用于膜中自限性蛋白质孔插入的法拉第系统和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于 2020 年 6 月 10 日提交的美国临时专利申请号 62/705,097 的优先权，其内容全文出于所有目的以引用方式并入本文。

本申请可能与于 2019 年 12 月 11 日提交的国际专利申请号 PCT/EP2019/084581 相关，该申请要求于 2018 年 12 月 11 日提交的美国临时申请号 62/777,976的优先权，上述每个申请的内容全文出于所有目的以引用方式并入本文。

以引用方式并入

本说明书中提到的所有出版物和专利申请都以引用方式并入本文，所达到的程度如同每个单独的出版物或专利申请都被具体地和单独地指出以引用方式并入。

背景技术

基于纳米孔的测序芯片是一种可用于 DNA 测序的分析工具。此类装置可以包含大量配置为阵列的传感器单元。例如，测序芯片可以包括一百万个单元的阵列，例如具有1000 行乘 1000 列的单元。阵列的每个单元可包括膜和蛋白质孔，该蛋白质孔具有内径为一纳米等级的孔径。这种纳米孔已被证明在快速核苷酸测序中有效。

当在浸入导电流体中的纳米孔上施加电压电位时，可能存在因离子跨所述纳米孔的传导而产生的小离子电流。电流的大小对孔径和位于纳米孔内的分子类型敏感。分子可以是附着到特定核苷酸的特定标签，从而可以检测核酸特定位置处的核苷酸。可测量包含纳米孔的电路中的电压或其他信号（例如，在集成电容器上）以作为测量分子的电阻的方式，从而可以检测哪些分子在纳米孔中。

为了使测序芯片正常工作，对于给定的单元，通常只应在膜上插入一个孔。如果将多个孔插入单个膜中，则核苷酸同时通过多个孔产生的电签名将更难以解译。

在孔插入步骤期间跨膜施加电压可促进孔插入过程，可能通过降低膜的稳定性并允许孔更容易地将其自身插入膜中。然而，跨膜施加过大的电压会导致膜的广泛破坏，从而使单元无法使用。

因此，将有利的是提供一种用于将单个孔可靠地插入膜中同时降低过度损坏膜的风险的系统和方法。

发明内容

各种实施例提供了涉及将单个孔插入基于纳米孔的测序芯片的单元的膜中的技术和系统。在一些实施例中，将孔插入膜中降低了将额外的孔插入膜中的可能性。

其他实施例涉及与本文描述的方法相关联的系统和计算机可读介质。

在一些实施例中，提供了一种形成纳米孔传感器单元阵列的方法。该方法包括：接近单元引入纳米孔，该单元具有工作电极和密封该单元的膜，其中该工作电极由 AC 耦合的电源供电；跨该单元的该膜施加电压波形，其中该电压波形开始于第一电压并且经一段时间幅值增加到第二电压；以及在施加该电压波形的步骤期间将该纳米孔插入该膜中。

在一些实施例中，第一电压介于约 0 与 100 mV 之间并且第二电压介于约 100至 2000 mV 之间。

在一些实施例中，工作电极是电容性电极。

在一些实施例中，电压波形包括介于第一电压与第二电压之间的多个递增阶跃。

在一些实施例中，多个递增阶跃递增约 1 至 100 mV。

在一些实施例中，多个递增阶跃递增约 1 至 25 mV。

在一些实施例中，每个递增阶跃具有介于约 0.1 至 60 秒之间的持续时间。

在一些实施例中，递增阶跃的持续时间是可变的。

在一些实施例中，在较低电压处的递增阶跃的持续时间大于在较高电压处的递增阶跃的持续时间。

在一些实施例中，递增阶跃的持续时间是恒定的。

在一些实施例中，电压波形包括介于第一电压与第二电压之间的斜坡。

在一些实施例中，斜坡介于每分钟约 0.1 至 2.0 V 之间。

在一些实施例中，斜坡具有恒定斜率。

在一些实施例中，斜坡具有可变斜率。

在一些实施例中，斜坡在较低电压处具有的斜率小于在较高电压处的斜率。

在一些实施例中，施加电压波形的步骤被应用于未减薄的膜。

在一些实施例中，该方法进一步包括用施加的电压波形使未减薄的膜减薄。

在一些实施例中，提供了一种用于对分子进行测序的系统。该系统包括：基底上的单元的阵列，每个单元具有工作电极和被配置为由膜密封的开口，其中该工作电极由 AC耦合的电源供电；对电极；电源，其中该电源 AC 耦合到每个工作电极；控制器，其编程为：使用该工作电极和该对电极将电压波形递送到该单元，其中该电压波形开始于第一电压并且经一段时间幅值增加到第二电压。

在一些实施例中，工作电极是电容性电极。

在一些实施例中，电压波形包括介于第一电压与第二电压之间的多个递增阶跃。

在一些实施例中，电压波形包括介于第一电压与第二电压之间的斜坡。

在一些实施例中，控制器进一步编程为将电压波形递送到未减薄的膜。

在一些实施例中，提供了一种形成纳米孔传感器单元阵列的方法。该方法可包括：接近单元引入纳米孔，该单元具有工作电极和密封该单元的膜，其中该工作电极由电耦合的电源供电；跨该单元的该膜施加电压波形，其中该电压波形开始于第一电压并且经一段时间幅值增加到第二电压，其中该电压波形包括 AC 调制分量，该 AC 调制分量被配置为允许在跨该单元的该膜施加该电压波形时通过该工作电极进行电测量；以及在施加该电压波形的步骤期间将该纳米孔插入该膜中。

在一些实施例中，AC 调制分量具有小于 100 mV 的幅度。在一些实施例中，AC 调制分量具有介于 10 Hz 与 1000 Hz 之间的频率。

在一些实施例中，提供了一种形成覆膜单元的方法。该方法可包括：使膜形成材料在单元上方流动，该单元具有工作电极，其中该工作电极由电耦合的电源供电；将膜形成材料层设置在该单元上方；跨该膜形成材料层施加电压波形，其中该工作电极和对电极位于该膜形成材料层的相对侧，其中该电压波形包括 AC 调制分量，该 AC 调制分量被配置为允许在跨该膜形成材料层施加该电压波形时通过该工作电极进行电测量；以及将该膜形成材料层减薄成膜，该膜被配置为接收纳米孔。

在一些实施例中，AC 调制分量具有小于 100 mV 的幅度。在一些实施例中，AC 调制分量具有介于 10 Hz 与 1000 Hz 之间的频率。

参考以下具体实施方式和附图，可以更好地理解本发明的实施例的性质和优点。

在一些实施例中，提供了一种形成纳米孔传感器单元阵列的方法。该方法可包括：在包含氧化还原对的第一物质但不包含该氧化还原对的第二物质的溶液中接近单元引入纳米孔，该单元具有工作电极和密封该单元的膜，其中该工作电极由电耦合的电源供电；跨该单元的该膜施加电压波形，其中该电压波形开始于第一电压并且经一段时间幅值增加到第二电压，其中该电压波形具有将该氧化还原对的该第一物质维持在其当前氧化态的极性；以及在施加该电压波形的步骤期间将该纳米孔插入该膜中。

在一些实施例中，氧化还原对是水溶性的。在一些实施例中，氧化还原对是铁氰化物和亚铁氰化物。

在一些实施例中，该方法进一步包括施加第二电压波形，该第二电压波形具有将第一物质氧化或还原为第二物质的极性。

在一些实施例中，该方法进一步包括使分子穿过孔；以及施加测序电压以在法拉第条件下对分子进行测序。

在一些实施例中，提供了一种用于对分子进行测序的系统。该系统可包括：基底上的单元的阵列，每个单元具有工作电极和被配置为由具有纳米孔的膜密封的开口；对电极；电源，其中该电源电耦合到每个工作电极；控制器，其编程为：使用该工作电极和该对电极将电压波形递送到该单元，其中该电压波形开始于第一电压并且经一段时间幅值增加到第二电压，其中该电压波形具有将氧化还原对的第一物质维持在其当前氧化态的极性。

