一种柑橘益生元组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种柑橘益生元组合物及其制备方法和应用。

背景技术

肥胖与肠道菌群是息息相关的，有大量的研究显示可以通过调节肠道菌群来改善肥胖。因此，饮食摄入益生元成为了改善肥胖、缓解肥胖带来的代谢综合征的一种有效策略。

益生元是指能被宿主微生物选择性地利用以使其健康的基质。目前关于益生元的研究大多都还停留在单一作用上，其对肠道菌群整体结构的改善效果较为有限，且不具备广谱性。有研究还发现单一的高精度益生元(菊粉)在菌群失调情况下反而会促进肝癌的发生。而肥胖常常就伴随着菌群的失调。因此，根据单一益生元的特性进行科学的组合配比，立足于多元化、深层次的菌群结构优化，高效促进有益菌增殖，从整体上促进机体健康，成为了今后精准营养研究与益生元产品开发的主要方向。

发明内容

本发明的目的在于提供一种柑橘益生元组合物及其制备方法和应用。本发明所述柑橘益生元组合物原料丰富、成本低廉、效果显著，具有多菌群调节效果且调节效果显著，能够改善肥胖，降血脂，降低肝脏脂肪沉积，促进短链脂肪酸的生成，可满足多种应用场景的需求。

本发明提供了一种柑橘益生元组合物，所述柑橘益生元组合物包括RGI型果胶多糖和橙皮苷；所述RGI型果胶多糖富含中性糖，所述中性糖包括阿拉伯糖和半乳糖。

优选的是，所述柑橘益生元组合物中，RGI果胶多糖与橙皮苷的质量比为10:1～1:10。

优选的是，所述RGI果胶多糖和橙皮苷均来源于柑橘，所述柑橘包括温州蜜柑、常山胡柚和甜橙中的一种或两种以上。

优选的是，所述RGI果胶多糖的制备方法包括以下步骤：

将柑橘在含质量百分含量为0.4～0.6％的HCl水溶液中浸泡10～15min，捞出酸化后的柑橘，在含质量百分含量为0.4～0.6％的NaOH水溶液中浸泡30～50min，过滤，得到粘稠状黄色滤液；

将粘稠状黄色滤液与含质量百分含量为0.4～0.6％的HCl水溶液混合并调节溶液pH至5.0～7.0，得到混合液，将所述混合液与无水乙醇混合，静置，过滤，得到沉淀；

将所述沉淀与无水乙醇混合，均质，过滤，得到松散的颗粒状沉淀；

将松散的颗粒状沉淀与水混合，离心，取上清进行透析，干燥，得到RGI型果胶多糖。

优选的是，所述橙皮苷的纯度在95％以上。

本发明还提供了上述技术方案所述的柑橘益生元组合物的制备方法，包括以下步骤：将RGI果胶多糖和橙皮苷混合，得到柑橘益生元组合物。

本发明还提供了上述技术方案所述的柑橘益生元组合物或上述技术方案所述制备方法制备得到的柑橘益生元组合物在制备调节人体肠道菌群和/或改善肠道功能的产品中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的柑橘益生元组合物或上述技术方案所述制备方法制备得到的柑橘益生元组合物在制备促进微生物发酵生产短链脂肪酸的制剂中的应用。

优选的是，所述短链脂肪酸包括乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸中的一种或两种以上。

本发明还提供了上述技术方案所述的柑橘益生元组合物或上述技术方案所述制备方法制备得到的柑橘益生元组合物在制备具有以下①～③中任一项或两项以上所示功能的产品中的应用：

①预防和/或改善肥胖；

②降低血脂；

③改善肝脏脂肪堆积。

本发明提供了一种柑橘益生元组合物。本发明的柑橘益生元组合物以富含中性糖(阿拉伯糖和半乳糖)的RGI型果胶多糖和黄酮类物质橙皮苷作为有效活性成分，能够高效调节肠道菌群、改善肥胖。经体外益生特性评价实验验证，所述柑橘益生元组合物能够促进有益菌的生长和抑制条件致病菌的增殖，并显著增加肠道菌群发酵所产生的短链脂肪酸，具有调节肠道菌群、改善肠道健康的作用。经动物实验验证，所述柑橘益生元组合物适用于制备改善肥胖、降低血脂、改善肝脏脂肪堆积的产品，能在体内有效促进短链脂肪酸等有益代谢产物的生成，高效促进乳酸菌和双歧杆菌丰度的增加，精准发挥益生元组合物的生理活性。

