6'-唾液酸化乳糖联合罗伊氏乳酸杆菌在制备食物过敏药物中的应用

技术领域

本发明涉及疾病治疗领域，特别是涉及6′-唾液酸化乳糖联合罗伊氏乳酸杆菌在制备食物过敏药物中的应用。

背景技术

新生儿肠道菌群的建立是肠道成熟、代谢和免疫规划的关键阶段，因此也是短期和长期健康状态的关键阶段。健康的肠道菌群和免疫系统的发育发生在生命早期，主要是通过阴道/自然分娩和母乳接触母体微生物而形成的。母乳对新生儿肠道菌群的发育至关重要。虽然婴儿肠道最初在微生物群中的定植可能是不稳定的，但出生后新生微生物群的发育有一条独特的路径，这条路径是由母乳的成分塑造的。

近些年来的研究发现母乳寡糖(Human milk oligosaccharides，HMOs)对新生儿肠道微生态有重要的调节作用，特别是促进有益菌的生长，拮抗致病菌，免疫调节等，因此受到很多母婴领域研究的关注。母乳中含有大量的唾液酸(Sialic acid,SA)，其中70-83％的SA与HMOs相结合，是HMOs的关键成分。SA对改善婴儿发育、大脑功能和增强免疫力至关重要。ST6Gal-1是一种重要的糖基转移酶，它以α2,6键的连接方式将SA残基添加到寡糖底物的末端位置，从而形成唾液酸化的母乳寡糖。最近的研究发现，唾液酸化的母乳寡糖对他们的正常发育和新生儿的健康是必不可少的。6′-唾液乳糖(6′-sialyllactose，6′-SL)是唾液酸化母乳寡糖的核心结构之一，在促进益生菌生长、促进肠道成熟、抑制病原菌粘附等方面具有重要作用。

2021年墨尔本的一项最新研究发现，母乳中的唾液酸化寡糖，特别是α2,6-键连接的6′-SL含量与新生儿过敏性疾病的发生呈负相关，这说明α2,6连接的唾液酸化母乳寡糖可能具有帮助新生儿建立免疫耐受的作用。近年来，儿童过敏性疾病的发病率呈明显上升趋势，我国儿童过敏性疾病的发病率超过3.3％。研究表明，这些疾病发生中最关键的环节之一就是调节性T细胞(Regulatory T cell，Treg)细胞功能的缺乏或抑制。Treg细胞包括一组具有抑制能力的异质T细胞亚群，它们对于削弱对病原体的过度免疫反应、诱导免疫耐受以及避免和控制自身免疫性和过敏性疾病的发展是必不可少的。在T细胞水平，Treg细胞不仅直接抑制过敏原特异性Th2细胞的激活，而且还可以抑制Th1和Th17细胞驱动的T细胞反应，从而预防和抑制过敏性炎症的发生。

最近关于肠道菌群定植和分布与早期食物致敏之间的关系的研究表明，微生物群可能在食物过敏(Food allergy，FA)的发展中起重要作用。同时，免疫耐受也受到肠道微生物群功能和结构的调节。肠道共生微生物群对Treg细胞的分化和增殖至关重要，可产生短链脂肪酸(Short chain fatty acids，SCFAs)，SCFA可以诱导保护性粘膜Treg细胞反应，增强肠道屏障的完整性。Furusawa等人也发现肠道中的SCFAs与结肠中Foxp3和Tregs的数量正相关。但是现有技术中还未有关于6′-唾液乳糖联合益生菌治疗食物过敏的报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了6′-唾液酸化乳糖联合罗伊氏乳酸杆菌在制备食物过敏药物中的应用，本发明探究在哺乳期给母鼠补充6′-唾液酸化乳糖和罗伊氏乳酸杆菌对肠道菌群及免疫的调节作用，表明6′-唾液酸化乳糖和罗伊氏乳酸杆菌能够治疗食物过敏。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了过表达ST6Gal-1基因的试剂在制备治疗食物过敏药物中的应用。

