一种用于细辛属植物材料快速鉴定的PCR引物、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种用于细辛属植物快速鉴定的PCR引物、试剂盒及其应用。

背景技术

马兜铃科(Aristolochiaceae)隶属于被子植物门双子叶植物纲木兰亚纲马兜铃目(Aristolochiales)，分为马兜铃亚科和细辛亚科，包含植物600余种，且大多含有马兜铃酸。主要药材包括马兜铃、关木通、广防己、细辛、青木香、天仙藤、朱砂莲、马蹄香等。马兜铃属植物中主要含有马兜铃酮、青木香酸、季铵生物碱、木兰碱、轮环藤碱等成分。细辛属(学名：Asarum L.)植物多数种类主要成分为甲基丁香酚、黄樟醚、细辛酮、沈香酸、大屯细辛酮以及有强心作用的生物碱。

马兜铃科植物在传统方剂、药膳中应用很广，但随着对马兜铃酸毒性认识的不断深入，马兜铃酸早在2002年就被世界卫生组织(WHO)列入第一类致癌物。我国药品监督管理部门对中草药物的限制也在不断加强，2008年，国家食品药品监督管理局(现国家食品药品监督管理总局)制定《含毒性药材及其他安全性问题中药品种的处理原则》，要求加强对相关药物的研究和管理；在2017年中国国家药监总局还公布《可能含有马兜铃酸的马兜铃科药材名单》，因此，马兜铃科中的马兜铃亚科植物基本在食品/保健品中已经禁用，但是细辛属植物仍然在用，其含有马兜铃酸。基于以下原因，有必要开发针对细辛属植物的快速鉴定技术：(1)细辛属植物入药部位根与白薇、徐长卿等药材容易混淆难以分辨，中草药药品混淆、掺假贩卖现象频发，难以通过常规形态学方法鉴定；(2)细辛属植物作为的中草药入药的部位不同，市面上产品无法整体整株展现，无法通过形态学鉴定；(3)随着人们在饮食保健上投入增多，特别是在传统中药食疗上追求的菜品花样也日新月异，同时，纯天然无公害的野菜更是受到大众的追捧，因食用含马兜铃酸的药膳、中草药剂药丸而导致马兜铃酸中毒的事件频频发生，但由于缺乏有效的快速鉴定技术，经常无法及时诊断出中毒原因、甚至出现误诊。

综上，食品安全关系国计民生，食品材料的物种鉴定技术是食品安全链的重要环节，原料来源不明或成分组成不明的食物会对食品安全带来巨大的风险与隐患，常规的形态学鉴定方法解决不了这些问题，因此开发准确、快速的鉴定食品中的细辛成分的技术十分必要。近十年来，多种分子生物学技术已应用于其它物种的快速鉴定，例如：DNA条形码技术(DNA Barcoding)、PCR技术、限制性片段长度多态性技术(Restriction FragmentLength Polymorphism，RFLP)、随机扩增多态性DNA技术(Random Amplified PolymorphicDNA，RAPD)、扩增片段长度多态性技术(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)以及基因芯片技术等，但从目前已有报道来看，还未建立针对细辛属植物物种的快速鉴定方法，未能完全满足我国市场监管，食品安全监管的检测检验需求。