在一些实施例中，工作电极被配置为选择性地作为电容耦合的电极和电阻耦合的电极两者进行操作。

在一些实施例中，控制器进一步编程为递送第二电压波形，该第二电压波形具有将第一物质氧化或还原为第二物质的极性。

在一些实施例中，该系统进一步包括溶液，该溶液包含氧化还原对的第一物质但不包含该氧化还原对的第二物质，其中该溶液被配置为设置在阵列的单元中。在一些实施例中，氧化还原对是水溶性的。在一些实施例中，氧化还原对是铁氰化物和亚铁氰化物。

在一些实施例中，控制器进一步编程为施加电压以使分子穿过孔；并且施加测序电压以在法拉第条件下对分子进行测序。

附图说明

本发明的新颖特征在所附的权利要求书中具体阐述。通过参考以下具体实施方式并结合附图，可以更好地理解本发明的特征和优点，具体实施方式阐述了其中利用本发明原理的说明性实施例，在附图中：

图 1 是具有纳米孔单元阵列的纳米孔传感器芯片的实施例的俯视图。

图 2 示出可以用于表征多核苷酸或多肽的纳米孔传感器芯片中的纳米孔单元的实施例。

图 3 示出使用基于纳米孔的边合成边测序 (Nano-SBS) 技术执行核苷酸测序的纳米孔单元的实施例。

图 4 示出纳米孔单元中的电路的实施例。

图 5 显示在 AC 循环的亮时段和暗时段期间从纳米孔单元捕获的数据点实例。

图 6 示出纳米孔传感器单元的电路图的实施例。

图 7 示出了可用于促进孔插入的阶梯式电压波形。

图 8A 和图 8B 示出了可用于促进孔插入的斜坡式电压波形。

图 9A 和图 9B 示出了在一些实施例中，一旦孔已经被插入，该孔就可以消散跨膜本身积聚的电压，从而既降低了在孔已经被插入之后进一步增加电压时对膜造成损害的风险，并且降低了额外的孔插入的可能性。

图 10A 示出了阵列中的孔插入数量随着电压和时间变化的曲线图，且图 10B 示出了膜破裂所导致的失活/短路数量随着电压和时间变化的图。

图 11 示出根据本公开某些方面的计算机系统。

术语

除非另有定义，否则本文所用的科学技术术语具有如本领域的普通技术人员通常理解的相同意义。与本文所述的方法、装置和材料类似或等效的方法、装置和材料均可用于所公开技术的实践中。提供以下术语旨在有利于理解频繁使用的一些术语，并无限制本公开范围之意。本文中使用的缩写在化学和生物领域中具有其常规含义。

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除非上下文另外明确指出，否则术语“

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术语“渗透物”

具体实施方式

根据某些实施例，本文公开的技术和系统涉及将单个孔插入基于纳米孔的测序芯片的单元的膜中。在一些实施例中，将孔插入膜中降低了将额外的孔插入膜中的可能性，从而自限制了进一步的孔插入，并降低或消除了在插入步骤期间对主动反馈的需要。

首先描述了实例纳米孔系统、电路和测序操作，之后描述了用于置换 DNA 测序单元中纳米孔的实例技术。本发明的实施例可以以多种方式实现，包括作为过程，系统和在计算机可读存储介质和/或处理器上体现的计算机程序产品，诸如被配置为执行存储在耦合到处理器的存储器上和/或由所述存储器提供的指令的处理器。

I.基于纳米孔的测序芯片

图 1 是具有纳米孔单元 150 的阵列 140 的纳米孔传感器芯片 100 的实施例的俯视图。每个纳米孔单元 150 包括集成在纳米孔传感器芯片 100 的硅基底上的控制电路。在一些实施例中，侧壁 136 包括在阵列 140 中以分隔纳米孔单元150的组，使得每组可以接收用于表征的不同样品。每个纳米孔单元可用于核酸测序。在一些实施例中，纳米孔传感器芯片 100 包括盖板 130。在一些实施例中，纳米孔传感器芯片 100 还包括与诸如计算机处理器的其他电路相连接的多个管引脚 110。

在一些实施例中，纳米孔传感器芯片 100 包括同一封装中的多个芯片，例如多芯片模块 (MCM) 或系统级封装 (SiP)。芯片可以包括例如存储器、处理器、现场可编程门阵列 (FPGA)、专用集成电路 (ASIC)、数据转换器、高速 I/O 接口等。

在一些实施例中，纳米孔传感器芯片 100 耦合至（例如，对接至）纳米芯片工作站120，该纳米芯片工作站可以包括用于执行（例如，自动执行）本文公开的过程中的各种实施例的各种组件。此类过程可包括，例如，分析物输送机构，诸如用于输送脂质悬浮液或其他膜结构悬浮液、分析物溶液和/或其他液体、悬浮液或固体的移液器。纳米芯片工作站组件还可包括机器臂，一个或多个计算机处理器和/或存储器。在纳米孔单元 150 的阵列 140上可以检测到多个多核苷酸。在一些实施例中，每个纳米孔单元 150 是可以单独寻址的。

II.纳米孔测序单元

纳米孔传感器芯片 100 中的纳米孔单元 150 可以以许多不同的方式实现。例如，在一些实施例中，不同尺寸和/或化学结构的标签附着到待测序的核酸分子中的不同核苷酸。在一些实施例中，待测序的核酸分子的模板的互补链可以通过使带不同聚合物标签的核苷酸与模板杂交来合成。在一些实施方式中，核酸分子和附着的标签两者可以移动通过纳米孔，并且由于附着到核苷酸的标签的特定尺寸和/或结构，因此流过纳米孔的离子电流可以指示纳米孔中的核苷酸。在一些实施方式中，仅标签移入纳米孔中。也可以有许多不同的方式来检测纳米孔中的不同标签。

图 2 示出可以用于表征多核苷酸或多肽的纳米孔传感器芯片中的实例纳米孔单元 200 的实施例，诸如在图 1 的纳米孔传感器芯片 100 中的纳米孔单元 150。纳米孔单元 200 可以包括由介电层 201 和 204 形成的孔 205；在孔 205 上方形成的膜，诸如脂质双层 214；以及在脂质双层 214 上并通过脂质双层 214 与孔 205 分离的样品室 215。孔 205 可以包含一定体积的电解质 206，并且样品室 215 可以容纳包含纳米孔的主体电解质 208，例如，可溶性蛋白纳米孔跨膜分子复合物 (PNTMC)，以及目标分析物（例如，待测序的核酸分子）。

纳米孔单元 200 可以包括位于孔 205 底部的工作电极 202 和设置在样品室215 中的对电极 210。信号源 228 可以在工作电极 202 与对电极 210 之间施加电压信号。单个纳米孔（例如，PNTMC）可以通过由电压信号引起的电穿孔工艺插入脂质双层 214中，从而在脂质双层 214 中形成纳米孔 216。阵列中的单个膜（例如，脂质双层 214 或其他膜结构）可以彼此既不化学连接也不电连接。因此，阵列中的每一个纳米孔单元可以是独立的测序仪，产生与纳米孔相关的单个聚合物分子所特有的数据，所述纳米孔对目标分析物起作用，并调节通过其他不可透过的脂质双层的离子电流。

用于孔插入的系统和方法的其他实施例在下文第 III 部分中描述。具体来说，这些系统和方法描述了有效实现单元膜中单个孔插入的自限性孔插入。

如图 2 所示， 纳米孔单元 200 可以在基底 230 （诸如硅基底）上形成。介电层201 可以在基底 230 上形成。用于形成介电层 201 的介电材料可以包括，例如，玻璃、氧化物、氮化物等。用于控制电刺激并用于处理从纳米孔单元 200 检测到的信号的电路 222可以在基底 230 上和/或在介电层 201 内形成。例如，多个图案化的金属层（例如，金属 1至金属 6）可以在介电层 201 中形成，并且多个有源装置（例如，晶体管）可以在基底 230上制造。在一些实施例中，信号源 228 被包括作为电路 222 的一部分。电路 222 可以包括，例如，放大器、积分器、模数转换器、噪声滤波器、反馈控制逻辑和/或各种其他部件。电路 222 还可以耦合至处理器 224，所述处理器 224 耦合至存储器 226，其中处理器 224可以分析测序数据以确定已在阵列中测序的聚合物分子的序列。