本发明还提供了过表达ST6Gal-1基因在提高哺乳动物乳汁中6′-唾液酸化乳糖含量中的应用。

本发明还提供了6′-唾液酸化乳糖在制备治疗食物过敏药物中的应用。

本发明还提供了罗伊氏乳酸杆菌在促进Treg细胞增殖中的应用。

本发明还提供了6′-唾液酸化乳糖联合罗伊氏乳酸杆菌在制备食物过敏药物中的应用。

本发明还提供了6′-唾液酸化乳糖联合罗伊氏乳酸杆菌在制备促进免疫耐受药物中的应用。

本发明还提供了一种治疗食物过敏的药物组合，包括6′-唾液酸化乳糖和罗伊氏乳酸杆菌。

优选的，所述6′-唾液酸化乳糖的质量与罗伊氏乳酸杆菌的数量比为5mg:1×10

优选的，所述食物过敏是由卵清蛋白诱导。

优选的，所述食物过敏是由卵清蛋白诱导。

本发明利用ST6Gal-1基因敲除(ST6Gal-1

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为基因敲除模型鼠哺育野生型子代实验分组。

图2为对基因敲除模型鼠哺育野生型子代建立过敏模型分组。

图3为子代建立食物过敏模型补充6′-唾液酸化乳糖联合罗伊氏乳杆菌的研究。

图4为ST6Gal-1

图5为ST6Gal-1

图6为ST6Gal-1

图7为ST6Gal-1

图8为ST6Gal-1

图9为ST6Gal-1

图10为ST6Gal-1

图11为6′-SL联合罗伊氏乳杆菌缓解子鼠过敏。

图12为哺乳期给ST6Gal-1

图13为罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)促进Treg细胞增殖。

具体实施方式

本发明提供了过表达ST6Gal-1基因的试剂在制备治疗食物过敏药物中的应用。在本发明中，所述食物过敏优选是由卵清蛋白诱导。本发明对所述卵清蛋白诱导食物过敏模型没有特殊限定，本领域技术人员按照常规操作即可。

本发明还提供了过表达ST6Gal-1基因在提高哺乳动物乳汁中6′-唾液酸化乳糖含量中的应用。

本发明还提供了6′-唾液酸化乳糖在制备治疗食物过敏药物中的应用。在本发明中，所述食物过敏优选是由卵清蛋白诱导。本发明对所述卵清蛋白诱导食物过敏模型没有特殊限定，本领域技术人员按照常规操作即可。

本发明还提供了罗伊氏乳酸杆菌在促进Treg细胞增殖中的应用。

本发明还提供了6′-唾液酸化乳糖联合罗伊氏乳酸杆菌在制备食物过敏药物中的应用。在本发明中，所述食物过敏优选是由卵清蛋白诱导。本发明对所述卵清蛋白诱导食物过敏模型没有特殊限定，本领域技术人员按照常规操作即可。

本发明还提供了6′-唾液酸化乳糖联合罗伊氏乳酸杆菌在制备促进免疫耐受药物中的应用。

本发明还提供了一种治疗食物过敏的药物组合，包括6′-唾液酸化乳糖和罗伊氏乳酸杆菌。在本发明中，所述6′-唾液酸化乳糖的质量与罗伊氏乳酸杆菌的数量比优选为5mg:1×10

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1实验材料、试剂与仪器

1.1实验材料

Sprague Dawley(SD)大鼠，SPF级，8-10周龄，购于大连医科大学SPF(specificpathogen free)实验动物中心。以下模型采用常规方法得到，采用常规方法通过CRISPR/Cas9系统建立的ST6Gal-1基因敲除(ST6Gal-1

