一种药碳点修饰益生菌制剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及医药，特别是一种药碳点修饰益生菌制剂及其制备方法与应用。

背景技术

口服给药是最常用的给药途径,尤其是对慢性疾病,与静脉给药相比,口服给药可以使患者自行给药,降低了卫生保健成本并提高了患者依从性。而在过去的几十年里，天然生物活性有机化合物如白藜芦醇、姜黄素、槲皮素等因在慢性病如胰岛素抵抗，2型糖尿病、肠道炎性疾病（如溃疡性结肠炎）以及心血管疾病的强大预防治疗作用而引起了广泛关注。然而此类脂溶性药物都存在理化性质不稳定、水溶性差、生物半衰期短和生物利用度差的缺点，导致其口服后表现出极低的生物利用度。因此，提高此类药物的的水溶性，促进其吸收并提高其生物利用度，是目前研究的热点和难题。目前的研究主要通过包合技术、微囊技术、脂质体技术来达到上述目的，但制备工艺相对复杂。所以使用一种简单、更绿色、成本效益和生态友好的方法达到上述目的是一个亟待解决的目标。碳点是一种粒径小于10nm的新型碳纳米颗粒，由于合成所涉及的水热过程简单、成本效益高且环境友好，已被广泛研究。而且具有良好的溶解性、生物相容性、稳定性和低细胞毒性。据报道，在体内给药对血液生化和血液学分析没有显著影响，也没有引起主要器官的组织病理学异常。它既可以改善药物水溶性，增加溶解性，又提高其稳定性。

另一方面，越来越多的研究表明，能够保持肠道微生物区系正常动态平衡在人类健康中发挥着核心作用，并可能具有预防和治疗上述疾病的能力。将益生菌输送到胃肠道是一种很有前景的预防和治疗疾病的方法。益生菌进入体内能够大量繁殖迅速补充肠道正常菌群，有效地调节肠道内菌群，抑制有害菌定殖，纠正菌群失衡。但考虑到口服益生菌首先受到胃腔消化液和早期肠腔内环境的威胁，然后才在肠道定植，治疗效果有限。常常对其进行表面修饰，包括化学结合和物理包裹，从而提高生存能力和稳定性。

因此，为了改善上述脂溶性药物的生物利用度并促进益生菌的肠道定植，将碳点联合益生菌用于治疗疾病，构建个性化的既能递送药物又能保护益生菌的递药系统尤为重要，但至今未见有公开报导。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种碳点修饰益生菌制剂及其制备方法与应用，可有效解决用药稳定性差，生物相容性差的问题。

本发明解决的技术方案是，一种药碳点修饰益生菌制剂，包括模型药和益生菌，模型药和按活菌数计的益生菌1×10

所述的模型药为白藜芦醇、姜黄素、槲皮素、白桦脂醇、紫檀芪或维生素E中的一种；

所述的益生菌为大肠杆菌属Nissle 1917、双歧杆菌、乳杆菌或嗜粘蛋白阿克曼菌中的一种；

其制备方法是：

（1）、制备药碳点：将模型药0.5-2.5g加入超纯水8-12mL中，110-130℃水热反应6-24h，用孔径100nm的滤纸过滤，8000-12000rpm离心5-10min，用500-3000Da的透析袋过夜透析8-10h，冷冻干燥，得到药碳点；

（2）、制备药碳点修饰益生菌制剂：将益生菌1g加入到质量浓度40mg/mL的药碳点质量浓度0.9%生理盐水溶液1mL中，室温搅拌6-12小时，5000rpm离心10min，再用质量浓度0.9%生理盐水（NaCl）洗涤3次，每次用量1mL，得药碳点修饰益生菌制剂。

该药碳点修饰益生菌制剂的应用为：

在制备治疗胰岛素抵抗药物中的应用，在制备治疗2型糖尿病药物中的应用，在制备治疗肠道炎性疾病药物中的应用，在制备治疗心血管疾病药物中的应用，在制备保护益生菌避免胃肠道破坏药物中的应用，在制备促进药物递送至全身药物中的应用。

本发明制备方法简单，制备所得产品理化性质稳定，将药物递送至全身，大大提高治疗效果，保护益生菌在肠道更多的定殖，改善肠道菌群紊乱，实现联合应用，是治疗上述疾病的一大创新，有巨大的社会和经济效益。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。

本发明在具体实施中，可由以下实施例给出。

实施例1

本发明一种药碳点修饰益生菌制剂的制备方法是：

（1）、制备药碳点：将模型药槲皮素1.5g加入超纯水10mL中，120℃水热反应15h，用孔径100nm的滤纸过滤，10000rpm离心8min，用2000Da的透析袋过夜透析9h，冷冻干燥，得到槲皮素碳点；

（2）、制备药碳点修饰益生菌制剂：将活菌数2×10

实施例2

本发明一种药碳点修饰益生菌制剂的制备方法是：

（1）、制备药碳点：将模型药白藜芦醇0.6g加入超纯水8mL中，115℃水热反应23h，用孔径100nm的滤纸过滤，8500rpm离心9min，用600Da的透析袋过夜透析10h，冷冻干燥，得到白藜芦醇碳点；