工作电极 202 可以在介电层 201 上形成，并且可以形成孔 205 的底部的至少一部分。在一些实施例中，工作电极 202 是金属电极。对于非法拉第传导，工作电极 202可以由抗腐蚀和抗氧化的金属或其他材料制成，例如，铂、金、氮化钛和石墨。例如，工作电极 202 可以是具有电镀铂的铂电极。在另一个实例中，工作电极 202 可以是氮化钛(TiN) 工作电极。工作电极 202 可以是多孔的，从而增加其表面积以及与工作电极 202相关的产生的电容。因为纳米孔单元的工作电极可以不依赖于另一纳米孔单元的工作电极，所以在本公开中，该工作电极可以称为单元电极。

介电层 204 可以在介电层 201 之上形成。介电层 204 形成环绕阱 205 的壁。用于形成介电层 204 的介电材料可以包括，例如，玻璃、氧化物、一氮化硅 (SiN)、聚酰亚胺或其他合适的疏水绝缘材料。介电层 204 的顶表面可以硅烷化。硅烷化可以在介电层204 的顶表面之上形成疏水层 220。在一些实施例中，疏水层 220 具有约 1.5 纳米 (nm)的厚度。

由介电层壁 204 形成的孔 205 包括工作电极 202 之上的电解质 206 的体积。电解质 206 的体积可以缓冲，并且可以包括以下项的一种或多种：氯化锂 (LiCl)、氯化钠(NaCl)、氯化钾 (KCl)、谷氨酸锂、谷氨酸钠、谷氨酸钾、乙酸锂、乙酸钠、乙酸钾、氯化钙(CaCl

同样如图 2 所示，可以在介电层 204 的顶部上形成膜并跨过孔 205。在一些实施例中，膜可包括在疏水层 220 的顶部上形成的脂质单层 218。当膜到达孔 205 的开口时，脂质单层 208 可以转变为跨孔 205 的开口的脂质双层 214。脂质双层可以包括脂质或由其组成，诸如磷脂，例如，选自二植烷酰基-磷脂酰胆碱 (DPhPC)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二-O-植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱 (DoPhPC)、棕榈酰基-油酰基-磷脂酰胆碱 (POPC)、二油酰基-磷脂酰-甲基酯 (DOPME)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、鞘磷脂、1,2-二-O-植烷酰基-sn-甘油、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-350]、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-550]、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-750]、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-1000]、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-乳糖酰基、GM1神经节苷脂、溶血磷脂酰胆碱 (LPC) 或其任意组合。例如，也可以使用其他磷脂衍生物，诸如磷脂酸衍生物（例如，DMPA、DDPA、DSPA）、磷脂酰胆碱衍生物（例如，DDPC、DLPC、DMPC、DPPC、DSPC、DOPC、POPC、DEPC）、磷脂酰甘油衍生物（例如，DMPG、DPPG、DSPG、POPG）、磷脂酰乙醇胺衍生物（例如，DMPE、DPPE、DSPE、DOPE）、磷脂酰丝氨酸衍生物（例如，DOPS）、PEG 磷脂衍生物（例如，mPEG-磷脂、聚甘油-磷脂、功能化-磷脂、末端活化磷脂）、二苯酰磷脂（例如，DPhPC、DOPhPC、DPhPE 和 DOPhPE）。在一些实施例中，双层可使用基于非脂质的材料形成，诸如两亲性嵌段共聚物（例如，聚(丁二烯)-嵌段-聚(环氧乙烷)、PEG 二嵌段共聚物、PEG三嵌段共聚物、PPG 三嵌段共聚物和泊洛沙姆）和其他两亲性共聚物，其可以是非离子的或离子的。在一些实施例中，双层可以由基于脂质的材料和基于非脂质的材料的组合形成。在一些实施例中，双层材料可以在包括一种或多种有机溶剂诸如链烷（例如癸烷、十三烷、十六烷等）和/或一种或多种硅油（例如，AR-20）的溶剂相中提供。

如所示，脂质双层 214 嵌有单个纳米孔 216，所述纳米孔例如由单个PNTMC 形成。如上所述，纳米孔 216 可以通过电穿孔将单个 PNTMC 插入脂质双层 214 中形成。纳米孔 216 可以足够大以使至少一部分目标分析物和/或小离子（例如，Na

样品室 215 位于脂质双层 214 上方，并且可以容纳目标分析物的溶液以用于表征。所述溶液可以是含有主体电解质 208 的水溶液，并缓冲至最佳离子浓度且维持在最佳pH 以保持纳米孔 216 开放。纳米孔 216 穿过脂质双层 214，并且为从主体电解质 208至工作电极 202 的离子流动提供唯一路径。除纳米孔（例如，PNTMC）和目标分析物之外，主体电解质 208 还可以包括以下项的一种或多种：氯化锂 (LiCl)、氯化钠 (NaCl)、氯化钾(KCl)、谷氨酸锂、谷氨酸钠、谷氨酸钾、乙酸锂、乙酸钠、乙酸钾、氯化钙 (CaCl

对电极 (CE) 210 可以是电化学电位传感器。在一些实施例中，对电极 210 在多个纳米孔单元之间共享，并且因此可以称为共用电极。在一些情况下，共用电位和共用电极可以为特定分组内的所有纳米孔单元或至少所有纳米孔单元所共用。共用电极可以被配置为向与纳米孔 216 接触的主体电解质 208 施加共用电位。对电极 210 和工作电极 202可以耦合至信号源 228，以提供跨脂质双层 214 的电刺激（例如，电压偏置），并且可以用于感测脂质双层 214 的电特性（例如，电阻、电容和离子电流）。在一些实施例中，纳米孔单元 200 还可包括参考电极 212。

在一些实施例中，作为校准的一部分，在创建纳米孔单元期间进行各种检查。一旦纳米孔单元创建，可以执行进一步的校准步骤，例如，以识别性能符合期望的纳米孔单元（例如，单元中的一个纳米孔）。此类校准检查可以包括物理检查、电压校准、开放通道校准以及具有单个纳米孔的单元识别。

纳米孔传感器芯片中的纳米孔单元，诸如纳米孔传感器芯片 100 中的纳米孔单元 150，可以使用基于单分子纳米孔的边合成边测序 (Nano-SBS) 技术进行平行测序。

图 3 示出使用 Nano-SBS 技术执行核苷酸测序的纳米孔单元 300 的实施例。在Nano-SBS 技术中，可以将待测序的模板 332（例如，核苷酸分子或另一目标分析物）和引物引入纳米孔单元 300 样品室中的主体电解质 308 中。作为实例，模板 332 可以呈圆形或线形。核酸引物可以与模板 332 的一部分杂交，可以该模板的一部分添加四种带不同聚合物标签的核苷酸 338。

在一些实施例中，酶（例如，聚合酶 334，诸如 DNA 聚合酶）与纳米孔 316 缔合，以用于合成模板 332 的互补链。例如，聚合酶 334 可以共价附着到纳米孔 316。聚合酶334 可以使用单链核酸分子作为模板以催化核苷酸 338 掺入到引物上。核苷酸 338 可以包括标签种类（“标签”），其中核苷酸是四种不同类型中的一种：A、T、G 或 C。当带标签的核苷酸与聚合酶 334 正确复合时，可以通过电动力将标签拉到（例如，负载）到纳米孔中，诸如在电场作用下产生的力，所述电场由跨脂质双层 314 和/或纳米孔 316 施加的电压生成。标签尾可以位于纳米孔 316 的筒体中。由于标签的独特的化学结构和/或尺寸，保持在纳米孔 316 的筒体中的标签可以生成独特的离子阻断信号 340，从而电子识别标签所附着到的添加碱基。

如本文所用，“负载的”或“穿线的”标签可以是定位在纳米孔中和/或保持在纳米孔中或附近相当长的时间，例如，0.1 毫秒 (ms) 至 10000 ms。在一些情况下，标签在从核苷酸释放之前被负载在纳米孔中。在一些情况下，在核苷酸掺入事件释放后，负载的标签穿过纳米孔（和/或被其检测）的概率适当较高，例如，90% 至 99%。

在一些实施例中，在将聚合酶 334 连接至纳米孔 316 之前，纳米孔 316 具有高电导，例如，约 300 皮西门子 (300 pS)。当标签负载在纳米孔中时，由于标签的独特的化学结构和/或尺寸，生成独特的电导信号（例如，信号 340）。例如，纳米孔的电导可以为约60 pS、80 pS、100 pS 或 120 pS，各自对应于四种带标签的核苷酸中的一种。然后，聚合酶可以进行异构化和转磷酸化反应以将核苷酸掺入到正在生长的核酸分子中并释放标签分子。

