LAT3基因沉默β细胞株的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一种抑制LAT3基因表达的β细胞株的制备方法，以及LAT3基因沉默β细胞株在研究支链氨基酸及其转运载体LAT3调控β细胞胰岛素分泌中应用。

背景技术

支链氨基酸(branched chain amino acid,BCAAs)包括亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)及缬氨酸(Val)三种必需氨酸，作为营养信号可直接或间接的影响代谢。饮食蛋白中含有丰富的BCAAs，高蛋白或富含BCAAs饮食通过调节体重，肌肉蛋白的合成以及葡萄糖稳态，对机体健康代谢有积极作用。然而，在胰岛素抵抗和2型糖尿病中往往出现BCAAs异常升高，甚至可作为2型糖尿病的主要诱因。这种情况下，值得我们关注的有以下几点：BCAAs或者富含高BCAAs的饮食对胰岛素和葡萄糖的稳态有利还是有害？二是，BCAAs是否是胰岛素抵抗或2型糖尿病的前兆和主要诱因？三，假设BCAAs是2型糖尿病的主要诱因，那么其致病机制是什么？如何解释其诱导疾病而又能维持血糖稳态？因此开展以BCAAs为代表的信号氨基酸在2型糖尿病中的重要作用以及作用机制的研究，有利于解释富含BCAAs的功能性食品对2型糖尿病等典型代谢性疾病的改善。

BCAAs在体内异常富集的一种可能原因是，其特异性转运载体不足。当2型糖尿病或胰岛素抵抗患者体内出现BCAAs异常升高时，缺少向细胞内转运这种氨基酸的转运蛋白的编码基因或者转运过程中出现异常。BCAAs在体内转运到细胞内发挥生物学作用主要依赖L型氨基酸转运载体(LATs)。在四种L型转运载体中，LAT3和LAT4转运谱偏好性转运BCAA以及蛋氨酸，且LAT3主要在胰腺和肝脏中表达。研究表明在不同的癌细胞中，LATs介导蛋白翻译和细胞生长，在前列腺癌形成过程中LAT3高表达，在癌细胞迁移过程中LAT1高表达。在体外敲降LAT3或LAT1的表达能够抑制mTORC1活性，细胞生长和细胞周期。然而LAT3在胰岛素分泌及抵抗中的作用尚不清楚。

发明内容

本发明公开了一种与L型氨基酸转运载体3相关的生物材料与亮氨酸在如下(1)-(3)中任一种中的应用：

(1)制备抑制胰岛素分泌的产品；

(2)制备抑制胰岛β细胞胰岛素分泌的产品；

(3)制备抑制胰岛素分泌量的转基因细胞。

优选地，所述生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码L型氨基酸转运载体3的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因细胞系。

本发明还提供了所述L型氨基酸转运载体3的核酸分子为将SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2或SEQ ID NO.3引物插入慢病毒表达骨架质粒，构建的慢病毒基因沉默质粒。

本发明还提供了一种制备亮氨酸处理后可抑制胰岛素分泌量的转基因细胞的方法，包括提高受体细胞中L型氨基酸转运载体3的表达量和/或活性，得到转基因细胞的步骤；所述转基因细胞的胰岛素分泌量低于受体细胞；

所述L型氨基酸转运载体3的核酸分子为将SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ IDNO.3引物插入慢病毒表达骨架质粒，构建的慢病毒基因沉默质粒。

上述方法中，所述抑制受体细胞中L型氨基酸转运载体3的表达量和/或活性的方法为在受体细胞中抑制表达L型氨基酸转运载体3；

所述抑制表达的方法为将所述L型氨基酸转运载体3的编码基因导入受体细胞；所述L型氨基酸转运载体3的编码基因通过表达L型氨基酸转运载体3的慢病毒质粒导入受体细胞。

上述方法中，所述受体细胞为胰岛β细胞；所述胰岛β细胞具体为RIN-M5F细胞。上述方法制备得到的沉默转基因细胞。

本发明还有一个目的是提供一种抑制胰岛素分泌的产品，其活性成分为由L型氨基酸转运载体3与亮氨酸组成的组合物。

有益效果

本发明将三条shRNA分别进行引物合成，并插入慢病毒表达骨架质粒中，完成慢病毒基因沉默质粒构建，并通过慢病毒转染获得沉默LAT3的β细胞株。实验结果证明：LAT3基因沉默的β细胞株可显著抑制LAT3的表达，并经亮氨酸处理后胰岛素的分泌量降低，和正常细胞及过表达体系相比较，说明亮氨酸依赖LAT3基因参与调控β细胞胰岛素分泌。本发明为研究LAT3及支链氨酸在胰岛素分泌中的作用以及支链氨基酸相关食品在血糖调控中的作用提供一种有力的工具。

附图说明

图1为LAT3基因沉默慢病毒质粒示意图；

图2为LAT3基因沉默慢病毒质粒测序比对结果；

图3为LAT3基因沉默RIN-m5f细胞；

图4为亮氨酸对LAT3基因沉默RIN-m5f细胞胰岛素影响。

具体实施方式

实施例1

一种LAT3基因沉默的β细胞株的制备：

一、LAT3基因沉默的慢病毒质粒的构建及包装

1.利用美国国家生物技术信息中心(National Center of BiotechnologyInformation,NCBI)网站数据库，查询获得编码LAT3(Slc43a1)的基因mRNA序列(mRNA ID:NM_001107742)：

