丁酸及其盐在制备治疗宫颈癌的药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及丁酸及其盐在制备治疗宫颈癌的药物中的应用。

背景技术

宫颈癌(cervical cancer，CC)是全球女性第四大常见癌症，每年新增57万例，死亡相关31.1万例，严重威胁女性患者的生命和健康。由于宫颈癌早期症状不明显，大多数患者在诊断时处于中晚期，5年生存率较低。目前宫颈癌的治疗主要以手术为主，辅以化疗和其他治疗，例如放疗，免疫和靶向治疗，这些都可能会给患者的身体带来永久性的损害。宫颈癌患者的治疗效果有限是由于人们对其发病机制的了解不完全。

研究宫颈癌细胞系的凋亡途径，开发抑制宫颈癌细胞系的增殖、侵袭和迁移的药物，对于治疗宫颈癌具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供丁酸及其盐在制备治疗宫颈癌的药物中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，丁酸可以通过激活线粒体依赖的凋亡途径来抑制宫颈癌细胞系的增殖、侵袭和迁移。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供丁酸或丁酸盐在制备治疗宫颈癌的药物中的应用。

进一步地，所述丁酸或丁酸盐通过激活线粒体依赖的凋亡途径抑制宫颈癌细胞系的增殖、侵袭和迁移。

进一步地，所述丁酸盐包括丁酸钠。

本发明还提供丁酸或丁酸盐在制备诱导线粒体凋亡的制剂中的应用。

进一步地，所述线粒体为内源性线粒体。

本发明还提供一种用于诱导线粒体凋亡或治疗宫颈癌的药物，以丁酸或丁酸盐为主要成分。

本发明公开了以下技术效果：

本发明通过CCK8实验、EdU荧光实验、Transwell实验、划痕实验、蛋白印迹分析、细胞流式分析、ROS免疫荧光、TUNEL实验、CytC荧光实验和ROS流式分析表明，丁酸及其盐通过激活线粒体依赖的凋亡途径抑制宫颈癌细胞系的增殖、侵袭和迁移。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为丁酸钠抑制人宫颈癌细胞的增殖，用细胞计数试剂盒测定5mM丁酸钠作用12、24、48和72小时后Hela(A)和Caski(B)细胞的增殖情况；EdU荧光染色检测Hela(C)和Caski(E)细胞系中的凋亡细胞；D为C中红色荧光强度的定量分析；F为E中红色荧光强度的定量分析；G和I为流式细胞术分析Hela细胞的细胞周期分布，CON：对照组；NaB：5mM丁酸钠治疗48小时组；H为S期Hela细胞的定量分析；所有上述数据均表示为平均值±标准差；*P＜0.05，***P＜0.001；

图2为丁酸钠减少宫颈癌细胞的侵袭和迁移，划痕实验用于测定Hela(A)和Caski(C)细胞经5mM丁酸钠处理12、24、48小时后的迁移情况；B为Hela组伤口愈合率的定量分析；D为Caski组伤口愈合率的定量分析；E为采用Transwell法检测丁酸钠对Hela细胞侵袭和迁移的影响；F为采用Transwell法检测丁酸钠对Caski细胞侵袭和迁移的影响；CON：对照组，NaB：5mM丁酸钠治疗48小时组；数据表示为平均值±标准差；**P＜0.01，***P＜0.001；

图3为丁酸钠促进宫颈癌细胞凋亡，采用TUNEL(A)和Annexin-V/PI(B为CON组，C为NaB组)染色对Hela细胞凋亡进行定性和定量分析；D为蛋白印迹分析检测凋亡相关蛋白的表达；E为CON和NaB组蛋白表达的定量分析；CON：对照组，NaB：5mM丁酸钠治疗48小时组；数据表示为平均值±标准差；NS表示无显著性差异，***P＜0.001；

图4为丁酸钠激活了宫颈癌线粒体依赖性凋亡途径；A为蛋白印迹分析定量检测Caspase 8、9和12；B为Caspase 8、9和12蛋白质表达的定量分析；D为蛋白印迹分析定量检测Apaf-1、BCL-2和BAX；E为Apaf-1、BCL-2和BAX蛋白质表达的定量分析；C为免疫荧光检测细胞色素C表达；F为免疫荧光检测活性氧的表达；G-J为流式细胞术定量检测0-48h的活性氧含量，其中G-J依次为0h、12h、24h和48h；CON：对照组，NaB：5mM丁酸钠治疗48小时组；数据表示为平均值±标准差；NS表示无显著性差异，**P＜0.01。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