在一些情况下，一些带标签的核苷酸可以与核酸分子（模板）的当前位置不匹配（互补碱基）。不与核酸分子碱基配对的带标签的核苷酸也可以穿过纳米孔。这些未配对的核苷酸可以在比正确配对的核苷酸保持与聚合酶缔合的时间范围更短的时间范围内被聚合酶拒绝。与未配对核苷酸结合的标签可以快速穿过纳米孔，并在短时间内（例如，少于 10ms）检出，而与配对核苷酸结合的标签可以负载到纳米孔中并在长时间内（例如，至少 10ms）检出。因此，未配对的核苷酸可以由下游处理器至少部分地基于在纳米孔中检测核苷酸的时间来进行识别。

包括负载的（穿线的）标签的纳米孔的电导（或等效电阻）可以通过信号值（例如，流过纳米孔的电压或电流）来进行测量，从而提供标签种类的识别，并由此提供当前位置的核苷酸的识别。在一些实施例中，直流 (DC) 信号施加至纳米孔单元（例如，使得标签移动穿过纳米孔的方向不是反向的）。但是，使用直流电长时间操作纳米孔传感器可以改变电极的组成，使穿过纳米孔的离子浓度失衡，并产生其他不期望的效果，从而影响纳米孔单元的寿命。施加交流 (AC) 波形可以减少电迁移，从而避免这些不期望的效果，并具有如下所述的某些优点。本文所述的利用带标签的核苷酸的核酸测序方法与施加的 AC 电压完全兼容，因此 AC 波形可用于实现这些优点。

当使用牺牲电极，即在载流反应中改变分子特性的电极（例如，含银电极），或在载流反应中改变分子特性的电极时，在 AC 检测循环期间对电极再充电的能力可能有利。当使用直流信号时，电极可以在检测周期中耗尽。再充电可以防止电极达到耗尽极限，诸如变得完全耗尽，这在电极较小时（当电极足够小以提供具有每平方毫米至少 500 个电极的电极阵列时）可能会出现问题。在一些情况下，电极寿命与电极的宽度成比例，并且至少部分取决于电极的宽度。

用于测量流过纳米孔的离子电流的合适条件是本领域已知的，并且本文提供了实例。可以通过跨膜和孔施加电压来进行测量。在一些实施例中，使用的电压在 -400 mV 至+400 mV 的范围内。使用的电压优选地在具有选自 -400 mV、-300 mV、-200 mV、-150 mV、-100 mV、-50 mV、-20 mV 和 0 mV 的下限和独立地选自 +10 mV、+20 mV、+50 mV、+100 mV、+150 mV、+200 mV、+300 mV 和 +400 mV 的上限的范围内。使用的电压可以更优选地在100 mV 至 240 mV 的范围内，并且最优选地在 160 mV 至 240 mV 的范围内。使用增加的施加电位，通过纳米孔来增加不同核苷酸之间的区别是可能的。使用 AC 波形和带标签的核苷酸进行核酸测序在 2013 年 11 月 6 日提交的题为“使用标签的核酸测序”的美国专利公开号 US 2014/0134616 中有描述，该美国专利全文以引用方式并入本文。除了 US2014/0134616 中描述的带标签的核苷酸外，还可以使用缺少糖或无环部分的核苷酸类似物，例如，五个常见核碱基：腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶和胸腺嘧啶的 (S)-甘油核苷三磷酸 (gNTP) (Horhota et al., Organic Letters, 8:5345-5347 [2006]) 进行测序。

图 4 示出在纳米孔单元（诸如纳米孔单元 400）中的电路 400（该电路可以包括图 2 中的电路 222 的部分）的实施例。如上所述，在一些实施例中，电路 400 包括对电极410，该电极可以在纳米孔传感器芯片中的多个纳米孔单元或所有纳米孔单元之间共享，并且因此也可以称为作为共用电极。共用电极可以被配置为通过连接至电压源 V

图 4 还示出表示工作电极 402（例如，工作电极 202）和脂质双层（例如，脂质双层 214）的电特性的电模型 422。电模型 422 包括对脂质双层相关的电容进行建模的电容器 426 (C

通路装置 406 是开关，所述开关可以用于将脂质双层和工作电极连接至电路400 或者断开与之的连接。通路装置 406 可以由控制线 407 控制，以启用或禁用跨纳米孔单元中的脂质双层施加的电压刺激。在脂质沉积以形成脂质双层之前，两个电极之间的阻抗可以非常低，因为纳米孔单元的孔未密封，因此通路装置 406 可以保持开放以避免短路情况。在脂质溶剂已经沉积到纳米孔单元以密封纳米孔单元的孔之后，通路装置 406 可以关闭。

电路 400 还可包括芯片上积分电容器 408 (n

在对积分电容器 408 进行预充电之后，复位信号 403 可以用于断开开关 401，以断开积分电容器 408 与电压源 V

根据模数转换器 (ADC) 435 的采样率，积分电容器 408 可以在固定的时间段充电或放电，所述采样率可以高于 1 kHz、5 kHz、10 kHz、100 kHz 或更多。例如，以 1 kHz的采样率，积分电容器 408 可以在约 1 ms 的时间段充电/放电，然后可以在积分时段结束时由 ADC 435 对电压电平进行采样和转换。特定的电压电平将对应于纳米孔中的特定标签种类，并且因此对应于模板上当前位置的核苷酸。

在由 ADC 435 采样之后，积分电容器 408 可以通过使用复位信号 403 来闭合开关 401 而再次进行预充电，使得积分电容器408 再次连接至电压源 V

数字处理器 430 可以处理 ADC 输出数据，例如，用于归一化、数据缓冲、数据过滤、数据压缩、数据缩减、事件提取、或将来自纳米孔单元阵列的 ADC 输出数据组装成各种数据帧。在一些实施例中，数字处理器 430 还执行下游处理，诸如碱基确定。数字处理器430 可以作为硬件实施（例如，在 图形处理单元 (GPU)、FPGA、ASIC 等中）或作为硬件和软件的组合实施。

因此，跨纳米孔施加的电压信号可用于检测纳米孔的特定状态。当纳米孔的筒体中不存在附着标签的多磷酸盐时，纳米孔的一种可能状态是开放通道状态，本文中也称为纳米孔的未穿线状态。纳米孔的另外四种可能状态各自对应于四种不同类型的附着标签的多磷酸核苷酸（A、T、G 或 C）中的一种被保持在纳米孔的筒体中的状态。纳米孔的另一种可能状态是脂质双层破裂时。

当在固定的时间段之后测量积分电容器 408 上的电压电平时，纳米孔的不同状态可以产生对不同电压电平的测量。这是因为积分电容器 408 上的电压衰减率（通过放电降低或通过充电而增加）（即，积分电容器 408 上的电压斜率的陡度与时间绘制图）取决于纳米孔电阻（例如，电阻器 R

在一些实施例中，与处于开放通道状态的纳米孔相关联的电阻在 100 MOhm 至20 GOhm 的范围内。在一些实施例中，在标签在纳米孔的筒体内的状态下，与纳米孔相关的电阻可以在 200 MOhm 至 40 GOhm 的范围内。在其他实施例中，可以省略积分电容器408，因为通向 ADC 435 的电压仍将随电模型 422 中的电压衰减而变化。

积分电容器 408 上的电压衰减率可以以不同的方式确定。如上所述，电压衰减率可以通过在固定的时间间隔内测量电压衰减来确定。例如，积分电容器 408 上的电压可以首先在时间 t1 处由 ADC 435 测量，然后在时间 t2 处由 ADC 435 再次测量电压。当积分电容器 408 上的电压斜率相对于时间曲线较陡时，电压差较大，而当电压曲线的斜率较缓时，电压差较小。因此，电压差可以用作确定积分电容器 408 上的电压衰减率以及纳米孔单元状态的度量。

