一种灵芝孢子粉酶解物的制备与提取工艺及其产品和应用

技术领域

本发明涉及灵芝孢子粉酶解物的技术领域，尤其涉及一种灵芝孢子粉酶解物的制备与提取工艺及其产品和在制备具有改善睡眠作用的复方制剂中的应用。

背景技术

灵芝为担子菌纲多孔菌目多孔菌科(Polyporaceae)灵芝属(Ganoderma)药食两用真菌，被称为木灵芝、菌灵芝、魂草、仙草等，在我国灵芝药用已经有2000多年的历史。灵芝孢子(Ganoderma Lucidum Spore)是灵芝生长成熟期从菌盖弹射出来及其细小的孢子，为灵芝的生殖细胞，具有灵芝的全部遗传物质，现代药理研究表明，灵芝孢子粉具有许多药理作用，包括抗肿瘤、增强免疫力、抗病毒等。

灵芝孢子粉主要有效成分为多糖类、三萜类、肽类、蛋白质、氨基酸及微量元素等，其中蛋白质含量15～18％，其主要分布在灵芝孢子粉的细胞壁中，灵芝孢子粉酶解物是以灵芝孢子粉为原料，利用酶解等生物技术制得的一类混合物，其既具有灵芝孢子粉有效成分(灵芝多糖、灵芝三萜等)又含蛋白质酶解得到的多肽、寡肽和氨基酸等(含量以寡肽为主)，其中的寡肽是一类氨基酸残基数目在2～12个的小肽。

申请公布号为CN 106834403 A的中国专利文献公开了一种灵芝多肽的提取方法，包括(1)将灵芝子实体粉碎，得到灵芝粉；(2)灵芝粉沸水回流4h；(3)回流提取物用木瓜蛋白酶酶解4-6h；(4)喷雾干燥酶解物。

申请公布号为CN 101366737 A的中国专利公开了一种纳米灵芝孢子粉多肽制品的制备方法，包括(1)灵芝孢子粉加8-10倍水混合，用0.5-3.0％中性蛋白酶35-65℃下酶解8-20h，(2)灭酶3-15min(3)浓缩酶解物，冻干或喷雾干燥制得纳米灵芝孢子多肽制品，其成分为多肽30-50％，多糖为10-15％，氨基酸20-40％，其余为微量的三萜、甾醇等物质。

申请公布号为10819195A的中国专利公开了一种灵芝多肽的提取方法，包括以下步骤：(1)灵芝子实体粉碎；(2)70-80％乙醇回流提取3-6h；(3)提取液浓缩，用氯仿萃取浓缩液中的蛋白质；(4)萃取液浓缩，并分别用硅胶柱和LH-20凝胶柱纯化，洗脱物减压浓缩并干燥得到灵芝多肽纯品。

以上三种方法中，公布号为CN 106834403 A的专利文献制备原料为灵芝子实体，其蛋白质含量仅2％左右，由此提取得到的物质中蛋白质、肽和氨基酸等物质的相对含量较低，而且提取得率不高，公布号CN 101366737 A的专利文献中，得到的产品组分以水溶性物质为主，如灵芝多肽含量为30-50％，粗多糖含量10-30％，氨基酸含量20-40％，其他的灵芝孢子中醇溶性的有效成分如灵芝酸(灵芝三萜)、皂甙、麦角甾醇未得到有效提取，公布号为CN 10819195 A的专利文献得到的是一种纯度较高的灵芝多肽物质，其中灵芝中一些功效成分如灵芝三萜、灵芝多糖在分离纯化过程中被去除了，所以终产物的功效成分相对原料灵芝减少了，其相应的功能作用也会减少或降低，而且由于其终产物灵芝多肽纯度较高，所以相对得率较低。

失眠是一种常见的睡眠障碍，其发生与躯体疾病、压力、焦虑和抑郁状态密切相关，近年来，随着社会的发展和生活压力的加大，失眠的发病率呈上升的趋势。临床上对失眠的治疗以镇静、催眠类化学药物为主，这些药物对中枢神经系统有明显的不良反应，长期使用不仅有耐药性和依赖性，而且会加重病情。因此，安全性相对较高的具有改善睡眠作用的功能食品受到人们的关注。