（2）、制备药碳点修饰益生菌制剂：将活菌数3×10

实施例3

本发明一种药碳点修饰益生菌制剂的制备方法是：

（1）、制备药碳点：将模型药姜黄素1.0g加入超纯水9mL中，125℃水热反应7h，用孔径100nm的滤纸过滤，9000rpm离心8min，用1000Da的透析袋过夜透析9h，冷冻干燥，得到姜黄素碳点；

（2）、制备药碳点修饰益生菌制剂：将活菌数1×10

实施例4

本发明一种药碳点修饰益生菌制剂的制备方法是：

（1）、制备药碳点：将模型药白桦脂醇1.8g加入超纯水11mL中，118℃水热反应18h，用孔径100nm的滤纸过滤，11000rpm离心6min，用2500Da的透析袋过夜透析8.5h，冷冻干燥，得到白桦脂醇碳点；

（2）、制备药碳点修饰益生菌制剂：将活菌数1×10

实施例5

本发明一种药碳点修饰益生菌制剂的制备方法是：

（1）、制备药碳点：将模型药紫檀芪2.2g加入超纯水12mL中，128℃水热反应8h，用孔径100nm的滤纸过滤，12000rpm离心5min，用3000Da的透析袋过夜透析8h，冷冻干燥，得到紫檀芪碳点；

（2）、制备药碳点修饰益生菌制剂：将活菌数1×10

本发明实施例1-5所述方法制备的药碳点修饰益生菌制剂，在制备治疗胰岛素抵抗药物中的应用，在制备治疗2型糖尿病药物中的应用，在制备治疗肠道炎性疾病药物中的应用，在制备治疗心血管疾病药物中的应用，在制备保护益生菌避免胃肠道破坏药物中的应用，在制备促进药物递送至全身药物中的应用。

本发明制备方法简单，克服了药物在体内溶解性差，生物利用度不高的缺陷，另外碳点在外层对益生菌的修饰增加了其存活率，实验证明该制剂在体外具有良好的抗炎，抗氧化，抗脂质堆积作用；并且体外实验证实益生菌存活率更高，经多次反复试验，均取得了一致的结果。

首先，选择白藜芦醇作为模型药，白藜芦醇具有抗氧化和抗炎作用。在体内和体外它通过抗氧化应激作用来抑制炎症和活性氧的产生，减轻改善心脏，肝脏，骨骼肌，脂肪组织，肠道等的炎症反应，从而达到治疗胰岛素抵抗，2型糖尿病、肠道炎性疾病以及心血管疾病的作用。但白藜芦醇存在水溶性差，酸性、碱性环境下不稳定，生物半衰期短和全身生物利用度差等缺陷。大肠杆菌属Nissle 1917作为很常用的定殖肠道的益生菌，在肠道部位具有明显的抗炎优势。因此，选择大肠杆菌属Nissle 1917作为修饰益生菌。

为充分发挥白藜芦醇的优势，又要保护大肠杆菌属Nissle 1917经过胃肠道保持更高活性，以更好联合用于治疗上述疾病，有关资料如下（以实施例2为例）：

实验1：反应温度对白藜芦醇碳点修饰益生菌制剂体外清除自由基活性的影响实验：

本发明在研究过程中发现，反应温度对白藜芦醇碳点修饰益生菌制剂体外清除自由基的活性有较大影响。因此，本研究对白藜芦醇在不同温度下合成碳点的体外清除自由基活性进行了比较，结果显示白藜芦醇（Res）120℃合成碳点的DPPH自由基清除率约为200℃合成碳点的DPPH自由基清除率的1.5倍，所以反应温度选择120℃。

实验2：搅拌时间，碳点浓度对白藜芦醇碳点修饰益生菌制剂结合率的影响实验：

本发明在研究过程中发现，搅拌时间，碳点浓度对白藜芦醇碳点修饰益生菌制剂结合率有较大影响。因此，本研究对大肠杆菌属Nissle 1917与不同浓度碳点搅拌不同时间的结合率进行了比较，结果显示随着碳点浓度不断升高，搅拌时间不断延长，其与大肠杆菌属Nissle 1917的结合率不断提高，考虑到动物给药，最终选择40mg/mL的碳点与大肠杆菌属Nissle 1917搅拌12h。

实验3：处方工艺选择实验：

称量白藜芦醇（Res）0.5-2.5g，放在25-50mL反应釜中，加入25mL超纯水，在120℃的烘箱中反应6-24h。然后用孔径为100nm的滤纸过滤，8000-12000rpm离心5-10min，用500-3000Da的透析袋过夜透析，冷冻干燥即得白藜芦醇碳点(Res Cds)。将2×10

在确定本发明最终技术方案时，均经上述实验案例筛选给出，制备得到的白藜芦醇碳点能更好发挥其抗炎，抗氧化，抗脂质堆积作用，成功修饰益生菌提高了菌经过胃肠道存活率，实现在制备治疗胰岛素抵抗，2型糖尿病、肠道炎性疾病以及心血管疾病中的联合应用，有关试验资料如下：