在其他实施例中，电压衰减率通过测量所选电压衰减量所需的持续时间来确定。例如，可以测量电压从第一电压电平 V1 下降或增加至第二电压电平 V2 所需的时间。当电压相对于时间曲线的斜率较陡时，所需的时间较少，而当电压相对于时间曲线的斜率较缓时，所需的时间较多。因此，所需的测量时间可以用作确定积分电容器 n

在一些实施例中，电路 400 不包括在芯片上制造的通路装置（例如，通路装置406）和额外的电容器（例如，积分电容器 408 (n

为了执行核酸测序，积分电容器（例如，积分电容器 408 (n

1.穿线

穿线事件是将带标签的核苷酸附着到模板（例如，核酸片段），并且标签移动进出纳米孔的筒体时。在穿线事件期间，该移动可以发生多次。当标签位于纳米孔的筒体中时，纳米孔的电阻可以更高，并且更低的电流可以流过纳米孔。

在测序期间，标签可以不在某些 AC 循环（称为开放通道状态）的纳米孔中，其中电流最高，因为纳米孔的电阻较低。当标签被吸引至纳米孔的筒体中时，纳米孔处于亮模式。当标签从纳米孔的筒体中推出时，纳米孔处于暗模式。

2.亮时段和暗时段

在 AC 循环内，ADC 可以多次采样积分电容器上的电压。例如，在一个实施例中，以例如约 100Hz 跨系统施加 AC 电压信号，并且 ADC 的获取速率可以是每个单元约2000 Hz。因此，每个 AC 循环（AC 波形的循环）可以捕获约 20 个数据点（电压测量）。对应于 AC 波形的一个循环的数据点可以称为一组。在 AC 循环的一组数据点中，亚组可以例如在 V

3.测得电压

对于每个数据点，当开关 401 断开时，积分电容器（例如，积分电容器 408 (n

开关 401 可以以数据获取速率操作。开关 401 可以在两次数据获取之间相对短的时间段内闭合，通常在 ADC 测量之后立即闭合。所述开关允许在 V

图 5 显示在 AC 循环的亮时段和暗时段期间从纳米孔单元捕获的数据点实例。在图 5 中，出于说明目的，放大数据点的变化。施加到工作电极或积分电容器的电压(V

在亮时段 520 期间，施加到对电极的电压信号 510 (V

如图 5 所示，在 V

在暗时段 530 期间，施加到对电极的电压信号 510 (V

图 5 还示出在亮时段 540 期间，即使施加到对电极的电压信号 510 (V

对于纳米孔的恒定电阻的每一次测量，可以预期在亮时段或暗时段期间测量的电压大致相同（例如，在既定 AC 循环的亮模式下，当一个标签在纳米孔中时进行测量），但是当电荷在双层电容器 424 (C

关于测量的更多详细信息可见，例如，题为“具有可变电压刺激的基于纳米孔的测序”的美国专利公开号 2016/0178577、题为“具有可变电压刺激的基于纳米孔的测序”的美国专利公开号 2016/0178554、题为“使用对电刺激的双层响应测量进行无损双层监测”的美国专利申请号 15/085,700 和题为“双层形成的电增强”的美国专利申请号 15/085,713，其公开内容全文出于所有目的以引用方式并入本文。

4.归一化和碱基识别

对于纳米孔传感器芯片的每一个可用的纳米孔单元，可以运行生产模式以对核酸进行测序。测序期间捕获的 ADC 输出数据可以进行归一化以提供更高准确度。归一化可以考虑偏移效应，诸如循环形状、增益漂移、电荷注入偏移和基线偏移。在一些实施方式中，可以扁平对应于穿线事件的亮时段周期循环的信号值，从而获得用于循环的单个信号值（例如，平均值）或可以调整测量的信号以减少循环内衰减（一种循环形状效应）。增益漂移通常会缩放整个信号，并以 100 秒到 1,000 秒的等级改变。作为示例，可以通过溶液（孔电阻）的变化或双层电容的变化来触发增益漂移。基线偏移发生的时间尺度约为 100 ms，并且与工作电极处的电压偏移有关。由于需要在亮时段到暗时段维持测序单元中的电荷平衡，因此可以通过从穿线的有效整流比的变化来驱动基线漂移。

在归一化之后，实施例可以确定用于穿线的通道的电压群集，其中每一个群集对应于不同的标签种类，并且因此对应于不同的核苷酸。群集可用于确定对应于既定核苷酸的既定电压的概率。作为另一个实例，群集可以用于确定区分不同核苷酸（碱基）的截止电压。

III.自限性孔插入

在单元的膜中插入孔后，由于孔相对较高的电导，跨膜的电压开始迅速下降。跨膜的电压的下降降低了膜中额外的孔插入的驱动力。

图 6 示出了纳米孔传感器单元的电路图 600 的实施例，其突出了传感器单元的各种电压和组件中可能与本文所述的系统和方法相关的一些电压和组件，诸如在工作电极与对电极之间施加的电压 (Vapp) 602、跨双层的电压 (Vbly) 604、用于对工作电极 (C双层) 608 和积分电容器 (NCAP) 610 进行预充电的电压 (Vpre) 606 以及向对电极施加的电压 (Vliq) 612。

本文描述了利用这种性质来插入蛋白质孔并控制单个孔插入而在插入步骤期间没有主动反馈的方法和系统。在这种孔插入方法的一些中，通过电容性工作电极施加 AC耦合电压，并且通过无孔膜的低电导来跨实施例膜维持该电压。在一些实施例中，电压可以施加到整个单元阵列，与孔插入的当前状态无关。在一些实施例中，电压可以施加到具有膜的单元。施加的电压波形可以以斜坡、多个递增阶梯或其他形状逐渐增加，以产生低的额外蛋白质孔插入可能性，同时还降低膜损坏的风险。这可以通过使用小的电压阶跃、电压斜坡中适度的电压增加速率等来限制电压施加瞬变而实现。

例如，在如图 7 所示的一些实施例中，孔插入电压 (Vapp) 可以作为阶梯式电压波形 700 施加，该阶梯电压波形开始于 0 mV，并且以每 5 秒 100 mV 的增量增加，直到最大电压 600 mV。在一些实施例中，初始电压可以是约 0、10、20、30、40、50、60、70、80、90或 100 mV。在一些实施例中，阶跃增加量可以是约 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或 300 mV。在一些实施例中，每个阶跃的持续时间可为约 0.1、0.2.、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50 或 60 秒。在一些实施例中，这些阶跃可以具有可变的持续时间。例如，在一些实施例中，较低电压下的一些或所有阶跃可以比较高电压下的阶跃具有更长的持续时间。在一些实施例中，最大电压为约 100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900 或 2000mV。在一些实施例中，可以预先确定孔插入电压波形的一个或多个元素，例如初始起始电压、电压阶跃增加量的幅值、每个阶跃的持续时间和/或最大电压。

在如图 8A 所示的一些实施例中，孔插入电压可以作为斜坡式电压波形 800 施加，该斜坡式电压波形开始于 0 mV，并且以每分钟 1 V 的速率增加，直到最大电压 600mV。在一些实施例中，初始电压可以是约 0、10、20、30、40、50、60、70、80、90 或 100 mV。在一些实施例中，电压增加的速率为每分钟约 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0 V。在一些实施例中，最大电压为约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900 或 2000 mV。在一些实施例中，可以预先确定孔插入电压波形的一个或多个元素，例如初始起始电压、电压增加速率和/或最大电压。

在一些实施例中，孔插入电压波形的一个或多个元素可以基于所测量的单元组件的电性质和/或物理性质（诸如膜密封电阻，该电阻是在膜跨单元形成密封之后跨膜的电阻）来确定。在一些实施例中，这些测量可以在施加电压波形之前进行，使得波形在施加之前被完全确定，这与基于主动反馈的方法形成对比，该方法使用在刺激期间进行的测量来改变一个或多个刺激参数。因为本文所述的穿孔方法是自限性的，所以不需要使用主动穿孔方法，该主动穿孔方法包括测量由于孔插入膜中而引起的系统或系统组件的电性质或物理性质的变化，然后相应地调节穿孔电压以防止第二孔插入膜中。

在一些实施例中，本文所述的方法可以应用于在带悬浮膜的微孔的底部具有电容性电极并且在膜的另一侧上具有对电极的传感器阵列。在从所有单元移除插入驱动电压施加之后，传感器可用于检测孔的存在。尽管在电压施加期间有可能检测到孔的存在，但是在该方法中这不是必须的，并且可以在没有对阵列中的任何单个传感器或整体上的电压施加的反馈的情况下插入孔。