具体的，本发明柑橘益生元组合物具有以下有益效果：

(1)本发明以柑橘加工废弃物为原料，绿色提取RGI果胶多糖，并结合果胶多糖与柑橘中含量丰富的黄酮橙皮苷制备得到了一种新型的柑橘益生元组合物。本发明的柑橘益生元组合物在特定比例组合下表现出显著效果，具有协同增效的作用。

(2)本发明在体外验证了该柑橘益生元组合物可以提高人体肠道内有益菌的丰度，增加有利于人体健康的短链脂肪酸的生成，从而起到调节肠道菌群、改善肠道功能的作用。

(3)本发明的柑橘益生元组合物在肥胖预防模型中有显著的益处，具体表现在改善肥胖、降低血脂、高效提升乳酸菌属、双歧杆菌属的丰度水平和促进肠道短链脂肪酸生成上。

(4)本发明的柑橘益生元组合物具有原料来源丰富、结构特异、成本低廉、高效调节肠道菌群、生理效果显著以及应用场景广阔等优点，为精准营养研究与益生元产品开发提供典型示范。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1提供的果胶多糖和柑橘益生元组合物的单糖组成情况；

图2为本发明实施例2提供的肥胖预防试验结果中的体重变化情况结果图；

图3为本发明实施例2提供的肥胖预防试验结果中的血脂情况结果图；

图4为本发明实施例2提供的肥胖预防试验结果中的肝脏切片H&E染色情况结果图；

图5为本发明实施例3提供的体外益生特性评价实验结果中的短链脂肪酸生成情况结果图；

图6为本发明实施例4提供的不同果胶和橙皮苷组合物的体外益生特性比较结果图；

图7为本发明实施例5提供的不同果胶和橙皮苷组合物的调节肠道菌群功能差异结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种柑橘益生元组合物，所述柑橘益生元组合物包括RGI型果胶多糖和橙皮苷；所述RGI型果胶多糖富含中性糖，所述中性糖包括阿拉伯糖和半乳糖。在本发明中，所述柑橘益生元组合物中，RGI果胶多糖与橙皮苷的质量比优选为10:1～1:10，更优选的，本发明所述柑橘益生元组合物由RGI型果胶多糖和橙皮苷以10:1的质量比组成；或由RGI型果胶多糖和橙皮苷以5:1的质量比组成；或由RGI型果胶多糖和橙皮苷以3:1的质量比组成；或由RGI型果胶多糖和橙皮苷以1:1的质量比组成；或由RGI型果胶多糖和橙皮苷以1:3的质量比组成；或由RGI型果胶多糖和橙皮苷以1:5的质量比组成；或由RGI型果胶多糖和橙皮苷以1:10的质量比组成；或由RGI型果胶多糖和橙皮苷以4:1的质量比组成。在本发明中，所述RGI果胶多糖与橙皮苷的质量比优选为具有生物活性的配比，RGI型果胶多糖以实际重量进行计算，橙皮苷按照其纯度换算成实际含量后计算。本发明富含阿拉伯糖和半乳糖的RGI果胶多糖可以显著调节肠道菌群、促进短链脂肪酸生成，黄酮橙皮苷可以调节肠道菌，抗炎、抗氧化。通过本发明的科学配伍组合后，柑橘益生元组合物能起到良好的综合功效，体现出整体高效调节菌群及改善肥胖等功效。经体外益生特性评价实验和肥胖预防实验的验证，本发明柑橘益生元组合物在体内和体外均具有益生特性，能高效调节肠道菌群，具有改善肥胖的功效。在本发明中，所述RGI果胶多糖和橙皮苷均来源于柑橘，所述柑橘优选包括温州蜜柑、常山胡柚和甜橙中的一种或两种以上。在本发明中，所述柑橘优选包括柑橘的皮、带囊衣的橘瓣和/或囊衣。柑橘囊衣或皮经本发明方法提取能够获得富含阿拉伯糖和半乳糖的果胶多糖，若仅以柑橘果肉为原料进行提取，则不能获得本发明富含中性糖的RGI果胶多糖。

在本发明中，所述RGI果胶多糖的制备方法包括以下步骤：

将柑橘在含质量百分含量为0.4～0.6％的HCl水溶液中浸泡10～15min，捞出酸化后的柑橘，在含质量百分含量为0.4～0.6％的NaOH水溶液中浸泡30～50min，过滤，得到粘稠状黄色滤液；