卫生部《保健食品检验与评价技术规范(2003版)》中规定了改善睡眠功能保健食品的评价方法：直接睡眠实验、延长戊巴比妥钠睡眠时间实验、戊巴比妥钠阀下剂量催眠实验、巴比妥钠睡眠潜伏实验等。

目前已报道的灵芝多肽的生物活性有抗氧化、降血糖、抗衰老等，如包焜等(包焜等，灵芝活性组分在小鼠体内的降糖功能研究，中国兽药杂志，2015,49(1):29-32)研究认为灵芝多肽可以通过增强肝脏细胞中SOD的活性，减少有害物质MDA的生成，增强机体抗氧化能力，保护糖尿病小鼠胰岛B细胞免受自由基和活性氧的进一步破坏，使胰岛素的合成和分泌有所升高，从而降低血糖含量。董颖等(董颖等，灵芝多肽的分离检识和抗氧自由基活性研究，北京医科大学学报，1993，25(2)：145-146)经实验证明灵芝多肽具有抗衰老的作用，同时揭示了其抗衰老的内在本质是清除氧红细胞膜上面的活性氧自由基。但是，尚未有文献报道灵芝多肽的改善睡眠功能。

发明内容

针对上述问题，本发明公开了一种灵芝孢子粉酶解物的制备与提取工艺，以蛋白质含量高(约为15～18％，为灵芝子实体蛋白含量的7～9倍)的灵芝孢子粉为原料，经酶解法及简单的分离纯化工艺制备得到富含粗多糖、三萜、小肽及氨基酸等水溶性功效物质，以及灵芝酸、皂甙和麦角甾醇等醇溶性活性成分的灵芝孢子粉酶解物，工艺简单、易于操作，生产成本低。以该工艺制备的灵芝孢子粉酶解物为原料制备的复方制剂具有显著改善睡眠的作用。

具体技术方案如下：

一种灵芝孢子粉酶解物的制备与提取工艺，包括如下步骤：

(1)以灵芝孢子粉为原料，经蛋白酶酶解法得到灵芝孢子粉酶解物粗品；

所述蛋白酶酶解法具体为：

将灵芝孢子粉、胰蛋白酶与乙醇水溶液混合，在50～60℃，pH＝5.5～6.5下进行酶解反应；

所述乙醇水溶液的体积浓度为40～60％；

(2)将所述灵芝孢子粉酶解物粗品进行过滤处理，再经浓缩、干燥得到所述灵芝孢子粉酶解物。

本发明公开的制备与提取工艺，以蛋白质含量较高的灵芝孢子粉为原料，采用特定的胰蛋白酶，在一定浓度的乙醇/水混合体系下进行酶解反应，从而制备得到富含粗多糖、三萜、小肽及氨基酸等水溶性功效物质，以及灵芝酸、皂甙和麦角甾醇等醇溶性活性成分的灵芝孢子粉酶解物。

