系的突变基因的富集方法，包括下述步骤：
不对称PCR反应体系的构建；
PCR反应体系的扩增步骤
①95℃变性5～10分钟；
②95℃变性20～30秒，70℃维持20～30秒，50～60℃退火30秒，72℃延伸20～30秒，进行30～40个循环；
③72℃延伸5～10分钟。
具体的，富集人类肺癌细胞株H1975（携带EGFR T790M突变）基因组中的EGFRT790M突变片段。
富集荧光分子Cy5标记的EGFR T790M突变片段。
本发明还提供了一种偶联靶向基因探针的磁球，该靶向基因为EGFR T790M，捕获探针的3’端修饰有氨基，其核酸序列(Seq NO.7)为：5’-CAGGAGGCAGCCGAAGGGCATGTTTTT-3’。
所述的偶联靶向基因探针的磁球用于分析上述PCR特异性扩增产物，如富集人类肺癌细胞株H1975（携带EGFR T790M突变）基因组中的EGFR T790M突变片段，富集的荧光分子Cy5标记的EGFR T790M突变片段等。
上述突变基因的富集方法包括如下步骤：
（1）将DNA样品、不对称浓度的特异等位基因引物对、肽核酸、
（2）将上述步骤（1）制备的混合物进行如下扩增：①95℃变性5~10分钟；②95℃变性20~30秒，70℃维持20~30秒，50~60℃退火30秒，72℃延伸20~30秒，进行30~40个循环；③72℃延伸5~10分钟。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了一种高特异性的突变基因富集方法，该方法操作简单、快速、特异性好、可重复性高，特别适用于先扩增后检测技术平台对微量乃至痕量突变基因的高灵敏、高特异检测，具有很好的应用潜力。
附图说明
图1为实施例4中阴性对照组的流式细胞仪检测结果图；
图2为实施例4中人类白细胞基因组（野生型基因）样品的流式细胞仪检测结果图；
图3为实施例4中人类肺癌细胞株H1975基因组（携带
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，肽核酸由PANAGENE合成，PCR试剂购自Promega公司。
实施例1
富集人类肺癌细胞株H1975（携带
（1）使用High Pure PCR Template Preparation Kit（Roche）提取人类肺癌细胞株H1975中的DNA具体步骤按试剂盒操作说明；
（2）配制50 μL的不对称PCR反应体系，该体系包括不对称浓度的特异等位基因引物对、肽核酸、Taq DNA聚合酶、dNTPs、含Mg
（3）采用PCR扩增仪（Bio-Rad公司）对步骤（2）配制的PCR反应体系按照如下条件进行扩增：
①95℃变性10分钟；
②95℃变性30秒，70℃维持20秒，60℃退火30秒，72℃延伸20秒，进行30~40个循环；
③72℃延伸10分钟，PCR特异性扩增产物。
实施例2
富集荧光分子Cy5标记的
（1）使用High Pure PCR Template Preparation Kit（Roche），按试剂盒操作说明分别提取人类正常白细胞和人类肺癌细胞株H1975中的DNA；
（2）配制25μL的不对称PCR反应体系：该体系包括不对称浓度的特异等位基因引物对、肽核酸、Taq DNA聚合酶、dNTPs、含Mg2+的PCR缓冲液以及5μL步骤（1）提取的DNA等；通过采用200 nM上游引物、20 nM下游引物以及1000 nM肽核酸进行不对称PCR扩增反应，富集大量高特异的EGFR T790M突变片段；针对EGFR T790M的特异引物和肽核酸序列分别为：上游引物5’端标记荧光分子Cy5，(Seq NO.1)5’-ACCTACACCGTGCAGCTCATCAT-3’；下游引物(SeqNO.2)：5’-TTGAGCAGGTACTGGGAGCCAAT-3’；肽核酸(Seq NO.3)：CTCATCACGCAGCTC；
（3）采用PCR扩增仪（Bio-Rad公司）对上述步骤（2）配制的PCR反应体系按照如下条件进行扩增：
①95℃变性10分钟；
②95℃变性30秒，70℃维持20秒，60℃退火30秒，72℃延伸20秒，进行30个循环；
③72℃延伸5分钟，PCR特异性扩增产物。
实施例3：
制备偶连
（1）将0.2 mg羧基磁球用0.1 M 2-吗啡乙磺酸（pH4.5）清洗三次。
（2）将上述步骤（1）获得的羧基磁球与0.4 M
（3）将上述步骤（2）中的反应磁球用10 mM硼砂缓冲液（pH9.5, 0.5% SDS）清洗三次。
（4）将上述步骤（3）中的反应磁球用1 x TE缓冲液（pH7.6）清洗三次，并用1 x TE缓冲液重悬，获得偶连有探针的磁球，于4℃保存备用。
实施例4
将上述实施例3中获得的偶连有探针的磁球捕获上述实施例2中的PCR特异性扩增产物并检测分析，具体操作如下：
（1）将上述实施例2中的PCR扩增产物先于95℃变性10分钟，然后快速置于冰上冷却5分钟。
（2）将上述步骤（1）中PCR扩增产物与上述实施例3中获得的偶连了捕获探针的磁球、1.5 M四甲基氯化铵（TMAC）、0.05 M Tris-HCl（pH8.0）、0.1% BSA以及0.1%吐温20（Tween 20）混匀，并于50℃条件下避光反应1小时。
（3）将上述步骤（2）中获得的磁球用含1.5 M TMAC和0.05 M Tris-HCl（pH8.0）的清洗液清洗三次，用清洗液重悬磁球，于流式细胞仪（BD Accuri
结果判断：在FSC-SSC散点图中设门选中磁球的集中区域（不低于80%），根据门内荧光分子Cy5的荧光信号强度来判断检测结果。附图1为实施例检测阴性对照组的流式细胞仪检测结果图，附图2为实施例检测人类白细胞基因组（野生型基因）样品的检测结果图，附图3为实施例检测人类肺癌细胞株H1975基因组（携带