一、材料与方法

1.1试剂和抗体

丁酸钠(纯度＞98％)购自于aladdin，将丁酸钠溶于培养基中配制成100mM原液，并用0.22μm过滤膜过滤，保存在-20℃。半胱天冬酶3(Caspase 3，AC0301)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH，AB-P-R001)的一抗分别购买于杭州Goodhere和上海Beyotime，Cleaved-Caspase 3(9661S)、Caspase 9(#9508)和BCL-2相关X(BCL-2associated X，BAX，2772)的一抗均购买于Cell SignalingTechnology，Caspase 8(ET1612-70)、Caspase 12(HA500144)、B细胞淋巴瘤2(B-celllymphoma 2，BCL-2，ER1706-47)、和细胞色素C(Cytochrome C，CytC，R1510-41)、凋亡蛋白酶激活因子1(apoptotic protease activating factor 1,Apaf-1，R1312-20)的一抗均购买于杭州HUABIO，所有一抗以1:1000比例稀释。二抗购买于武汉proteintech公司，以1：5000比例稀释。所有抗体均保存于4℃。

1.2细胞培养

本实验所用宫颈癌细胞Hela、Caski购买于美国American Type CultureCollection(ATCC)公司，Hela细胞使用含有10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的DMEM培养液培养，Caski细胞使用含有10％FBS的1640培养液培养，两种细胞均于37℃、5％CO

1.3CCK8实验

细胞计数盒(CK04，日本同仁化学研究所)检测宫颈癌细胞的增殖能力。将宫颈癌细胞Hela和Caski接种在96孔板中，每孔计数3000个细胞并培养24h使其贴壁生长，用含有5mM丁酸钠的正常培养液孵育12、24、48和72h，使用纯培养基配制10％CCK8工作液，每孔加入100μL工作液，两小时后吸取上清测量450nm处吸光度。绘制吸光度-时间的生长曲线。

1.4EdU荧光实验

EdU荧光染色试剂盒(C10310-1试剂盒，锐博生物)检测宫颈癌细胞的DNA复制活性。Hela细胞和Caski细胞分别接种到含有细胞爬片的12孔板中，培养24h，加入5mM丁酸钠的正常培养液培养48h，正常对照组不做处理。后续进行EdU标记、细胞固定化、Apollo染色、DNA染色，在荧光显微镜下观察各组的红色荧光强度。

1.5Transwell实验

使用磷酸盐缓冲盐(phosphate buffer saline，PBS)将基质胶(CORNING)1：20稀释，各取200ul均匀铺在细胞小室中，迁移组不做处理，放入培养箱内2h，析出多余的PBS。使用胰蛋白酶消化Hela细胞和Caski细胞，用无血清培养基重悬，将细胞悬液接种到细胞小室，下室中加入含有10％FBS的培养基，在细胞培养箱中培养，其中Hela细胞培养8h，Caski细胞培养17h，在室温下使用4％多聚甲醛固定30min，0.1％结晶紫染色15min，显微镜下拍摄视野。

1.6划痕实验

将Hela细胞和Caski细胞接种于6孔板中，待细胞长满后，在每个孔的固定位置使用1ml枪头垂直划2道划痕，空白对照组和药物处理组分别换为2％FBS培养基和5mM的2％FBS培养基，在0h、12h、24h、48h固定位置拍照。

1.7蛋白印迹分析

将Hela细胞接种在6孔板，5mM丁酸钠处理48h后收样，加入RAPI裂解液(Beyotime)和蛋白酶抑制剂提蛋白，使用二甲胺基丙酸蛋白质测定试剂盒(Beyotime)测定蛋白质浓度，用12％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离细胞蛋白质，并转移到聚偏二氟乙烯中(BIO-RAD)，立即用5％脱脂奶粉室温封闭1.5h，含吐温的Tris缓冲盐溶液(Trisbuffered saline with Tween，TBST)清洗三次，敷一抗4℃摇床过夜，第二天回收一抗，TBST清洗三次，室温孵育二抗2h。使用Amersham Image 680成像系统扫描。使用ImageJ软件(美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院)通过密度测定法对蛋白质条带进行定量。

1.8细胞流式分析细胞周期和凋亡

Hela细胞接种在六孔板中，对照组不做处理，处理组5mM丁酸钠作用48h，收集细胞，PBS清洗，75％乙醇固定过夜，使用碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色进行分析。细胞凋亡则是使用5μL异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白V(Annexin V)和5μL的PI对细胞进行双重染色，避光染色15min后上机检测。

1.9ROS免疫荧光

使用线粒体超氧化物荧光探针(YEASEN)检测细胞线粒体ROS水平。将细胞培养在含有爬片的12孔板中培养48h，弃培养基，PBS清洗，加入PBS配制的5μM ROS工作液，于37℃避光孵育10min，使用DAPI抗荧光淬灭封片液(Solarbio)进行封片，在荧光显微镜(LEICA)下观察。