6′-唾液乳糖(6′-SL)来源于上海和璞生物技术有限公司。罗伊氏乳酸杆菌来源于BNCC菌种库(BNCC192190)。

1.2实验试剂

表1试剂名称

1.3实验仪器

表2实验仪器

2实验方法

2.1 ST6Gal-1基因敲除(ST6Gal-1

2.1.1实验动物与分组

实验动物分组如图1所示。将8-10周龄的SD野生型(ST6Gal-1

2.1.2母鼠乳汁主要唾液酸化寡糖检测

将相同部位同等大小的母鼠乳腺组织放入无菌试管中，加入5mL 45℃三蒸水，在45℃水浴锅中静置5min，随后用超声波细胞粉碎机超声10次，每次8s。用无菌滤网将析出的乳汁过滤到新试管中，重复上述步骤，共收集15mL乳汁提取液，储存于-80℃。

取约2mL母鼠乳汁样品，在4℃下以8000rpm离心10min，去除上层脂质后，将脱脂后的乳汁溶液冷冻干燥。在冻干粉中加入1mL乙醇/水(2：1)，然后在4℃下以8000rpm离心10min，以去除大部分蛋白质，取上清液进行分析。使用HPLC-ESI/TOF MS系统对母鼠乳汁主要的唾液酸化寡糖进行检测，通过Agilent Mass Hunter定性分析软件进行母鼠乳汁寡糖鉴定和定量

2.1.3子鼠肠道菌群检测

用电子天平秤称取150mg结肠内容物。按照

2.1.4子鼠血清免疫相关指标检测

收集血液样本，室温自然凝固30min后，在4℃下3000rpm离心15min，获得血清样本，在-80℃进行保存。使用酶联免疫吸附测定试剂盒(ELISA，江苏酶标生物科技有限公司)，按照操作说明检测大鼠血清白介素6(IL-6)、白介素8(IL-8)白介素10(IL-10)、白介素4(IL-4)、白介素17(IL-17)、干扰素γ(IFN-γ)、转化生长因子β(TGF-β)和分泌型免疫球蛋白A(sIgA)水平。

2.1.5子鼠脾脏和肠系膜淋巴结(MLN)淋巴细胞比例检测

(1)制备单细胞悬液：取新鲜大鼠脾脏和MLN放入PBS缓冲液中研磨。200目滤网过滤，4℃2500rpm离心5min后弃掉上清液。

(2)去除红细胞：加3～5mL红细胞裂解液，混匀放冰上，静置4-5min。加5mL PBS缓冲液重悬，洗涤两次。

(3)细胞计数：10倍或100倍稀释后，显微镜下计数，保证每管约1×10

(4)封闭：加200μL 3％BSA，放在冰上，封闭40min，加200μL PBS缓冲液洗涤，50μL重悬。

(5)表面抗体孵育：加入不同荧光标记抗体(CD4和CD25)各0.5μL，避光孵育40min。

(6)破膜：加1mL 1×Buffer洗涤后，加500μL破膜液Foxp3 Transcription Factorbuffer set，冰上避光孵育30～60min。

(7)封闭：加1mL 1×Buffer洗涤后，每管加20μL 3％的BSA(封闭抗体，避免FoxP3与其他物质结合)冰上避光孵育15min。

(8)FoxP3抗体孵育；加0.6μL FoxP3抗体，避光孵育30min，加1×Buffer洗涤，离心去上清。

(9)上机：加200μL PBS缓冲液，重悬后用200目滤网过滤，上机流式细胞仪，结果用FlowJo10软件分析。

2.2 ST6Gal-1

2.2.1实验动物与分组及食物过敏(FA)模型的建立

如图2所示，将第一次致敏时间记为第0天，腹腔注射含有40μg OVA和1mgAl(OH)

2.2.2 FA子鼠直肠温度监测

在FA模型中，在最后一次激发前和激发后1h，分别用大鼠肛温计测量大鼠的直肠温度，通过其温度的变化来评估FA的程度。

2.2.3 FA子鼠结肠H&E染色及病理评分

取近盲肠端结肠肠段1cm，冲洗干净后，加4％组织固定液，固定72h后，常规脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，镜下拍照，观察组织病理变化，进行病理评分