2、根据LAT3的基因序列，设计3条shRNA：

①LAT3 shRNA01：

5’-GCAGGAAGAGATGCTCAATCTCGAAAGATTGAGCATCTCTTCCTGC-3’；

②LAT3 shRNA02：

5’-GCGTCTTCCGCCATCACATTTCGAAAAATGTGATGGCGGAAGACG C-3’；

③LAT3 shRNA03：

5’-GCAATCAAGGCCTGATAAAGCCGAAGCTTTATCAGGCCTTGATTGC-3’；

3、将三条shRNA分别进行引物合成，并插入慢病毒表达骨架质粒中(图1)，完成慢病毒基因沉默质粒构建。

4、完成LAT3基因沉默慢病毒质粒构建后，我们对插入的shRNA序列进行了测序比对鉴定，如图2所示，经过测序比多获得了构建正确的质粒。

二、慢病毒包装

1、HEK 293FT细胞准备

将(3-5)×10

2、慢病毒包装系统转染

①使用ddH

②取1支1.5mL离心管(标记为A管)，加入300μL Opti-MEM培养基(lifetechnologies，31985-070)及40μL EpFectTM Transfection Reagent(BioGeek，BG20201S)，混匀后室温静置5min；

③取1支1.5mL离心管(标记为B管)，加入2.5μL终浓度为1.0μg/μL的LAT3基因沉默慢病毒质粒溶液及7.5μL的包装质粒混合物(Package Plasmid Mix)，充分混匀；

④将A管中溶液加入B管中，得到混合溶液，充分混匀，室温静置15-30min；

⑤将混合溶液逐滴接种至含有HEK 293FT细胞培养液(HEK 293FT细胞培养液是将HEK 293FT细胞和DMEM完全培养基混匀得到的，HEK 293FT细胞接合度为80％-85％)的培养皿中，轻微水平震荡培养皿以混匀，得到培养体系；然后将培养体系置于37℃，5％ CO

3、慢病毒收集及浓缩

①转染48h后，收集含有慢病毒的上清液；向培养皿中补充10-15mL新鲜的RPMI-1640完全培养基(22400089，Gibco)，继续培养24h，进行第二次病毒上清液收集；

②将两次收集的病毒上清液混合，并使用0.45μm滤器进行过滤，过滤后的病毒液可以进行浓缩或直接感染目的细胞；

③按照病毒上清液：浓缩试剂(BioGeek，BG201001L)＝5：1的比例进行混合，得到混合液，4℃放置2h或过夜；

④将混合液按照4℃，4000g离心30min，可见管底有米白色沉淀；

⑤小心移去上清，切勿碰触沉淀物，加入适量体积PBS溶液(Solarbio，P1020-500)，用微量移液器轻轻吹打重悬沉淀物，得到病毒浓缩液

⑥将病毒浓缩液分装，保存于-80℃，即取即用，切忌反复冻融。

四、慢病毒转导RIN-m5f细胞

①将生长状态良好的RIN-M5F细胞(ATCC编号为CRL-11605)消化计数后，稀释至3×10

②待细胞汇合度达到70-80％，将RPMI-1640完全培养基替换为使用37℃水浴预热的新鲜的RPMI-1640完全培养基；

③向含有新鲜的RPMI-1640完全培养基的培养孔中分别加入最优MOI(MOI为10)的慢病毒液和对照慢病毒液，同时加入终浓度为8μg/mL的促感染试剂polybrene(BioGeek，BG20301S)；

④感染24h后，将RPMI-1640完全培养基替换为使用37℃水浴预热的新鲜的RPMI-1640完全培养基；

⑤感染48-72h后，根据细胞状态每24-48h更换新鲜的RPMI-1640完全培养基，并向培养基中添加嘌呤霉素(A1113802，Thermo Fisher)，使其在培养基中的浓度为0.4ug/ml，筛选5-7天，分别得到LAT3基因沉默的RIN-M5F细胞和对照细胞(图3)，分别将其命名为RIN-M5F-YW020细胞和RIN-M5F-PT080细胞，冻存备用。

实施例2、L型氨基酸转运载体3在调控胰岛素分泌水平中的应用

该实施例通过用亮氨酸处理RIN-M5F-PT080和RIN-M5F-YW020细胞，研究亮氨酸对LAT3基因沉默的细胞株的胰岛素分泌水平的影响。具体步骤如下：

1、分别接种实施例1制备得到的RIN-M5F-PT080和RIN-M5F-YW020细胞于六孔板中，待细胞密度为70-80％时，收集细胞。

2、用KRBH缓冲液清洗2遍，然后在含葡萄糖KRBH缓冲液中37℃平衡20min，再用含葡萄糖和亮氨酸的KRBH缓冲液处理细胞1h，收集上清。

3、采用大鼠胰岛素ELISA试剂盒(Mlbil，ml302840-2)检测亮氨酸处理后细胞中的胰岛素分泌水平。具体检测方法如下：

(1)标准品的加样

设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

(2)加样

分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

(3)温育

用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

(4)配液

将30(48T的20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30(48T的20倍)倍稀释后备用。

(5)洗涤

小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

(6)加酶

每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

(7)温育

操作同(3)。

(8)洗涤

操作同(5)。

(9)显色

每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。

(10)终止

每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)，依序测量450nm波长下各孔的吸光度。

结果如图4所示。从图中可以看出：和对照组细胞以及LAT3基因过表达(RIN-M5F-YW246)相比，亮氨酸处理后的LAT3基因沉默的β细胞中的胰岛素分泌量降低，说明亮氨酸依赖LAT3基因参与调控β细胞胰岛素分泌。