经试验发现，若将胰蛋白酶替换为其它蛋白酶类，如木瓜蛋白酶，最终制备的灵芝孢子酶解物中，分子量在180～1000Da的小肽含量显著下降。

步骤(1)中：

以灵芝孢子粉的质量计，所述胰蛋白酶的加入量为0.15～0.25wt％；优选为0.20wt％。

所述灵芝孢子粉与所述乙醇水溶液的质量之比为1：3～1：4。

步骤(1)中，所述酶解反应的时间为2～5h；

步骤(2)中，所述干燥为喷雾干燥。

本发明还公开了根据上述制备与提取工艺制备的灵芝孢子粉酶解物，对其主要成分分析及其成分中肽的分子量分布进行测定：

主要成分包括：粗多糖：1.5～4.5％，三萜：2.5～5.0％，小肽：7～18％，氨基酸2～7％；

主要成分中，除包括粗多糖、三萜、小肽与氨基酸外，余量还包括水分、脂肪和蛋白质等。

肽分子量分布：分子量为0～180Da：6～8％，分子量为180～1000Da：71～73％；余量为分子量大于1000Da的肽。

本发明还公开了上述灵芝孢子粉酶解物在制备具有改善睡眠作用的复方制剂中的应用。

具体为：一种具有改善睡眠作用的复方制剂，原料包括所述的灵芝孢子粉酶解物，按质量份数计，原料组成包括：

灵芝孢子粉酶解物 50～60份；

酸枣仁 10～20份；

蜂蜜粉 8～15份。

经巴比妥钠睡眠潜伏期实验发现，本发明公开的具有特殊组成的复方制剂与巴比妥钠具有协同作用，可以显著缩短巴比妥钠睡眠潜伏期；且潜伏期随剂量的增加而进一步缩短。

经戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验发现，本发明公开的具有特殊组成的复方制剂可以显著提升睡眠发生率，并随着剂量的增加，睡眠发生率逐渐增加。

经延长戊巴比妥钠睡眠时间实验发现，本发明公开的具有特殊组成的复方制剂可以显著延长戊巴比妥钠诱导的睡眠时间，且随着剂量的增加，睡眠时间呈增加趋势。

由此可以证明，本发明公开的具有特殊组成的复方制剂既能促进睡眠的发生，也有助于睡眠的维持，具有明显的促进睡眠作用。

经试验发现，若将上述复方制剂中的酸枣仁或蜂蜜粉去掉，其改善睡眠的效果将大幅下降。

优选的，所述具有改善睡眠作用的复方制剂，原料还包括18～22份木糖醇。木糖醇作为辅料加入，用于改善复方制剂的口感。

进一步经试验发现，在上述灵芝孢子粉酶解物的制备与提取工艺中，不同浓度的乙醇水溶液会导致提取得到的灵芝孢子粉酶解物中的活性成分有所变化，进而影响到其制备而成的复方制剂对于改善睡眠作用的效果。

优选的，所述乙醇水溶液的体积浓度为50～60％，此时制备的灵芝孢子粉酶解物：

主要成分包括：粗多糖：1.5～3.5％，总三萜：3.5～5.0％，小肽：7～17％，氨基酸：2～6％。

经试验发现，以该工艺参数制备的灵芝孢子粉酶解物组成的复方制剂具有更短的入睡潜伏期、更高的入睡比例以及更长的睡眠时间，因此具有更优异的改善睡眠的效果。

进一步优选，所述乙醇水溶液的体积浓度为50％，此时制备的灵芝孢子粉酶解物：

主要成分包括：粗多糖：3～3.5％；三萜：3.5～4.0；小肽：16～16.5％；氨基酸5～6％；

肽分子量分布为：分子量为0～180Da 6～8％，分子量为180～1000Da71～73％。

经试验发现，以该工艺参数制备的灵芝孢子粉酶解物组成的复方制剂具有最佳的改善睡眠的效果。

优选的，所述复方制剂，按质量份数计，原料组成包括：

本发明还公开了所述具有改善睡眠作用的复方制剂的制备方法，包括如下步骤：

1)按上述重量份数分别称取各原料后备用；

2)将酸枣仁研磨成粉，与剩余原料充分混合后得到混合原料；

3)向所述混合原料中加入食用乙醇和水，制粒、干燥后制成所述具有改善睡眠作用的复方制剂。

步骤3)中：

所述食用乙醇和水的体积比为70：30～95：5；

所述食用乙醇与所述混合原料的质量比为0.8：1～2：1。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明公开了一种灵芝孢子粉酶解物的制备与提取工艺，以蛋白质含量高的灵芝孢子粉为原料，采用特定的胰蛋白酶，在一定浓度的乙醇/水混合体系下进行酶解反应，再经简单的过滤、浓缩与干燥处理，制备工艺简单、易于操作，生产成本低。