该方法有效地扫描克服孔插入活化势垒所需的电压，该电压可以在阵列中的各个膜之间、在阵列上的小区域或大区域之间、或者在来自一个装置的阵列到来自第二装置的另一个阵列之间变化。此外，穿孔电压可以在孔突变体之间、在包括脂质双层、嵌段共聚物或其他实施方式的膜组成和构象之间变化。通过在从低到高的范围内扫描或扫过电压，单个电压波形可以足够稳健，以有效地作用于大量不同类型的孔阵列或带一定可变性的相同类型的孔阵列。

此外，通过从低电压到高电压进行扫描，孔更有可能在双层达到损坏膜的临界电压电平之前插入膜中。此外，如图 9A 和图 9B 所示，一旦孔已经被插入，该孔就可以消散跨膜积聚的电压，从而既降低了在孔已经被插入之后当电压进一步增加时对膜造成损害的风险，并且降低了额外的孔插入的可能性。只要电压阶跃的幅值或电压斜坡的增加速率不太大，孔就能有效地消散跨膜积聚的过量电压，从而降低损坏膜的风险，并降低额外的孔插入的可能性。另一方面，希望增加电压阶跃的幅值或增加电压斜坡的增加速率，以便减少完成穿孔步骤所需的时间。

在一些实施例中，电压波形的上限可以通过将随着电压和时间变化的孔插入的动力学和/或概率与随着电压和时间变化的膜损坏的动力学和/或概率进行比较来确定。例如，图 10A 示出了阵列中的孔插入数量随着电压变化的曲线图，且图 10B 示出了通常由膜破裂和损坏所导致的去激活/短路数量随着电压变化的图。从这两个曲线图中，可以确定最佳的最大电压，该电压平衡了大量的孔插入和少量的去激活/短路。

在一些实施例中，在孔插入步骤期间，溶液中的孔浓度经选择为足够低以减少孔被动插入膜中，同时仍然足够高以允许孔在电压辅助下插入膜中。孔的被动插入指孔插入膜中，而无需跨膜施加电压来帮助孔插入。在一些实施例中，通过被动插入而插入的孔的百分比小于 50%、40%、30%、20% 或 10%，并且通过电压辅助式插入而插入的孔的百分比为至少 50%、60%、70%、80% 或 90%。降低被动孔插入速率可以降低向单个膜中插入多个孔的可能性。

在一些实施例中，一旦在单元上放置膜，漏电流会导致电压积聚在阵列中的一个或多个单元中。这种捕获的电荷的幅值会随着时间和在单元之间变化，这使得在诱导穿孔时很难跨单元的所有膜施加均匀的电压。例如，当阵列中的单元中存在不同量的捕获的电荷时，对所有单元施加均匀的电压 (Vapp)，可导致单元在穿孔步骤期间经历不同量的有效电压，这可导致带单个孔插入的单元数量的高度可变性和/或在一些单元中施加过量电压，这可对膜造成损害。使用阶梯式或斜坡式电压波形可以解决这些问题。

在一些实施例中，通过使溶剂和膜材料（诸如脂质或嵌段共聚物）在单元开口上流动来实现在单元开口上形成膜。然后，例如，如果使用脂质，则可以通过以下方式将膜减薄为双层：通过跨膜施加电压，如美国专利公开号 20170283867A1 中进一步描述的，和/或通过操纵跨膜的渗透压不平衡，如国际专利公开号 WO2018001925 中进一步描述的，每一篇文献全文出于所有目的以引用方式并入本文。如本文所述，减薄的膜是足够薄（例如，厚度小于孔的长度）的膜，使得孔可以插入膜中，而未减薄的膜是厚度太大（例如，厚度大于孔的长度）而不允许孔插入的膜。在一些实施例中，在阵列中的单元上形成减薄的膜（即脂质双层）可以在开始穿孔过程和将孔插入膜中之前完成。在其他实施例中，减薄膜的过程可以与将孔插入膜的过程结合，例如，对于减薄过程和穿孔过程两者，使用相同的电压波形，诸如本文所述的任何电压波形，并且在减薄和穿孔的组合过程中，孔复合体可以流过膜。在一些实施例中，可以在膜材料已经被分配到单元上并且跨阵列中的单元形成未减薄的膜之后，施加减薄和穿孔的组合过程，因为在膜材料分配和形成初始未减薄的膜期间施加电压可能不均匀地捕获电荷。此外，在组合的减薄和穿孔过程期间，可跨膜建立渗透不平衡。将减薄步骤和穿孔步骤组合可以显著减少在阵列中制备多孔传感器所需的时间，从而提高传感器阵列系统的产量。

本文所述的方法提供了许多益处，包括提高单孔插入的成功率，降低多孔插入的速率，以及降低损坏膜的可能性。

IV.法拉第系统和方法中的自限性孔插入

如上所述，在电压施加经电容耦合的系统（诸如非法拉第电化学系统）和方法中，驱动孔插入的电压以与膜电导成比例的速率衰减。因此，当电导增加几个数量级时（例如，从密封膜到单孔膜），跨膜维持的电压迅速降低，并在随后的电压施加中保持较低水平，而无需改变施加到穿孔膜上的电压。以这种方式，可使用具有悬浮膜的电极阵列在各种条件下驱动自限性孔插入，而无需旨在防止额外的孔插入的主动刺激变化。

然而，在电压施加经电阻耦合的系统（例如，法拉第电化学系统）中，跨膜的电压不会作为膜电导变化的一阶效应衰减。只要维持电极与电解质之间的电阻耦合，膜上的电压就将是一阶常数。通过最初分配能够进行电阻耦合但处于阻止电阻耦合的状态的流体，可暂时且可逆地建立电容耦合以实现自限性穿孔。孔插入之后，可通过交换溶液或施加电压来修改流体以再次允许电阻耦合。

例如，对于可逆的电化学系统 A + e = B（其中“e”是电子，并且 A 和 B 是化学物质的氧化态），可通过最初消除所有物质“A”使得溶液仅包含物质“B”来防止该电化学系统继续进展。在这种情况下，系统在负（还原）偏压下表现为电容耦合。通过施加正（氧化）偏压，物质 A 可再生，并且系统将恢复其法拉第（电阻耦合）特性。

类似地，如果反之消除物质“B”使得溶液仅包含物质“A”，则溶液在正（氧化）偏压下表现为电容耦合。通过施加负（还原）偏压，物质“B”将再生，并且系统将恢复其法拉第（电阻耦合）特性。

这允许系统和方法根据需要选择性地且可逆地作为法拉第或非法拉第系统和方法操作。如本文所述，作为非法拉第系统的临时或选择性操作允许利用自限性孔插入系统和方法。例如，可施加斜坡式电压波形以促进单个孔插入，并且在移除孔溶液并用包含具有待测序分子的样品的溶液替代之后，系统和方法可以在如上所述的法拉第条件下操作，例如，通过提供氧化还原物质对的仅一半并在适当的氧化或还原条件下操作。

在一些实施例中，在孔插入期间使用的包含孔的溶液不包括氧化还原对或对（即，既没有“A”也没有“B”，或者只有“A”或“B”之一）。在一些实施例中，包含待测序分子（即核酸、聚合物、核酸的衍生物分子等）的溶液可包含氧化还原对或对，或可包含氧化还原对的物质之一。在一些实施例中，使用电压来再生氧化还原对的缺失物质。

氧化还原对的实例包括亚铁氰化物和铁氰化物、二茂铁甲酸 (FCA) 和二茂铁乙酸 (FAA)、[Co(bpy)]

A.