将粘稠状黄色滤液与含质量百分含量为0.4～0.6％的HCl水溶液混合并调节溶液pH至5.0～7.0，得到混合液，将所述混合液与无水乙醇混合，静置，过滤，得到沉淀；

将所述沉淀与无水乙醇混合，均质，过滤，得到松散的颗粒状沉淀；

将松散的颗粒状沉淀与水混合，离心，取上清进行透析，干燥，得到RGI型果胶多糖。

将柑橘在含质量百分含量为0.4～0.6％的HCl水溶液中浸泡10～15min，捞出酸化后的柑橘，在含质量百分含量为0.4～0.6％的NaOH水溶液中浸泡30～50min，过滤，得到粘稠状黄色滤液。在本发明中，所述柑橘更优选在含质量百分含量为0.6％的HCl水溶液中浸泡10min。捞出酸化后的柑橘后，本发明优选在含质量百分含量为0.6％的NaOH水溶液中浸泡40min。在本发明中，所述浸泡的过程优选进行搅拌。本发明所述浸泡的操作，优选在室温进行，本发明所述室温，优选指的是20～25℃，更优选为25℃。本发明所述柑橘优选为柑橘皮或柑橘瓣，本发明所述柑橘瓣优选带囊衣。

得到粘稠状黄色滤液后，本发明将粘稠状黄色滤液与含质量百分含量为0.4～0.6％的HCl水溶液混合并调节溶液pH至5.0～7.0，得到混合液，将所述混合液与无水乙醇混合，静置，过滤，得到沉淀。本发明优选将粘稠状黄色滤液与含质量百分含量为0.6％的HCl水溶液混合并调节溶液pH至6.0。本发明优选将粘稠状黄色滤液与无水乙醇按照体积比为1：(5～10)进行混合，更优选按照体积比为1：5进行混合。在本发明中，所述静置的时间优选为2h。在本发明中，所述过滤优选使用滤袋。在本发明中，所述滤袋优选为300～500目的滤袋，更优选300目。

将所述沉淀与无水乙醇混合，均质，过滤，得到松散的颗粒状沉淀。在本发明中，所述均质优选使用均质机进行，所述均质的时间优选为5～10min，更优选为5min。均质后，本发明优选使用滤袋进行过滤。在本发明中，所述滤袋优选为300～500目的滤袋，更优选300目。

得到松散的颗粒状沉淀后，本发明将松散的颗粒状沉淀与水混合，离心，取上清进行透析，干燥，得到RGI型果胶多糖。在本发明中，所述水优选为无菌水。本发明所述混合后，优选充分搅拌至松散的颗粒状沉淀完全溶解。在本发明中，所述离心优选为低速离心。在本发明中，所述离心的条件优选为4℃，4000rpm，10min。本发明所述透析优选使用8000～12000Da的透析袋，更优选为10000Da。在去离子水中进行透析。本发明所述透析的时间优选为48h。透析后，本发明优选进行冷冻。本发明所述冷冻的温度优选为-80℃。本发明所述干燥优选利用真空冷冻干燥机进行，干燥后，本发明优选进行研磨过筛。

在本发明中，所述橙皮苷的纯度在95％以上。本发明对橙皮苷的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可，如购自上海源叶生物科技有限公司、上海麦克林生化科技有限公司或上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

本发明还提供了上述技术方案所述的柑橘益生元组合物的制备方法，包括以下步骤：将RGI果胶多糖和橙皮苷混合，得到柑橘益生元组合物。

本发明还提供了上述技术方案所述的柑橘益生元组合物或上述技术方案所述制备方法制备得到的柑橘益生元组合物在制备调节人体肠道菌群和/或改善肠道功能的产品中的应用。在本发明中，所述产品优选包括食品、保健品和/或药物。

本发明还提供了上述技术方案所述的柑橘益生元组合物或上述技术方案所述制备方法制备得到的柑橘益生元组合物在制备促进微生物发酵生产短链脂肪酸(SCFAs)的制剂中的应用。在本发明中，所述短链脂肪酸包括乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸中的一种或两种以上。

本发明还提供了上述技术方案所述的柑橘益生元组合物或上述技术方案所述制备方法制备得到的柑橘益生元组合物在制备具有以下①～③中任一项或两项以上所示功能的产品中的应用：①预防和/或改善肥胖；②降低血脂；③改善肝脏脂肪堆积。在本发明中，所述产品优选包括食品、保健品和/或药物。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种柑橘益生元组合物及其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