本发明制备得到的灵芝孢子粉酶解物不仅富含粗多糖、总三萜、小肽及氨基酸等水溶性功效物质，还含有灵芝酸、皂甙和麦角甾醇等醇溶性活性成分，以其与酸枣仁、蜂蜜粉作为活性组分组成复方制剂，具有优异的改善睡眠的效果，不仅可以减少入睡潜伏期，还可以提高入睡比例、延长睡眠时间。

附图说明

图1为实施例1制备的灵芝孢子粉酶解物中肽的分子量与其响应时间关系的标准谱图，图中，1-2494Da；3-1523Da；4-1001Da；5-680Da；6-317Da；7-149Da；

图2为实施例1制备的灵芝孢子粉酶解物中肽的分子量分布谱图；

图3为对比例1制备的灵芝孢子粉酶解物中肽的分子量分布谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不局限于以下实施例。

实施例1

步骤一：灵芝孢子粉酶解物的制备

灵芝孢子粉2000g，胰蛋白酶4g，50％乙醇-水溶液(v/v)6000mL，置于10L不锈钢桶中，并放在55℃恒温水浴中，调节pH值为6.0，并开动搅拌器搅拌反应液，控制搅拌器转速为300rpm，反应4h，升温至90℃灭酶20min，取出反应液，过滤，得滤液。将滤液浓缩、喷雾干燥得到灵芝孢子粉酶解物。

通过凝胶渗透色谱法对本实施例制备的灵芝孢子粉酶解物中肽的分子量分布进行测试分析，结果如图1、图2和下表1(肽的分子量分布结果)所示，由于氨基酸的平均分子量为125Da，灵芝孢子粉酶解物中分子量在180～1000Da物质主要为小肽，占72.3％，分子量在180Da以下的物质占6.9％。

表1

依据《保健食品功效成分检测方法》(白鸿主编)、国标GB/T 5009.5-2015对灵芝孢子粉酶解物的主要成分进行含量测定，结果如下表2所示，灵芝孢子粉酶解物中粗多糖、三萜、小肽及氨基酸含量均高于灵芝孢子粉。

表2

步骤二：灵芝孢子粉酶解物复方制剂的制备

一种改善睡眠作用的灵芝孢子粉酶解物复方制剂，特别地能改善戊巴比妥钠协同的睡眠障碍，其包括如下原料：灵芝孢子粉酶解物100g，酸枣仁20g，蜂蜜粉20g，木糖醇40g。

1)按重量比分别称取灵芝孢子粉酶解物、酸枣仁、蜂蜜粉和木糖醇，备用。

2)将酸枣仁研磨成粉，充分混合步骤1)中的所有原料，得到混合原料。

3)向混合原料中加入180mL 85％(v/v)的食用乙醇，制粒，干燥，制成灵芝孢子粉酶解物复方制剂。

步骤三：性能测试，本实施例制备的灵芝孢子粉酶解物复方制剂改善睡眠功能的实验

1.1实验与方法：

直接睡眠实验：观察受试组动物给予3个剂量(120mg/kg·bw,180mg/kg·bw,240mg/kg·bw)的受试样品，对照组给予同体积溶剂(5％吐温80，10mL/kg·bw)后，是否出现睡眠现象。睡眠以翻正反射消失为指标。当小鼠置于背卧位时，能立即翻正身位。如超过30～60秒不能翻正者，即认为翻正反射消失，进入睡眠，翻正反射恢复即为动物觉醒，翻正反射消失至恢复这段时间为动物睡眠时间，记录空白对照与受试样品组入睡动物数及睡眠时间。

巴比妥钠睡眠潜伏期实验：在巴比妥钠催眠的基础上，观察受试物是否缩短潜伏期，若睡眠潜伏期缩短，则说明受试物与巴比妥钠有协同作用。受试组动物给予低中高3剂量，分别为120mg/kg·bw,180mg/kg·bw,240mg/kg·bw的受试样品，对照组给予同体积溶剂(5％吐温80，10mL/kg·bw)，观察是否出现睡眠反应。每天灌胃1次，连续灌胃30天，动物末次给予溶剂及不同浓度受试样品10-20分钟，给各组动物腹腔注射280mg/kg·bw巴比妥钠，注射量为0.1mL/10g·bw，以翻正反射消失为指标，观察受试样品对巴比妥钠睡眠潜伏期的影响。

戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验：观察受试组动物给予低中高3剂量，分别为120mg/kg·bw,180mg/kg·bw,240mg/kg·bw的受试样品，对照组给予同体积溶剂(5％吐温80，10mL/kg·bw)后，是否出现睡眠现象。每天灌胃1次，连续灌胃30天，于末次灌胃60min后，各组动物给予32mg/kg·bw戊巴比妥钠，注射量为0.1mL/10g·bw，以小鼠的翻正反射消失达60s以上作为入睡判断标准，记录30min内各组入睡动物数量并计算睡眠发生率。睡眠发生率(％)＝(入睡动物数/每组动物数)×100。

延长戊巴比妥钠睡眠时间实验：在巴比妥钠催眠的基础上，观察受试物能延长睡眠时间，若睡眠时间延长，则说明受试物与巴比妥钠有协同作用。观察受试组动物给予低中高3剂量，分别为120mg/kg·bw,180mg/kg·bw,240mg/kg·bw的受试样品，对照组给予同体积溶剂(5％吐温80，10mL/kg·bw)，是否出现睡眠现象。每天灌胃1次，连续灌胃30天，出现峰作用前10-15分钟，给各组动物腹腔注射48mg/kg·bw戊巴比妥钠，注射量为0.2mL/20g·bw，以翻正反射消失为指标，观察受试样品能否延长戊巴比妥钠睡眠时间。

1.2实验结果与分析

1.2.1体重测定试验

灵芝孢子粉酶解物复方组初始体重和溶剂对照组比较差异不明显，连续灌胃30d后，灵芝孢子粉酶解物复方组实验小鼠体重体重和溶剂对照组均没有明显差别。

1.2.2直接睡眠试验

各组小鼠在给予受试物60min内，通过实验观察，灵芝孢子粉酶解物复方组和溶剂对照组均未有直接睡眠现象发生，即灵芝孢子粉酶解物复方组及对照溶剂对小鼠均无直接催眠作用。

1.2.3灵芝孢子粉酶解物复方制剂对巴比妥钠睡眠潜伏期的影响

表3为实施例1制备的复方制剂在不同剂量下对巴比妥钠睡眠潜伏期的影响。低、中、高剂量组小鼠睡眠潜伏期随剂量缩短，分别为29.0min、25.6min、24.4min，中、高剂量组与溶剂阳性对照组相比均差异显著，分别下降了17.7％和21.5％，说明240mg/kg·bw剂量与一定剂量巴比妥钠联合作用能缩短小鼠的入睡时间。

表3

1.2.4灵芝孢子粉酶解物复方制剂对戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验的影响

表4为实施例1制备的复方制剂在不同剂量下对戊巴比妥钠阈下剂量催眠发生率的影响。由表可见，实施例1复方制剂低、中、高剂量组的睡眠发生率分别为20％、50％和70％，均高于溶剂对照组的睡眠发生率(10％)，而且随着受试剂量的增加，睡眠发生率逐渐增加。

表4

1.2.5灵芝孢子粉酶解物复方制剂对戊巴比妥钠睡眠的影响

表5为实施例1制备的复方制剂在不同剂量下对戊巴比妥钠诱导睡眠时间的影响。由表可见，在戊巴比妥钠诱导睡眠时间实验中，灵芝孢子粉酶解物复方制剂的低、中、高剂量的巴比妥钠诱导睡眠时间分别为28.6min、29.8min、30.7min，与溶剂对照组比较，均能显著延长睡眠时长(P<0.01)，而且随着灵芝孢子粉酶解物复方制剂剂量的增加，睡眠时间呈增加趋势，其中，高剂量组对戊巴比妥钠诱导睡眠时间(30.7min)相比对照组提高21.3％