1.10TUNEL实验

使用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(40307ES20，YEASEN)检测细胞凋亡。将细胞培养在含有爬片的12孔板中培养24h，实验组5mM丁酸钠处理48h，弃培养基，PBS清洗，4％多聚甲醛固定细胞30分钟，0.3％Triton X-100的PBS重悬细胞，室温孵育5分钟，根据说明，配制TUNEL检测液，在样品上加50μL TUNEL检测液，37℃避光孵育60分钟，用含DAPI抗荧光淬灭封片液(Solarbio)封片后荧光显微镜下观察。

1.11CytC荧光实验

将Hela细胞接种在12孔板的细胞爬片上，待长到一定密度，处理组5mM丁酸钠作用48h，弃培养液，PBS清洗，加入4％多聚甲醛溶液室温固定15min，重复PBS清洗过程，用0.1％Triton X-100处理5min后再次清洗，1％BSA室温固定30min，使用CYTC抗体稀释液(1：500)孵育，4℃避光过夜，第二天PBS清洗，敷荧光488二抗(Thermo Fisher)，室温避光2h，PBS清洗，之后在荧光显微镜下检测。

1.12ROS流式分析

使用线粒体超氧化物荧光探针(YEASEN)检测细胞线粒体ROS相对表达水平，将细胞培养在六孔板中，对照组不做处理，处理组5mM丁酸钠作用48h，加入PBS配制的5μM ROS工作液，于37℃避光孵育10min，收集细胞，上机检测。

1.13统计分析

数据显示为平均值±标准偏差。两组之间的差异采用t检验进行评估，P值小于0.05被认为具有统计学意义。

二、结果

2.1丁酸抑制宫颈癌的增殖

使用5mM丁酸钠处理Hela细胞和Caski细胞，观察在12h、24h、48h、72h的增殖情况，发现随着药物时间的延长，Hela和Caski细胞的生长受到抑制(图1A-B)。为了进一步验证丁酸钠抑制增殖的效果，使用EdU染色来检测Hela和Caski细胞DNA复制的活性。与正常对照组相比，药物处理组的红色荧光明显减少(图1C-D)，两组具有统计学差异(图1E-F)。此外，我们还发现药物处理组的细胞在S期有一定的降低，表明细胞在DNA合成期的数量比例减少，细胞的增殖受到抑制(图1G-I)。

2.2丁酸抑制宫颈癌的迁移侵袭

Hela细胞和Caski细胞的划痕实验结果表明丁酸钠处理后，细胞愈合能力明显低于正常对照组，且具有统计学差异(图2A-D)。为了进一步探究丁酸钠对宫颈癌迁移侵袭的影响，我们使用Transwell检测细胞的迁移与侵袭能力。相比于正常对照组，药物处理组的宫颈癌细胞迁移和侵袭率都明显降低(图2E-F)。

2.3丁酸诱导Hela细胞凋亡

TUNEL荧光染色的结果表明药物处理组的绿色荧光明显增多，说明丁酸钠促进Hela的凋亡(图3A)。我们通过AnnexinV-PI染色定量分析了Hela细胞的凋亡水平，Hela细胞正常对照组的早期凋亡和晚期凋亡率在12.1％、6.10％，药物处理组的早期凋亡和晚期凋亡率则升高到了22.6％、22.7％(图3B、C)。我们进一步检测了Hela细胞凋亡关键蛋白Caspase 3和Cleaved-Caspase 3蛋白的表达，发现药物处理组的Cleaved-Caspase3蛋白有较高的表达，且具有统计学差异(图3D、E)。

2.4丁酸通过线粒体途径诱导Hela细胞凋亡

Westernblot的结果表明相比于正常对照组，药物处理组的Caspase 9显著增多，而Caspase 8和Caspase 12无明显变化，提示丁酸钠可能通过线粒体途径诱导Hela细胞凋亡(图4A-B)。此外，线粒体凋亡复合体的另外两个重要成员，Apaf-1和CytC的表达在丁酸钠处理后均显著上升(图4C-E)。丁酸钠上调了促凋亡蛋白BAX的合成，对抗凋亡蛋白BCL-2则不起作用(图4D-E)。ROS试剂盒和流式检测均表明丁酸钠处理后Hela细胞中的ROS显著增多(图4F、G-J)。

丁酸作为肠道微生态中的重要成分，已被证实能抑制多种恶性肿瘤。本发明发现丁酸通过促进细胞凋亡显著抑制Hela细胞的增殖，减少细胞迁移和侵袭。此外，丁酸诱导的细胞凋亡是由内源性线粒体而不是外源性死亡受体或内质网应激介导的。