在一些测序系统中，特别是在大分子穿过孔的情况下，在法拉第条件下操作可能是需要的，因为它可以允许跨孔恒定施加电压以驱动分子穿过孔和/或允许经长持续时间获取连续测量读数。在测序期间使样品分子穿过孔的纳米孔测序系统和方法的实例包括来自 Oxford Nanopore（即美国专利号 9,758,823 和 10,416,117，每篇专利均以引用方式并入本文）和 Stratos Genomics（即美国专利号 7,939,259 和 9,771,614，每篇专利均以引用方式并入本文）的测序仪。

例如，Stratos Genomics 通过从核酸模板创建“Xpandomer”来对核酸进行测序。这是通过将核酸信息编码在更容易检测的长度延长的替代聚合物上来实现的。替代聚合物（在本文中称为“Xpandomer”）是通过模板导向合成来形成的，该模板导向合成保留了靶核酸的原始遗传信息，同时也增加了序列数据的各个元素的线性分离。

在一个实施例中，公开了一种用于对靶核酸进行测序的方法，其包括：a) 提供通过模板导向合成产生的子链，该子链包括偶联在对应于该靶核酸的全部或一部分的连续核苷酸序列的序列中的多个亚基，其中各个亚基包括系链、至少一个探针或核碱基残基和至少一个可选择性切割的键；b) 切割该至少一个可选择性切割的键以产生长度长于该子链的该多个亚基的 Xpandomer，该 Xpandomer 包括用于解析对应于该靶核酸的全部或一部分的该连续核苷酸序列的序列中的遗传信息的系链和报告元件；和 c) 检测该 Xpandomer的报告元件。

在更具体的实施例中，用于解析遗传信息的报告元件可以与 Xpandomer 的系链、切割该至少一个可选择性切割的键之前的子链和/或切割该至少一个可选择性切割的键之后的 Xpandomer 相关联。Xpandomer 可进一步包括该至少一个探针或核碱基残基的全部或一部分，并且用于解析遗传信息的报告元件可以与该至少一个探针或核碱基残基相关联或可以是探针或核碱基残基本身。此外，可选择性切割的键可以是共价键、系链内键、子链的探针或核碱基残基之间或内部的键，和/或子链的探针或核碱基残基与靶模板之间的键。

在进一步的实施例中，公开了用于在对靶核酸进行测序的模板导向合成中使用的寡聚体底物构建体。寡聚体底物构建体包括：接合到第二探针部分的第一探针部分，第一探针部分和第二探针部分中的每一者都具有适合模板导向合成的端基；以及具有第一端和第二端的系链，其中系链的至少第一端接合到第一探针部分和第二探针部分中的至少一者，其中寡聚体底物构建体在用于模板导向合成时能够形成子链，该子链包括受约束的Xpandomer 并且具有偶联在对应于靶核酸的全部或一部分的连续核苷酸序列的序列中的多个亚基，其中各个亚基包括系链、第一探针部分和第二探针部分以及至少一个可选择性切割的键。

在另一实施例中，公开了用于在对靶核酸进行测序的模板导向合成中使用的单体底物构建体。单体底物构建体包括：具有适合模板导向合成的端基的核碱基残基；以及具有第一端和第二端的系链，其中系链的至少第一端接合到核碱基残基，其中单体底物构建体在用于模板导向合成时能够形成子链，该子链包括受约束的 Xpandomer 并且具有偶联在对应于靶核酸的全部或一部分的连续核苷酸序列的序列中的多个亚基，其中各个亚基包括系链、核碱基残基和至少一个可选择性切割的键。

在更进一步的实施例中，公开了包括与模板链形成双链体的子链的模板-子链双链体，以及从模板链和寡聚体或单体底物构建体形成该双链体的方法。

V.电压波形的 AC 调制

在一些实施例中，如图 7 所示，孔插入波形 700 可以是利用 AC 调制的电压波形。如图所示，孔插入波形 702 是阶梯式的，并且 AC 调制 702 分量可叠加在电压波形700 顶上以在每个阶梯式电压处提供快速电压波动。电压波动或变化允许在孔插入期间的电穿孔步骤期间在施加孔插入波形 700 的同时进行电测量。这些电测量可用于检查膜完整性（即检测作为短路状况的膜故障）、膜泄漏（即膜电阻和/或电导）、孔的插入，并且通常可用于监测电穿孔步骤的进展。在一些实施例中，不能在施加电压波形的同时进行测量，并且在那些实施例中，通常在施加电压波形之前、之后或之间进行测量。将 AC 调制分量与电压波形叠加允许同时施加电压波形并进行测量。

在一些实施例中，其他电压波形也可以与 AC 调制分量叠加。例如，膜形成波形可以被 AC 调制以允许在孔上方形成膜的步骤期间在施加膜形成波形的同时进行电测量。这些电测量可用于确定孔是否被膜形成材料覆盖（即检查短路状况）、检查膜完整性（即检测作为短路条件的膜故障）、膜泄漏（即膜电阻和/或电导）、膜是否具有适合孔插入的厚度，并且通常可用于监测膜形成步骤的进展。

在一些实施例中，可以被 AC 调制的另一电压波形是可用于使分子穿过孔易位的易位电压波形。

在一些实施例中，可以使 AC 调制分量的幅度最小化以减少 AC 调制分量对电压波形的主要功能（即，膜形成或孔插入）的影响，同时仍然允许获得精确测量。在膜形成步骤和/或孔插入步骤期间，相对较大幅度的 AC 调制分量可能使膜显著地经受高于预期的瞬态电压，这可能导致例如膜故障或多孔化。在一些实施例中，AC 调制分量的幅度可以小于200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、20 或 10 mV。在一些实施例中，AC 调制分量的幅度可以小于被调制的电压波形的幅度的 50%、40%、30%、20% 或 10%。在其他实施例中，AC 调制分量的幅度可以与被调制的电压波形的幅度成比例。

在一些实施例中，可以使 AC 调制分量的频率最小化，同时仍然允许准确测量。在一些实施例中，AC 调制的频率可以小于采样最大频率的 10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5、0.1倍。在一些实施例中，频率为至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900 或 1000 Hz。在一些实施例中，频率小于 1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20 或 10 Hz。在一些实施例中，频率介于 10 至 1000 Hz、或 25 至 750 Hz、或 50 至500 Hz 之间。

图 8B 示出了图 8A 中所示的自限性穿孔波形的实施例，其中添加了用于进行测量的 AC 调制分量 802。在该实施例中，AC 调制分量的幅度为 100 mV，并且被示出为如图上线的粗细。

任何其他电压波形都可以与 AC 调制分量叠加，以便在施加电压波形时进行测量。

VI.计算机系统

本文提到的任何计算机系统可以利用任何合适数量的子系统，其中许多可能是任选的。这种子系统的实例在图 11 的计算机系统 1110 中示出。在一些实施例中，计算机系统包括单个计算机设备，其中子系统可以是计算机设备的部件。在其他实施例中，计算机系统包括多个计算机设备，每个计算机设备是具有内部组件的子系统。计算机系统可以包括台式计算机和膝上型计算机、平板电脑、移动电话和其他移动装置。

图 11 所示的子系统经由系统总线 1180 互连。示出附加子系统，诸如打印机1174、键盘 1178、存储装置 1179、监视器 1176（其与显示适配器 1182 联接）等。耦合至I/O 控制器 1171 的外围装置和输入/输出 (I/O) 装置可以通过本领域已知的任何数量的装置，诸如 I/O 端口 1177（例如，USB、FireWire

计算机系统可以包括多个相同的部件或子系统，例如，通过外部接口 1181、通过内部接口或通过可移动存储装置连接在一起，该可移动存储装置可以从一个部件连接或移动至另一个部件。在一些实施例中，计算机系统、子系统或装置在网络上通信。在这种情况下，一台计算机可以视为客户端，另一台计算机可以视为服务器，其中每一台计算机均可以视为同一计算机系统的一部分。客户端和服务器可以各自包括多个系统、子系统或组件。

实施例的各方面可以使用硬件电路（例如，APSIC 或 FPGA）和/或使用具有一般可编程处理器的计算机软件，以控制逻辑的形式，以模块化或集成方式来实施。如本文所用，处理器可包括单核处理器、在同一集成芯片上的多核处理器、或在单电路板上或联网的多个处理单元，以及专用硬件。基于本文提供的公开内容和启示，本领域普通技术人员将知道并理解使用硬件以及硬件和软件的组合实现本发明实施例的其他方式和/或方法。