表5

通过以上表3～5的数据，从巴比妥钠睡眠潜伏期实验、戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验及戊巴比妥钠诱导睡眠时间实验结果看，实施例1制备的灵芝孢子粉酶解物复方制剂既能促进睡眠的发生，也有助于睡眠的维持，确定其具有明显的促进睡眠作用。

对比例1

灵芝孢子粉2000g，木瓜蛋白酶4g，50％乙醇6000mL，置于10L不锈钢桶中，并放在60℃恒温水浴中，调节pH值为6.5，并开动搅拌器搅拌反应液，控制搅拌器转速为300rpm，反应4h，升温至90℃灭酶20min，取出反应液，过滤，得滤液。将滤液浓缩、喷雾干燥得到灵芝孢子粉酶解物。

通过凝胶渗透色谱法对本实施例制备的灵芝孢子粉酶解物中肽的分子量分布进行测试分析，结果如图3和下表6(肽的分子量分布结果)所示，由木瓜蛋白酶制备得到的灵芝孢子酶解物中分子量在180～1000Da的小肽仅占15.6％，而分子量大于4000Da的大分子肽或蛋白质占50.7％。

表6

步骤二：灵芝孢子粉酶解物复方制剂的制备

一种改善睡眠作用的灵芝孢子粉酶解物复方制剂，特别地能改善戊巴比妥钠诱导的睡眠障碍，其包括如下原料：灵芝孢子粉酶解物100g，酸枣仁20g，蜂蜜粉20g，木糖醇40g。

1)按重量比分别称取灵芝孢子粉酶解物、酸枣仁、蜂蜜粉和木糖醇，备用。

2)将酸枣仁研磨成粉，充分混合步骤1)中的所有原料，得到混合原料。

3)向混合原料中加入300mL 85％(v/v)的食用乙醇，制粒，干燥，制成具有改善睡眠作用的灵芝孢子粉酶解物复方制剂。

步骤三：性能测试，灵芝孢子粉酶解物复方制剂改善睡眠功能的实验2.1实验与方法

同1.1实验与方法，本对比例制备的灵芝孢子粉酶解物复方制剂低中高剂量分别为120mg/kg·bw,180mg/kg·bw,240mg/kg·bw。

2.2实验结果与分析

2.2.1灵芝孢子粉酶解物复方制剂对巴比妥钠睡眠潜伏期的影响

表7为对比例1制备的复方制剂在不同剂量下对巴比妥钠睡眠潜伏期的影响。低、中、高剂量组小鼠睡眠潜伏期随剂量增加变化不明显，各剂量组与溶剂阳性对照组相比差异不显著，说明实施例2制备的复方制剂不能有效缩短小鼠的入睡时间。

表7

2.2.2灵芝孢子粉酶解物复方制剂对戊巴比妥剂量催眠实验的影响

表8为对比例1制备的复方制剂在不同剂量下对戊巴比妥剂量催眠实验的影响。由表可见，实施例2复方制剂低、中、高剂量组的睡眠发生率分别为10％、20％和10％，接近或稍高于溶剂对照组的睡眠发生率(10％)，而且随着受试剂量的增加，睡眠发生率几乎无变化。

表8

2.2.3灵芝孢子粉酶解物复方制剂对戊巴比妥钠诱导睡眠的影响

表9为对比例1制备的复方制剂在不同剂量下对戊巴比妥钠诱导睡眠时间的影响。由表可见，在戊巴比妥钠诱导睡眠时间实验中，对比例1制备的灵芝孢子粉酶解物复方制剂的低、中、高剂量的戊巴比妥钠诱导睡眠时间分别为22.6min、20.4min、25.1min，与溶剂对照组比较戊巴比妥钠诱导睡眠时间作用不明显，而且随着灵芝孢子粉酶解物复方制剂剂量的增加无明显的变化趋势。

表9

通过以上表7～9的数据可知，从巴比妥钠睡眠潜伏期实验、戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验及戊巴比妥钠诱导睡眠时间实验结果看，对比例1制备的的灵芝孢子粉酶解物复方制剂既对促进睡眠的发生无明显作用，对于睡眠的维持也无显著的效果，确定其不具有明显的促进睡眠作用。