本发明的结果证实了Hela细胞的生长被丁酸钠抑制并阻滞在G1期。由于CC的迁移和侵袭是导致患者预后和治疗结果不理想的原因，我们进一步通过Transwell实验，发现丁酸钠治疗显著降低了Hela细胞系的迁移和侵袭。诱导细胞凋亡已成为丁酸发挥其抗癌作用的重要机制，我们进一步检测了丁酸钠治疗后相关凋亡指标的变化。与AnnexinV/PI染色结果一致，TUNEL染色也显示丁酸钠处理增加了凋亡的细胞。Western blot结果显示凋亡相关蛋白cleaved Caspase 3增加，表明丁酸可能通过诱导细胞凋亡抑制CC。

细胞凋亡是一种“自我控制”的细胞死亡，随着时间的推移，它会消除患病和受损的细胞，对肿瘤的发生和治疗至关重要。细胞凋亡可通过三种不同途径启动：外源性死亡受体、内源性线粒体和内质网应激。死亡受体可以激活Caspase 8，刺激下游Caspase因子，导致细胞凋亡。当内质网应激时，Caspase 12引发细胞凋亡。对于依赖线粒体的凋亡，Caspase9是关键的启动子。我们的western blot结果显示，Caspase 9显著增加，但Caspase 8和12没有变化，这表明丁酸通过线粒体途径促进人类CC细胞的凋亡。我们还发现，在丁酸钠处理后，介导线粒体凋亡途径的关键因子Apaf-1和CytC显著上调。之前的研究表明，丁酸可以增加促凋亡蛋白BAX的合成，但降低抗凋亡BCL-2，从而促进线粒体依赖性凋亡。然而，我们的数据显示丁酸钠只调节CC细胞中BAX蛋白的表达。ROS的积累被认为是线粒体介导的凋亡的早期事件，这一点被我们的研究结果所证实。在人类膀胱癌和乳腺癌中，丁酸过度生产ROS，导致半胱氨酸蛋白酶依赖的细胞凋亡。总之，我们的数据表明，丁酸处理激活了人类CC的线粒体依赖性凋亡。

“丁酸悖论”描述了丁酸对癌细胞和正常结肠上皮的相反作用。作为必要的营养物质，丁酸可用于修复受损的上皮细胞，维持管腔粘膜的完整性，但对癌细胞起抑制作用。之前的学者表明，少量的丁酸会代谢为乙酰辅酶a去刺激组蛋白乙酰转移酶，而高水平的丁酸在细胞核中积累，并作为组蛋白去乙酰化酶抑制剂发挥作用。这两种机制都增加了组蛋白乙酰化，从而调节不同基因的表达，产生广泛的抗肿瘤作用，包括诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖。进一步的研究表明，丁酸可以降低抗凋亡基因如BCL-2、BCL-xl的表达，同时增加促凋亡基因如BAX、BAK，从而促进细胞凋亡。另一方面，丁酸改变了代谢相关基因的表达，这可能解释Warburg效应。Warburg效应指癌细胞利用糖酵解而不是氧化磷酸化来满足有氧条件下的能量需求。丁酸通过降低葡萄糖转运蛋白GLUT1和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的mRNA水平，显著抑制葡萄糖代谢，从而诱导更多的结直肠癌细胞凋亡。此外，丁酸可以与G蛋白偶联受体41(G protein-coupled receptor 41,GPR41)、GPR43和GPR109a相互作用，发挥抗炎和抗肿瘤作用。GPR109a与配体丁酸结合，诱导结肠癌细胞凋亡。在乳腺癌中，丁酸可以激活GPR109a，抑制抗凋亡基因的表达和细胞存活。然而，丁酸抑制人类CC的详细机制仍有待于将来进一步研究。

我们研究中使用的Hela和Caski细胞系分别为HPV-18和HPV-16阳性细胞，这表明丁酸对HPV感染的CC具有潜在的治疗作用。尽管HPV是CC的重要致病因素，但HPV阳性患者的宫颈上皮是否癌变取决于阴道微生物群。研究揭示了与宫颈癌发生相关的独特微生物特征。与HPV阴性女性相比，HPV阳性女性的细菌多样性和组成更为复杂。此外，研究表明，像梭杆菌这样的宫颈微生物群可能会增加抗炎细胞因子，从而在与HPV感染和持续性相关的免疫抑制微环境的发展中发挥重要作用。沙眼衣原体则被证明会增加HPV感染的持续性，并且这种共同感染似乎会导致患CC的风险更高。丁酸被发现可以纠正肠道微生物群的失调，并增加有益细菌(包括乳酸杆菌)的丰度。众所周知，丁酸是乳酸杆菌和梭杆菌的重要代谢物，表明丁酸可能在阴道微生物群抑制CC中发挥关键作用。

总之，本发明的研究结果表明，丁酸通过激活线粒体依赖的凋亡途径抑制CC细胞系的增殖、侵袭和迁移。鉴于对HPV阳性CC细胞的抑制作用，丁酸可能对HIV阳性的CC患者具有潜在的治疗效果。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。