2.2.4 FA子鼠过敏相关的血清指标检测

在最后一次激发后，收集血液样本，室温放置30min后，在4℃下3000rpm离心15min，获得血清样本。使用酶联免疫吸附测定试剂盒(ELISA，江苏酶标生物科技有限公司)检测FA子鼠血清OVA特异性免疫球蛋白E(OVA specific immunoglobulin E，OVA-IgE)、肥大细胞蛋白酶(Mast cell protease 1，MCP-1)、IL-17、IL-4和IFN-γ水平。评估FA过敏的严重程度。

2.2.5 FA子鼠脾脏和MLN的调节性T细胞(Treg)比例检测

实验方法如前2.1.5所述。

2.2.6 FA子鼠肠道菌群检测

实验方法如前2.1.3所述。

2.3 6′-SL联合罗伊氏乳杆菌调节子鼠肠道菌群及免疫耐受的机制研究

2.3.1体内研究

将野生型(WT)和ST6Gal-1基因杂合(H)母鼠与野生型公鼠交配，通过交叉喂养方式保证母鼠喂养的子代都为野生型。于哺乳期第三周(第15天)时对其中一组H母鼠哺育的子代补充每日6′-SL联合罗伊氏乳酸杆菌BNCC192190，6′-SL以5mg/kg剂量进行灌胃，随即灌服200μL罗伊氏乳酸杆菌(菌含量为10

2.3.2乳酸杆菌体外对Treg细胞的诱导作用

为了探究罗伊氏乳杆菌L.reuteri对子鼠脾脏Treg细胞的作用，从4周龄子鼠的脾脏中分离出总淋巴细胞，分别与添加0.5mg/mL的6′-SL共培养和与不同浓度的L.reuteri和L.johnsonii上清液和菌体裂解液共培养。方法如下：吸取1mL(OD620＝1.5)的L.reuteri和L.johnsonii培养液，3,000rpm离心15min。将上清液视为细菌分泌物，沉淀物用1mL PBS重悬，放冰上进行超声破碎，待其完全释放细胞成分后，用0.2μm过滤器过滤，视为裂解物。

在RPMI-1640完全培养基中培养2-3×10

结果

1.母乳缺乏6′-唾液酸化乳糖影响子代肠道菌群结构及免疫平衡

1.1 ST6Gal-1

为了确定6′-唾液酸化乳糖(6′-SL)对子代肠道微生态和免疫的影响，利用ST6Gal-1

1.2 ST6Gal-1

由于ST6Gal-1基因缺失影响了母鼠乳汁中唾液酸化寡糖水平，利用杂合(H)和基因敲除(KO)的母鼠对子鼠进行哺乳(图1，详见材料和方法部分)，目的是确定这些差异是否影响其后代的肠道微生态及免疫耐受水平。为了深入研究这一影响，利用16S rRNA基因高通量测序法，检测了不同母鼠哺育的子鼠肠道菌群。结果显示H和KO母鼠所哺育的子代(H→n和KO→n)肠道中微生物群落α多样性(以Chao1指数和Shannon指数所表示)显著低于WT母鼠哺育的子代(WT→n)(图5中A、B，**p<0.01；***p<0.0001)。NMDS分析也发现三组之间有明显的区分(图5中C)。α-多样性和β-多样性分析表明，H和KO母鼠所哺育的子代(H→n和KO→n)的肠道微生物群落结构发生明显改变。进一步采用线性判别分析效应大小(LEfSe)来鉴别各组间丰度差异显著的菌群，结果如图5中D所示，普氏菌科(Prevotellaceae)和拟杆菌科(Bacteroidaceae)的微生物的相对丰度在WT→n组更丰富，而KO→n组颤螺旋菌(Oscillospirales)和毛螺杆菌(Lachnospiraceae)更丰富。在种水平上，罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)的丰度低于WT→n(图5中E)。