发明内容

本发明的目的是针对上述问题，提供一种用于细辛属植物快速鉴定的PCR引物、试剂盒及其应用，其特异性强、灵敏度高，能够快速鉴定出待测植物是否是细辛属植物。

本发明请求保护的技术方案如下：

一种用于细辛属植物快速鉴定的PCR引物，所述引物的核苷酸序列为：

上游引物Asa_F：5'-TATCTCTTTCTTTTTTTCAAAAGG-3'，

下游引物Asa_R：5'-ATGGGCTTTTGCCAATGAGCCAATC-3'。

一种用于细辛属植物快速鉴定的试剂盒，包括前述的PCR引物。

优选地，所述的试剂盒，还包括用于进行PCR扩增和/或PCR扩增产物电泳所需的试剂。

上述的PCR引物在如下任一方面的应用：

(1)鉴定或辅助鉴定待测材料是否是细辛属植物材料或是否含有细辛属植物材料；

(2)制备鉴定或辅助鉴定待测材料是否是细辛属植物材料或是否含有细辛属植物材料的检测试剂盒；

所述待测材料为植物材料、中成药、保健品、食品或中药原料药。

本发明的另一方面提供一种细辛属植物材料的快速鉴定方法，包括如下步骤：

(1)以待测材料提取的基因组DNA为模板，采用上述的PCR引物或者上述任一项所述的试剂盒进行PCR扩增，得到PCR产物；

(2)检测所述PCR产物，若检测到目标条带，则待测材料是细辛属植物材料或含有细辛属植物材料；所述目标条带大小为553bp。

优选地，所述的快速鉴定方法，所述PCR扩增的反应体系为：25μl的总反应体系中含有I-5

优选地，所述的快速鉴定方法，所述PCR扩增的反应条件是：98℃预变性2min；98℃变性10s，58℃退火10s，72℃延伸5s，35个循环；72℃延伸2min。

优选地，所述的快速鉴定方法，所述步骤(2)中检测得到的PCR产物的方法为琼脂糖电泳检测。

优选地，采用在含goldview的1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测。

优选地，所述的快速鉴定方法，所述待测材料为疑似含有细辛属植物组织的植物材料、中成药、保健品、食品或中药原料药。

本发明建立了马兜铃科细辛属植物多目标快速鉴定技术体系，具有广泛适用性，能够快速鉴定含有细辛属植物组织的植物材料、中成药、保健品、食品或中药原料药，特异性强、灵敏度高、稳定性强，操作简单、检测快速、检测时间短、准确率高，革新了检验检疫手段和措施，为有效防控监督中草药药品市场掺假销售违法行为提供了强有力的技术支撑；能够减少因误食有毒植物的中毒事件，保护我国草药药品市场的正常发展和市场生态的和谐健康。

附图说明

图1.是本发明的细辛属物种通用检测引物特异性验证结果图；

图2.是与本发明的引物处于相同设计位点的其它三对引物的扩增结果；

图3.是细辛属物种通用检测引物灵敏度检测结果图，其中以单叶细辛A.himalaicum为例。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；所使用的生物化学试剂，如无特殊说明，均为市售常规商品，均可商购获得。

实施例1

一、实验材料

实验样品名称及其来源详见表1和表2，由申请人采集的样品是采集植物叶片晒干置于室温干燥保存备用，采购的药材也干燥保存备用。

表1供试植物样品种类

表2.其它供试材料

二、细辛属植物通用引物的设计

在Bold systerms数据库中检索所有细辛属植物叶绿体基因组序列，共涉及86种。

对搜集的所有细辛属物种的叶绿体基因组序列用DNAMAN软件进行多序列比对，寻找可能设计适合细辛属物种的通用引物的位点；比对发现，位于叶绿体赖氨酸tRNA基因(trnK)高度保守的2个外显子之间的内含子中的植物单拷贝编码基因matK，序列长度约为1500bp，编码参与RNA转录本中II型内含子剪切的成熟酶(maturase)，细辛属物种在该区域高度保守，同时该保守位点又能特异性地区分其他容易与细辛属混淆的同为马兜铃科的马兜铃属植物，以及容易与细辛的药用部分“根”混淆的药材，如白薇、徐长卿等)。

在该位点人工设计了若干引物，并对设计出的引物进行评估、筛选和验证(通用性、特异性和灵敏性)。设计的部分引物对如下(表3)：

表3特异性鉴定细辛属物种的通用引物

三、细辛属物种多目标快速鉴定体系的建立

(1)DNA提取：

首先对表1和表2中待测植物样品进行预处理：取25mg干燥保存的样品，用剪刀剪碎并加液氮碾碎、研磨。利用“新型植物基因组DNA提取试剂盒”(DP320，天根生化科技(北京)有限公司)进行基因组DNA提取，具体操作流程参照说明书，用于后续的引物验证。