将100g的温州蜜柑橘皮切成1cm×1cm的丁块后置于25℃，在含0.6％的HCl溶液浸泡10min，过程中充分搅拌，然后将酸化过后的柑橘皮丁捞出，充分沥干后加入到含0.6％的NaOH溶液中再次浸泡40min，过程中充分搅拌。待反应完成后进行过滤，得到粘稠状黄色滤液。向滤液中加入一定量的0.6％的HCl溶液并调节溶液pH至6.0左右，再加入溶液体积5倍的无水乙醇进行沉淀。静置2h后利用300目的滤袋过滤，获取沉淀部分。向沉淀中加入100mL无水乙醇，使用均质机进行均质5min，使用300目的滤袋再过滤，可得到松散的颗粒状沉淀。向沉淀中加入1L的无菌水，充分搅拌至其完全溶解后，将溶液置于低速离心机中离心，离心条件为：4℃，4000rpm，10min。取离心上清液于10000Da的透析袋中，在去离子水中透析48h，然后置于-80℃中冷冻。利用真空冷冻干燥机进行干燥，研磨过筛，得到富含RG-I结构域的柑橘果胶多糖粉末。

橙皮苷来源于柑橘，纯度在95％以上。

按1:1的比例分别取1g的橘皮来源的RGI果胶多糖和1g的橙皮苷，将它们充分混合均匀，得到柑橘益生元组合物。

采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone,PMP)柱前衍生化法来检测RGI果胶多糖和柑橘益生元组合物的单糖组成。

图1所示为RGI果胶多糖和柑橘益生元组合物的单糖组成情况。图1说明RGI果胶多糖中含有很高的半乳糖Gal和阿拉伯糖Ara，而柑橘益生元中除了该两种糖外还含有丰富的葡萄糖Glc和鼠李糖Rha。这是因为柑橘益生元组合物中有橙皮苷，它是由芸香糖(鼠李糖和葡萄糖组成的二糖)和橙皮素组成的。以上结果证明，本发明方法得到的果胶多糖和柑橘益生元组合物中含有丰富的半乳糖和阿拉伯糖。

实施例2

按4:1(RGI果胶多糖和橙皮苷)的质量比制备柑橘益生元组合物用于体内实验，组合物制备方法如下：①获得RGI型果胶多糖：按实施例1所述制备方法，从柑橘皮或囊衣中提取得到RGI型果胶多糖粉末。②获得橙皮苷：从柑橘中提取的橙皮苷(纯度在95％以上)粉末。③将RGI型果胶多糖粉末与橙皮苷粉末按照质量比为4:1混合均匀(RGI型果胶多糖以实际重量进行计算，橙皮苷按照其纯度换算成实际含量后计算)，得到柑橘益生元组合物。

取制备的柑橘益生元组合物，进行肥胖预防实验：

选用4～6周龄的C57BL/6雄性小鼠作为实验动物，共50只。实验分为对照组Chow、模型组Model、RGI型果胶多糖组RGI、橙皮苷组HEP以及柑橘益生元组合物组RGI-HEP，每组各10只。

将柑橘益生元组合物以2.5％(w/w)的总添加量混入60％脂肪供能饲料，用于饮食干预。两个单一作用组的饮食干预量为柑橘益生元组合物中的相应物质的含量。其中，RGI果胶多糖组以2％(w/w)RGI果胶的添加量混入60％脂肪供能饲料，橙皮苷组以0.5％(w/w)橙皮苷的添加量混入。该方法与灌胃法相比，具有对动物的胃肠道无刺激、更接近于真实情况等优点。实验共进行10周(含适应期1周)，其中对照组小鼠每天饲喂10％脂肪供能正常饲料，模型组小鼠饲喂60％高脂饲料，RGI果胶多糖组小鼠饲喂含2％RGI果胶的60％高脂饲料，橙皮苷组喂含0.5％橙皮苷的60％高脂饲料，而柑橘益生元组合物组则饲喂含2.5％柑橘益生元组合物的60％高脂饲料。实验期间不做其他干预，小鼠可自由饮食和摄食。于每周称取小鼠体重，记录小鼠体重变化情况，以观察柑橘益生元组合物对小鼠肥胖的预防效果。解剖后，取五组小鼠的血清测定总胆固醇TC和低密度脂蛋白胆固醇LDL的变化水平，比较柑橘益生元组合物对小鼠的血脂水平改善作用。将小鼠肝脏进行切片和H&E染色，探究柑橘益生元组合物对缓解小鼠肝脏脂肪堆积的效果。