对比例2

本对比例采用实施例1制备的灵芝孢子粉酶解物100g，与蜂蜜粉20g、木糖醇40g组成灵芝孢子粉酶解物复方制剂。复方制剂的制备工艺同实施例1。

本对比例制备的复方制剂对巴比妥钠睡眠潜伏期实验、戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验及戊巴比妥钠诱导睡眠时间实验结果分别如下表10、表11和表12所示，低、中、高剂量分别为120mg/kg·bw,180mg/kg·bw,240mg/kg·bw。由表中实验数据可见，对比例2制备的复方制剂具有一定提高睡眠作用，如高剂量组的巴比妥钠睡眠潜伏期为28.3min，比溶剂对照组提高8.4％；高剂量组对戊巴比妥钠阈下剂量睡眠发生率为30％，比对照组提高15％；高剂量组对戊巴比妥钠诱导睡眠时间为27.8min，比对照组提高11.2％。但是，与实施例1的复方制剂相比，提高睡眠作用效果显著降低。

表10

表11

表12

对比例3

采用实施例1制备的灵芝孢子粉酶解物100g，与酸枣仁20g、木糖醇40g组成灵芝孢子粉酶解物复方制剂。复方制剂的制备工艺同实施例1。

本对比例制备的复方制剂对巴比妥钠诱导睡眠潜伏期实验、戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验及戊巴比妥钠诱导睡眠时间实验结果分别如下表13、表14和表15所示，低、中、高剂量分别为120mg/kg·bw,180mg/kg·bw,240mg/kg·bw。由表中实验数据可见，对比例3制备的复方制剂同样具有一定提高睡眠作用，如高剂量组的巴比妥钠睡眠潜伏期为26.6min，比溶剂对照组提高15.8％；高剂量组对戊巴比妥钠阈下剂量睡眠发生率为40％，比对照组提高30％；高剂量组对戊巴比妥钠诱导睡眠时间为28.8min，比对照组提高11.6％。但是，与实施例1的复方制剂相比，提高睡眠作用效果明显降低。

表13

表14

表15

实施例2

灵芝孢子粉1500g，胰蛋白酶3g，不同体积浓度(0％、40％、50％、60％、100％)乙醇-水溶液6000mL，置于10L不锈钢桶中，并放在50℃恒温水浴中，调节pH值为5.5，并开动搅拌器搅拌反应液，控制搅拌器转速为300rpm，反应4h，升温至90℃灭酶20min，取出反应液，过滤，得到滤液即为灵芝孢子粉酶解物。滤液浓缩、喷雾干燥得到灵芝孢子粉酶解物成品。

对本实施例制备的不同灵芝孢子粉酶解物进行主要成分分析，结果如下表16所示，由表可见，当采用100％的水为溶剂对灵芝孢子粉进行酶解处理和活性物质提取时，得到的最终产品中粗多糖含量较高为5.03％，而三萜含量最低，仅为2.07％；当采用100％的乙醇为溶剂对灵芝孢子粉进行酶解处理和活性物质提取时，得到的最终产品中粗多糖几乎没有得到提取，小肽含量也仅为0.65％，这与粗多糖和肽类物质的醇溶解性低有关，而三萜含量较高为6.30％，所以对100％的水为溶剂和100％乙醇为溶剂这两种方式不作进一步复方制剂的制备和相应的动物实验。

以下实施例3～4分别对40％乙醇为溶剂和60％的乙醇为溶剂进行了灵芝孢子粉酶解物的制备、复方制剂产品的研制和相应的动物试验。

表16

实施例3

步骤一：灵芝孢子粉酶解物的制备

灵芝孢子粉1000g，胰蛋白酶2g，40％乙醇3500mL，置于10L不锈钢桶中，并放在55℃恒温水浴中，调节pH值为6.0，并开动搅拌器搅拌反应液，控制搅拌器转速为300rpm，反应4h，升温至90℃灭酶20min，取出反应液，过滤，得到滤液。滤液浓缩、喷雾干燥得到灵芝孢子粉酶解物成品。