1.3ST6Gal-1

同时通过酶联免疫吸附试验(ELISA)分析了子代血清免疫相关细胞因子的水平。发现相对于WT→n组，H→n和KO→n组血清IL-6水平增加，而IFN-γ水平降低，但无统计学差异(图6中A、C，所有p>0.05)。TGF-β是影响细胞生长和分化的细胞因子,具有调节乳导管生长和腺泡发育与功能分化的作用。研究显示，初乳中的TGF-β可以预防纯母乳喂养期间婴儿过敏性疾病的发生，对启动新生儿IgA的产生也发挥重要作用。与WT→n组相比，H→n组TGF-β水平明显降低(图6中B，*p<0.05)。H→n组和KO→n组血清IL-10较WT→n组均显著下降(图6中D，***p<0.001)。而IL-17水平在KO→n组有所增加，但是没有统计学差异(图6中E，p>0.05)，进一步将IL-10与IL-17进行了一个比值的分析，发现H→n组和KO→n组较WT→n组均显著降低(图6中F，p＝0.018，p＝0.0024)，且H→n组较KO→n组的比值也明显降低(图6中F，p＝0.0207)。结果表明子代可能存在一个免疫失调的现象。

进一步通过流式细胞术检测了哺乳末期子鼠脾脏和肠系膜淋巴结(MLN)的淋巴细胞(图7中A、D)，发现脾脏中KO→n组总淋巴细胞数较WT→n组H→n组显著降低(图7中B，*p<0.05)，而在MLN中总淋巴细胞数也降低，但无统计学差异(图7中E，p＞0.05)。与WT→n组相比，H→n和KO→n组在脾脏中的Treg细胞比例均明显下调(图7中C，**p<0.01，***p<0.001)，在MLN中，KO→n组的Treg细胞比例较WT→n组也明显降低(图7中F，*p<0.05)。

2.母乳缺乏6′-SL其子代更易发生过敏

2.1 ST6Gal-1

接下来为了深入探究6′-SL对子鼠免疫耐受的影响，将不同母乳哺育的子鼠进行一个卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)诱导的食物过敏(FA)模型的建立(图2)，通过检测相关指标来分析各组之间的差异，实验结果表明，与WT→n-FA组相比，H→n-FA和KO→n-FA组子鼠在激发后1h内，体温明显下降(图8中A，*p<0.05)。HE染色的结肠切片显示，与WT→n-FA组子鼠比较，H→n-FA组子鼠结肠黏膜增生，组织结构扭曲，血管扩张和充血更严重，KO→n-FA组小鼠组织学结构丧失，绒毛部分剥落，结构紊乱，绒毛上皮细胞局灶性脱落、坏死，黏膜下层有炎症细胞浸润(图8中B)。H→n-FA和KO→n-FA组小鼠结肠的组织学病理评分均显著高于WT→n-FA组子鼠(图8中C，*p<0.05，**p<0.01)。

同时通过ELISA方法检测了血清过敏相关指标，结果显示与WT→n-FA组小鼠相比，H→n-FA和KO→n-FA组小鼠血清OVA-IgE和IL-17水平增多，但无显著差异(图8中D、F，所有p>0.05)。KO→n-FA组的MCP-1和Th2细胞分泌的IL-4水平较WT→n-FA组和H→n-FA组均明显增多(图8中E、G，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。而Th1细胞分泌的IFN-γ在H→n-FA和KO→n-FA组较WT→n-FA组显著减少(图8中H，*p<0.05)。提示H→n-FA和KO→n-FA组存在免疫失衡，Th1和Th2平衡被打破，过敏表现更严重。

2.2 ST6Gal-1

进一步分析了过敏子代的脾脏和MLN的淋巴细胞(图9中A、D)。脾脏中H→n-FA和KO→n-FA组淋巴细胞比例较WT→n-FA组偏低(图9中B，p＞0.05)，而MLN中KO→n-FA组淋巴细胞显著低于WT→n-FA组和H→n-FA(图9中E，**p<0.01)。H→n-FA和KO→n-FA组Treg细胞在脾脏和MLN中均显著低于WT→n-FA组(图9中C、F，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)，说明它们的免疫耐受性比较差，可能与肠道菌群变化有密切的关系。