图2所示为小鼠在实验期间的体重变化趋势图，显示了柑橘益生元组合物对高脂饮食小鼠的减肥效果。在实验的第九周时，模型组的小鼠平均体重显著高于对照组小鼠(p<0.001)，也显著高于柑橘益生元组合物RGI-HEP组(p<0.001)。这说明柑橘益生元组合物能够显著改善小鼠的肥胖，减轻体重。与单一作用组(RGI组和HEP组)相比，柑橘益生元组合物RGI-HEP的减重效果更佳。

图3所示为血脂情况结果图，图中所示为小鼠血清中总胆固醇TC和低密度脂蛋白胆固醇LDL-C的含量，图3显示了柑橘益生元组合物对降低总胆固醇TC和低密度脂蛋白胆固醇LDL-C的作用。结果表明，柑橘益生元组合物能够显著降低高脂饮食引起的总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇浓度，改善肥胖引起的高血脂症状。

图4所示为小鼠肝脏切片和H&E染色结果，显示了柑橘益生元组合物对改善肝脏脂肪堆积和损伤的影响结果，图4中圆圈指的是脂滴，箭头指的是脂肪堆积情况，方框指的是肝脏的区域性浸润。结果表明，高脂饮食可诱发非酒精性脂肪肝，具体表现为脂肪堆积，脂滴增多，区域性肝脏浸润增加。RGI果胶多糖与橙皮苷的单一作用均可缓解这一症状，但效果不佳。而补充柑橘益生元组合物RGI-HEP可显著改善肝脏形态，减少脂肪堆积和损伤。

结果表明柑橘益生元组合物RGI-HEP可以有效改善肥胖，降低血脂浓度，改善肝脏的脂肪堆积。

实施例3

制备柑橘益生元组合物，方法如下：①获得RGI型果胶多糖：按实施例1所述制备方法，从柑橘皮或囊衣中提取得到RGI型果胶多糖粉末。②获得橙皮苷：从柑橘中提取的橙皮苷(纯度在95％以上)粉末。③保证总质量相同下，将RGI型果胶多糖粉末与橙皮苷粉末按照质量比为10:1(P10：H1)、5:1(P5：H1)、3:1(P3：H1)、1:1(P1：H1)、1:3(P1：H3)、1:5(P1：H5)和1:10(P1：H10)混合均匀，得到不同质量比的RGI-HEP柑橘益生元组合物(RGI型果胶多糖以实际重量进行计算，橙皮苷按照其纯度换算成实际含量后计算)。

取制备的不同质量比的柑橘益生元组合物及单独的RGI果胶和橙皮苷，进行体外益生特性评价实验：

在厌氧培养箱中，取2男2女成年人(18.6

1.短链脂肪酸含量的测定

肠道微生物发酵的主要代谢产物是短链脂肪酸SCFA，包括乙酸、丙酸、丁酸等。其在调节宿主代谢水平、免疫调节、能量供应等方面具有重要作用。采用气相色谱法GC测定发酵液中的各类短链脂肪酸浓度，结果如图5所示。

图5显示的是发酵24小时后发酵液的短链脂肪酸发酵液中SCFA含量，其中，(A)总SCFAs，(B)乙酸，(C)丙酸，(D)丁酸。结果表明，不同质量比的柑橘益生元组合物在促短链脂肪酸生成上能力不同。质量比过大(果胶多糖为主的10:1、5:1和3:1组)或过小(橙皮苷为主的1:3、1:5和1:10组)时柑橘益生元组合物表现为更接近或甚至不如它们单独的作用。与RGI果胶或橙皮苷单一作用时相比，1:1和3:1质量比下的柑橘益生元组合物能够能有效的促进短链脂肪酸的生成。其中，质量比为1:1时，柑橘益生元组合物促进短链脂肪酸生成的能力最佳，具体表现在乙酸、丙酸、丁酸和总SCFA的生成量上。

2.16SrDNA测序

将收集的沉淀送至北京诺禾致源科技股份有限公司完成16SrDNA测序。

不同质量比的柑橘益生元组合物在调节肠道菌群上表现出不同特性。复配后的柑橘益生元组合物能显著增加Subdoligranulum、Roseburia、Faecalibacterium这三种有益菌的相对丰度，促进效果优于果胶多糖或橙皮苷的单独作用。其中，1:1质量比下的柑橘益生元组合物表现最佳，还表现出了促进益生菌Bifidobacterium和有益菌Prevotella增殖的作用和抑制Klebsiella、Escherichia-shigella、Lachnoclostridium等有害菌生长的作用。