实验4：白藜芦醇碳点（Res Cds）形态表征实验：

取10mg Res Cds置于EP中，观察其在室温下的外观性状。

结果：观察Res Cds在室温下，呈深棕色粉末状，溶于水后表现为流动性较好、透明的深棕色液体。

实验5：Res Cds在模拟胃肠液的稳定性实验：

称取3份6mg的Res Cds，分别用pH1.2盐酸溶液和pH6.8磷酸盐缓冲液（模拟胃肠液）稀释100倍，由于机体胃排空需2h，经肠道转运需6h。于0h、0.5h、1h、2h、4h、6h观察状态，并取适量溶液进行紫外扫谱。

结果：Res Cds在模拟胃肠液中的紫外谱图及特征吸收峰没有发生明显变化，溶液肉眼观察无明显变化，说明制剂在胃肠道pH环境下的物理稳定性良好。特征吸收峰下的吸光度没有变化，均为0.6，带入标曲得浓度均为60μg/mL，因此，从化学稳定性来看，6h内溶液中碳点含量保持稳定。

实验6：Res Cds的体外抗氧化作用实验：

将处于对数生长期的MIN6细胞按照6×10

结果：绿色荧光代表细胞内ROS存在情况结果显示Normol组只存在微弱的荧光，而HG组荧光强度显著增强，说明高糖诱导细胞糖毒性导致ROS产生。而经过Res Cds、游离Res治疗后的细胞，缓解了这种氧化应激，表现为绿色荧光强度显著降低。这得益于Res是一种良好的抗氧化，清除氧自由基的多酚化合物。

实验7：Res Cds的体外抗炎作用实验：

将处于对数生长期的RAW264.7细胞按照10

结果：巨噬细胞的激活在体外被定义为两种不同的极化状态，M1和M2。M1巨噬细胞被称为促炎巨噬细胞，而M2巨噬细胞充当抗炎巨噬细胞。经典激活的M1巨噬细胞可被LPS等促炎介质诱导，并增强促炎细胞因子的产生，包括TNF-α。LPS刺激提高了TNF-α的水平，而经过Res Cds、游离Res治疗后的细胞，TNF-α的水平明显降低。这得益于Res具有良好的抗炎性。

实验8：Res Cds的体外抗脂质堆积作用实验：

将处于对数生长期的HepG2细胞按照6×10

结果：红色代表细胞内脂质堆积情况，结果显示Normol组只存在微弱的红色，而FFA组细胞红色显著增强，说明游离脂肪酸诱导细胞脂肪变性。而经过Res Cds、游离Res治疗后的细胞，缓解了这种脂质堆积，表现为红色显著降低。这得益于Res能有效减少肝脏脂质积累。

实验9：Res Cds提高菌的存活率实验：

大肠杆菌属Nissle 1917(EcN)在模拟胃肠道液体中的稳定性。取白藜芦醇碳点修饰的1×10

结果：涂布实验结果显示大量碳点修饰菌中的EcN在SGF中孵育0.5h后存活，与未包被菌有显著差异，随着时间延长到2h，未被修饰的EcN几乎不生长，表明纳米涂层对外部威胁具有保护作用。EcN在SIF中培养，与未包被菌的生长情况相似，这样碳点修饰菌可以保持菌避免胃攻击，而一旦进入肠道，它们的生物活性就会恢复。

在对实施例2实验的同时，还对其他实施例做了相同的实验，均取得了相同和相近似的实验结果，这里不再一一列举。

由上述可以看出，本发明首先使用水热法合成碳点，使脂溶性药物的稳定性及其水溶性得到极大提高，从而提高药物生物利用度；其次使用碳点修饰益生菌，益生菌沿胃肠道定殖，受到碳点在外层对菌的保护，更多的益生菌在胃肠道存活，正向改善肠道菌群紊乱，调节肠道菌群丰度。两者联合不仅有望矫正体内微生物群失衡紊乱，而且改善心脏，肝脏，骨骼肌，脂肪组织，肠道等的炎症反应，最终达到联合治疗胰岛素抵抗，2型糖尿病、肠道炎性疾病以及心血管疾病的作用，本发明与现有技术相比：

（1）本发明制备的白藜芦醇碳点修饰益生菌制剂提高了药物的溶解度及生物利用度，制备方法简单，粒径均一，稳定性高，生物相容性好；

（2）本发明提供的白藜芦醇碳点修饰益生菌制剂，组分间相互协调，互相支持，更好的在载药的同时包被益生菌；

（3）本发明提供的白藜芦醇碳点修饰益生菌制剂促进药物递送至全身；

（4）本发明将白藜芦醇碳点和益生菌联合起来，不仅保护益生菌免受胃肠道恶劣环境破坏，而且为胰岛素抵抗，2型糖尿病、肠道炎性疾病以及心血管疾病的治疗提供了新的技术支持，是治疗上述疾病药物上的一大创新，经济和社会效益巨大。