2.3 ST6Gal-1

进一步检测了FA子鼠肠道菌群。结果显示与WT母鼠哺育的FA子代(WT→n-FA)相比，H和KO母鼠所哺育的子代(H→n-FA和KO→n-FA)肠道中微生物群落α多样性(以Observedspecies指数所表示)降低，但无统计学差异(图10中A，P＞0.05)。PCoA分析也发现WT→n-FA组和KO→n-FA组菌群的分布有明显的差异(图10中B)。α-多样性和β-多样性分析表明，KO母鼠所哺育的FA子代(KO→n-FA)的肠道微生物群落结构发生明显改变。为了进一步研究肠道菌群在所有类群中的不同分类组成，对其属水平和种水平谱进行了比较。在属水平上，与WT→n-FA组相比，KO→n-FA组乳酸杆菌(Lactobacillus)的丰度明显降低(图10中C)，且在种水平上，罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)和约氏乳杆菌(L.johnsonii)的丰度也均降低(图10中D，*p<0.05)。LEfSe分析发现WT→n-FA组乳杆菌科(Lactobacillaceae)和乳杆菌属(Lactobacillus)等为优势菌，而KO→n-FA组放线菌门(Actinobacteria)、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)和棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)等为优势菌(图10中E)。

3. 6′-SL联合罗伊氏乳杆菌调节子鼠免疫耐受的机制研究

3.1 6′-SL联合罗伊氏乳杆菌促进子鼠免疫耐受

实验结果表明，与未补充组相比，补充6′-SL联合罗伊氏乳杆菌(6′-SL+L.r)组的子鼠在激发后1h内，体温无明显下降(图11，p＞0.05)。HE染色的结肠切片显示，与H母鼠哺育的子鼠比较，补充SA+Pro组的子鼠结肠黏膜增生，组织结构扭曲，血管扩张和充血情况明显缓解(图11)，且结肠的组织学病理评分显著降低(图11，*p<0.05)。同时通过ELISA方法检测了血清过敏相关指标，结果显示与H组子鼠相比，补充6′-SL联合罗伊氏乳杆菌组子鼠血清OVA-IgE和IL-17水平增多，但无统计学差异(图11，所有p＞0.05)，而MCP-1和IL-4水平显著降低(图11，*p<0.05)。以上结果表明，哺乳期6′-SL联合罗伊氏乳杆菌干预可减轻子代过敏情况。

进一步分析了过敏子代的脾脏和MLN的淋巴细胞(图12)。结果发现，与未补充6′-SL联合罗伊氏乳杆菌(6′-SL+L.r)的H组相比，补充组的H子代脾脏淋巴细胞比例增多(图12，*p<0.05)，Treg细胞比例增多(图12，*p<0.05)。在MLN中，与未补充组相比，补充6′-SL联合罗伊氏乳杆菌(6′-SL+L.r)的H母鼠的子代淋巴细胞比例无明显变化(图12，p＞0.05)，而Treg细胞比例明显增多(图12，*p<0.05)。以上结果说明在哺乳期给ST6Gal-1

3.2罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)促进Treg细胞增殖

体外培养实验发现唾液酸化母乳寡糖并不能直接促进乳酸杆菌生长，因此猜测是否这两种乳酸杆菌直接调节了子代的免疫平衡，进而增强了免疫耐受？接下来进行了体外机制实验研究，从4周龄的WT子鼠中分离出总淋巴细胞，进行体外培养诱导Treg细胞生成，并将其与6′-SL以及不同浓度的L.reuteri和L.johnsonii标准菌株上清液和细菌裂解物一起孵育(图13中B-G)。通过流式细胞术检测发现，用稀释10倍的L.reuteri细菌裂解液刺激后，脾脏中Treg细胞较对照组显著增加(图13中H，****p<0.0001)。结果表明L.reuteri细菌裂解物促进了Treg细胞的增殖。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

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