结果说明了一定比例(如1:1)组成的柑橘益生元组合物RGI-HEP比RGI果胶多糖或橙皮苷单独酵解时，更能促进某些重要有益菌的生长，并展现了更强的抑制有害菌的作用。

实施例4

比较小分子果胶多糖DRGI与橙皮苷HEP的组合物与RGI-HEP组合物在短链脂肪酸生成能力上的差异。

利用无金属芬顿降解体系对RGI果胶进行降解，得到具有丰富RG-I结构域的小分子果胶DRGI。具体地，将5gRGI果胶溶于1L超纯水中，然后再加入100mMH

将DRGI果胶与橙皮苷HEP按1:1的质量比进行复配，形成新的一种柑橘益生元组合物DRGI-HEP。取相同质量的DRGI-HEP益生元组合物与本发明的RGI-HEP益生元组合物(1:1的RGI-HEP组合)，利用体外人体粪菌厌氧发酵模型来比较它们的益生活性。具体实验步骤同实施例3所述。

短链脂肪酸结果(即DRGI-HEP组合物与RGI-HEP组合物的促短链脂肪酸生成能力对比结果)如图6所示。Blank作为空白对照组，不外源添加物质。菊粉Inulin是一种常见的益生元，将其作为阳性对照组，本例中加入了与益生元组合物相同质量的菊粉开展试验，实验过程与益生元组合物组保持一致。在相同质量比和相同质量的干预下，RGI-HEP益生元组合物表现出了比DRGI-HEP组合物更加好的促短链脂肪酸生成能力。其中，在乙酸的生成上体现得最为明显。

结果说明柑橘益生元组合物RGI-HEP具有比DRGI-HEP组合物更好的益生特性。

实施例5

比较商品果胶多糖CP与橙皮苷HEP的组合物与RGI-HEP组合物在体内调节肠道菌群的作用。

按4:1的质量比制备不同的柑橘益生元组合物用于体内实验(目前的动物实验中使用的果胶膳食干预剂量一般在1～5％，黄酮一般在0.05～1％。因此，选择了两种物质干预剂量的中间值，果胶干预量定为2％，橙皮苷干预量定为0.5％，最终两者比例为4:1)。RGI-HEP益生元组合物制备方法如实施例1所述。CP-HEP益生元组合物仅需将RGI果胶完全替换成市售商品果胶CP，与橙皮苷HEP充分混合即可制备完成。取制备的RGI-HEP益生元组合物和CP-HEP组合物，进行小鼠膳食干预实验。

选用4～6周龄的C57BL/6雄性小鼠作为实验动物，共40只。实验分为对照组Chow、模型组Model、柑橘益生元组合物RGI-HEP组以及CP-HEP组，每组各10只小鼠。

将上述两种柑橘益生元组合物以相同的的总添加量(2.5％，w/w)混入60％高脂饲料，用于饮食干预。给对照组小鼠每天饲喂10％脂肪供能正常饲料，模型组小鼠饲喂60％脂肪供能高脂饲料，RGI-HEP组饲喂含2.5％RGI-HEP益生元组合物的高脂饲料，CP-HEP组饲喂含2.5％CP-HEP益生元组合物的高脂饲料。实验期间不做其他干预，小鼠可自由饮食和摄食。膳食干预实验结束后，收集小鼠粪便进行16S菌群测序，分析不同益生元组合物对肠道菌群的调节作用。

不同果胶和橙皮苷组合物的调节肠道菌群功能差异结果如图7所示，图7显示了RGI-HEP组合物与CP-HEP组合物对肠道菌群的调节作用，图7中，圆圈为双歧杆菌属，方框为乳酸杆菌属。结果可知，高脂饮食会引起肠道菌群紊乱，其中有益菌的丰度显著下降。而膳食摄入RGI-HEP益生元组合物和CP-HEP组合物菌能够有效改善肠道菌群，维持肠道稳态，促进机体健康。RGI-HEP益生元组合物和CP-HEP组合物均能够高效促进双歧杆菌的增殖，且它们的作用效果比较相似。但它们在促进乳酸杆菌属的生长上表现出巨大差异。其中，RGI-HEP益生元组合物能够更高效、更显著地提升乳酸杆菌的丰度，其促乳酸杆菌生长的能力是CP-HEP组合物的3～4倍。

结果说明RGI-HEP柑橘益生元组合物具有高效调节肠道菌群的能力，且在有益菌增殖上效果方面优于CP-HEP组合物。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。