步骤二：灵芝孢子粉酶解物复方制剂的制备

一种改善睡眠作用的灵芝孢子粉酶解物复方制剂，特别地能改善戊巴比妥钠诱导的睡眠障碍，其包括如下原料：灵芝孢子粉酶解物550g，酸枣仁150g，蜂蜜粉100g，木糖醇200g。

所述具有改善睡眠作用的灵芝孢子粉酶解物复方制剂，还包括如下制备方法：

1)按重量比分别称取灵芝孢子粉酶解物、酸枣仁、蜂蜜粉和木糖醇，备用。

2)将酸枣仁研磨成粉，充分混合步骤1)中的所有原料，得到混合原料。

3)向混合原料中加入1500mL 85％(v/v)食用乙醇/水溶液，制粒，干燥，制成具有上述具有改善睡眠作用的灵芝孢子粉酶解物复方制剂。步骤三：性能测试，灵芝孢子粉酶解物复方制剂改善睡眠功能的实验

3.1实验与方法

同1.1实验与方法

3.2实验结果与分析

本实施例制备的复方制剂对巴比妥钠睡眠潜伏期实验、戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验及戊巴比妥钠诱导睡眠时间实验结果分别如表17、表18和表19所示，由表中实验数据可见，实施例3制备的复方制剂具有一定提高睡眠作用，如高剂量组的巴比妥钠睡眠潜伏期为27.2min，比溶剂对照组提高12.0％，高剂量组对戊巴比妥钠阈下剂量睡眠发生率为40％，比对照组提高3倍，高剂量组对戊巴比妥钠诱导睡眠时间为28.3min，比对照组提高8.8％。但是，与实施例1的复方制剂相比，提高睡眠作用效果明显降低。

表17

表18

表19

实施例4

步骤一：灵芝孢子粉酶解物的制备

灵芝孢子粉1000g，胰蛋白酶2g，60％乙醇4000mL，置于10L不锈钢桶中，并放在50℃恒温水浴中，调节pH值为6.5，并开动搅拌器搅拌反应液，控制搅拌器转速为300rpm，反应4h，升温至90℃灭酶20min，取出反应液，过滤，得到滤液即为灵芝孢子粉酶解物。滤液浓缩、喷雾干燥得到成品。

步骤二：灵芝孢子粉酶解物复方制剂的制备

一种改善睡眠作用的灵芝孢子粉酶解物复方制剂，特别地能改善戊巴比妥钠诱导的睡眠障碍，其包括如下原料：灵芝孢子粉酶解物550g，酸枣仁150g，蜂蜜粉100g，木糖醇200g。

所述具有改善睡眠作用的灵芝孢子粉酶解物复方制剂，还包括如下制备方法：

1)按重量比分别称取灵芝孢子粉酶解物、酸枣仁、蜂蜜粉和木糖醇，备用。

2)将酸枣仁研磨成粉，充分混合步骤1)中的所有原料，得到混合原料。

3)向混合原料中加入1000mL95％食用乙醇/水溶液，制粒，干燥，制成具有上述具有改善睡眠作用的灵芝孢子粉酶解物复方制剂。

步骤三：性能测试，灵芝孢子粉酶解物复方制剂改善睡眠功能的实验

4.1实验与方法

同1.1实验与方法

4.2实验结果与分析

本实施例制备的复方制剂对巴比妥钠睡眠潜伏期实验、戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验及戊巴比妥钠诱导睡眠时间实验结果分别如下表20、表21和表22所示。

表20

表21

表22

由表中实验数据可见，实施例4制备的复方制剂具有一定提高睡眠作用，如高剂量组的巴比妥钠睡眠潜伏期为26.0min，比溶剂对照组组提高15.6％；高剂量组对戊巴比妥钠阈下剂量睡眠发生率为50％，比对照组提高4倍；高剂量组对戊巴比妥钠诱导睡眠时间为29.8min，比对照组提高19.2％。但是，与实施例1的复方制剂相比，提高睡眠作用效果有所降低。