可以使用任何合适的计算机语言诸如 Java、C、C++、C#、Objective-C、Swift 或脚本语言诸如 Perl 或 Python，使用例如传统技术或面向对象技术，将本申请中描述的任何软件组件或功能实现为由处理器执行的软件代码。软件代码可以作为一系列指令或命令存储在计算机可读介质上，以进行存储和/或传输。合适的非暂时性计算机可读介质可以包括随机存取存储器 (RAM)、只读存储器 (ROM)、磁性介质诸如硬盘驱动器或软盘、或者光学介质诸如光盘 (CD) 或 DVD（数字通用光盘）、闪存等。所述计算机可读介质可以是这种存储或传输设备的任何组合。

也可以使用载波信号对此类程序进行编码和发送，载波信号调节为适于通过符合包括互联网在内的各种协议的有线、光学和/或无线网络来传输。如此，计算机可读介质可以使用经这种程序编码的数据信号来创建。可以将以程序代码编码的计算机可读介质与兼容装置打包在一起，或者与其他装置分开提供（例如，经由互联网下载）。任何此类计算机可读介质可以驻留在单个计算机产品（例如，硬盘驱动器、CD 或整个计算机系统）上或内部，并且可以存在于系统或网络内的不同计算机产品上或内部。计算机系统可以包括监测器、打印机或其他合适的显示器，用于向用户提供本文提到的任何结果。

本文描述的任何方法可以由包括一个或多个处理器的计算机系统完全或部分地执行，该计算机系统可以构造为用于执行步骤。因此，实施例可以针对被配置成执行本文描述的任何方法的步骤的计算机系统，可能具有执行相应步骤或相应步骤组的不同组件。尽管以编号的步骤呈现，但是可以同时或在不同时间或以不同顺序执行本文所述方法的步骤。此外，部分的这些步骤可以与其他方法中其他步骤的部分一起使用。另外，全部或部分步骤可以任选。另外，任何方法的任何步骤都可以用模块、单元、电路或用于执行这些步骤的系统的其他装置来执行。

在不脱离本发明实施例的精神和范围的情况下，可以以任何合适的方式组合特定实施例的具体细节。然而，本发明的其他实施例可以针对与每个单独方面或者这些单独方面的特定组合有关的特定实施例。

尽管为了清楚理解的目的先前已经相当详细地描述了前述实施例，但是本发明并不局限于所提供的细节。还有许多实现本发明的替代方法。所公开的实施例是说明性的而不是限制性的。为了说明和描述的目的，已经给出了本发明的示例性实施例的以上描述。并不旨在穷举本发明或将本发明限制为所描述的精确形式，并且根据以上教导，许多修改和变化是可能的。

当特征或要素在本文中被称为在另一特征或要素“上”时，它可以直接在另一特征或要素上，或者也可以存在中间特征和/或要素。相反，当特征或要素被称为“直接在”另一特征或要素“上”时，则不存在中间特征或要素。还将理解，当特征或要素被称为“连接”、“附接”或“耦接”至另一特征或要素时，它可以直接连接、附接或耦接至另一特征或要素，或者可以存在中间特征或要素。相反，当特征或要素被称为“直接连接”、“直接附接”或“直接耦接”至另一特征或要素时，则不存在中间特征或要素。尽管对于一个实施例进行了描述或示出，但是如此描述或示出的特征和要素可以应用于其他实施例。本领域的技术人员还将认识到，提及与另一特征“相邻”设置的结构或特征可以具有与相邻特征重叠或位于其之下的部分。

本文所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而并非旨在限制本发明。例如，如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”也旨在包括复数形式，除非上下文另外明确地指出。还将进一步理解，当在本说明书中使用术语“包括”和/或“包含”时，其指定了所规定的特征、步骤、操作、要素和/或组分的存在，但并不排除存在或添加一个或多个其他特征、步骤、操作、要素、组分和/或它们的组。如本文所用，术语“和/或”包括相关联的列出项目中的一者或多者的任何组合和所有组合，并且可以缩写为“/”。

为了便于描述，在本文中可以使用空间上相对的术语，诸如“下方”、“下面”、“低于”、“上方”、“上面”等，以描述一个要素或特征与另外的要素或特征的关系，如附图中所展示。应当理解，除了附图中描绘的取向之外，空间上相对的术语还旨在涵盖装置在使用或操作中的不同取向。例如，如果附图中的装置是倒置的，则描述为在其他要素或特征“下方”或“之下”的要素于是将定向为在其他要素或特征“上方”。因此，示例性术语“下方”可以涵盖“上方”和“下方”这两个取向。可以以其他方式定向该装置（旋转90度或以其他取向），并且据此解释本文所用的空间上相对的描述语。类似地，除非另外具体地指出，否则“向上”、“向下”、“垂直的”、“水平的”等术语在本文中仅用于解释的目的。

尽管本文可以使用术语“第一”和“第二”来描述各种特征/要素（包括步骤），但是除非上下文另外指出，否则这些特征/要素不应受这些术语的限制。这些术语可以用于将一个特征/要素与另一个特征/要素区分开。因此，在不脱离本发明的教导内容的情况下，下面讨论的第一特征/要素可以被称为第二特征/要素，并且类似地，下面讨论的第二特征/要素可以被称为第一特征/要素。

在整个本说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另外要求，否则词语“包括”和诸如“包含”和“含有”的变型意味着可以在方法和物品（例如，组合物以及包括装置和方法的设备）中共同采用各种组分。例如，术语“包括”将被理解为暗示包括任何所规定的要素或步骤，但是不排除任何其他要素或步骤。

如本文在说明书和权利要求书中所用，包括如在示例中所用，并且除非另外明确地指定，否则所有数字都可以被解读为好像前面有词语“约”或“大约”，即使该术语没有明确地出现。当描述幅度和/或位置时，可以使用短语“约”或“大约”来指示所描述的值和/或位置在值和/或位置的合理预期范围内。例如，数值可以具有为规定值（或值的范围）的+/-0.1%、规定值（或值的范围）的+/- 1%、规定值（或值的范围）的+/- 2%、规定值（或值的范围）的+/- 5%、规定值（或值的范围）的+/- 10% 等的值。除非上下文另外指出，否则本文给出的任何数值也应当被理解为包括约或大约该值。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“约10”。本文叙述的任何数值范围旨在包括其中所包含的所有子范围。还应当理解，如本领域技术人员适当理解的那样，当公开了某个值时，则还公开了“小于或等于”该值、“大于或等于该值”以及值之间的可能范围。例如，如果公开了值“X”，则还公开了“小于或等于 X”以及“大于或等于 X”（例如，在 X 是数值的情况下）。还应当理解，在整个本申请中，数据以多种不同格式提供，并且该数据表示端点和起点以及数据点的任何组合的范围。例如，如果公开了特定数据点“10”和特定数据点“15”，则应当理解，大于、大于或等于、小于、小于或等于、等于 10 和 15 以及介于 10 和 15 之间的值被认为是公开的。还应当理解，还公开了两个特定单元之间的每个单元。例如，如果公开了 10 和 15，则还公开了 11、12、13 和 14。

尽管上面描述了各种说明性实施例，但是在不脱离如权利要求书所描述的本发明范围的情况下，可以对各种实施例进行多种改变中的任一种。例如，在替代性实施例中，可以经常改变执行所描述的各种方法步骤的顺序，而在其他替代性实施例中，可以完全跳过一个或多个方法步骤。在一些实施例中，可以包括各种装置和系统实施例的任选特征，而在其他实施例中可以不包括。因此，前面的描述主要是为示例性目的而提供的，并且不应当解释为限制在权利要求书中阐述的本发明范围。

本文所包括的示例和图示以图示而非限制的方式示出了其中可以实践本主题的具体实施例。如所提及的，可以利用其他实施例并且从中得出其他实施例，使得可以在不脱离本公开范围的情况下进行结构上和逻辑上的代替和改变。本发明主题的这些实施例在本文可以单独或共同地由术语“本发明”来指代，这仅仅是为了方便，而并非要在实际上公开了多于一个本发明构思的情况下将本申请的范围主动限制于任何单个本发明构思。因此，尽管本文已经展示和描述了具体实施例，但是为实现相同目的而计算的任何布置可以代替所示的具体实施例。本公开旨在覆盖各种实施例的任何和所有的修改或变型。在回顾以上描述之后，以上实施例的组合以及本文未明确描述的其他实施例对于本领域的技术人员将是显而易见的。

本文提及的所有专利、专利申请、出版物和说明书全文出于所有目的以引用方式并入本文。没有一项被认为是现有技术。