(2)引物通用性和特异性验证：

以上述所提取的DNA为模板，利用所设计的引物进行PCR扩增，通过不断调整PCR反应试剂用量以及退火温度、时间等，确定最终的反应体系如下：

扩增反应结束后，取5μl PCR特异的扩增产物在含Goldview(核酸染料)的1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，在紫外灯下观察结果。

凝胶上点样顺序从左到右为分别为：

1单叶细辛A.himalaicum、

2花叶尾花细辛A.caudigerum、

3长毛细辛A.pulchellum、

4大叶马蹄香A.maximum、

5大别山马兜铃A.dabieshanensis、

6西藏马兜铃A.griffithii、

7黄毛马兜铃A.fulvicoma、

8巨花马兜铃A.gigantean、

9美丽马兜铃A.littoralis、

10耳叶马兜铃A.tagala、

11马兜铃A.debilis、

12药材细辛A.heterotropoides、

13药材山慈菇P.yunnanensis、

14药材徐长卿C.panniculatum、

15药材白薇C.atratum、

16药材防己S.tetrandra、

17药材寻骨风A.mollissima、

18药材升麻C.foetida；

M为DNA Ladder。

结果如图1至图2所示，在标准的PCR反应体系和反应条件下，本发明涉及的多对引物中，仅引物对Asa_F/Asa_R能够实现良好的特异性扩增，如图1。图2A,2B,2C为在上述相同位点(即位于叶绿体赖氨酸tRNA基因(trnK)高度保守的2个外显子之间的内含子中的植物单拷贝编码基因matK)同批设计出的另外3对引物(Seq ID No.3-8)的扩增结果，可以看出，相同的PCR反应体系和反应条件下，这些引物均未能实现特异性扩增。

选出的引物对Asa_F/Asa_R仅对细辛属物种发生阳性反应，产生特异性目的条带(1单叶细辛A.himalaicum(有条带)、2花叶尾花细辛A.caudigerum(有条带)、3长毛细辛A.pulchellum(有条带)、4大叶马蹄香A.maximum(有条带)、12药材细辛A.heterotropoides(有条带)为细辛属)；对其余易与细辛属植物混淆的中药材材料(马兜铃属、白薇、徐长卿等)均为阴性反应。

上述结果说明，引物对Asa_F/Asa_R，在细辛属物种内具有良好的通用性，同时能够区分与细辛属植物混淆的中药材材料，可以用于鉴定待测材料是否是细辛属植物材料或者是否含有细辛属植物材料。

Asa_F/Asa_R扩增的目标片段的具体序列信息如下(SEQ ID NO.9)：

其中，单下划线标记处为引物序列部分；双下划线标记处为简并碱基，其中，Y是C或T，K是G或T，R是A或G。

(3)灵敏度检测：

将表1中提取的细辛属物种单叶细辛的基因组DNA用TE缓冲液进行系列稀释，得到7种稀释液；7种稀释液中的基因组DNA浓度为别为：100ng/ul、10ng/ul、1ng/ul、0.1ng/ul、0.01ng/ul、0.001ng/ul、0.001ng/ul；分别以每种稀释液为模板(水为阴性对照)，用特异性引物对Asa_F/Asa_R分别对不同浓度的模板DNA进行PCR扩增。

PCR反应体系和扩增条件同“(2)引物通用性和特异性验证”。

扩增反应结束后，取5μl PCR特异的扩增产物在含goldview的1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，在紫外灯下观察结果。

各个稀释液PCR扩增产物电泳结果(以单叶细辛A.himalaicum为例)见图3，图中标记的1～8分别表示样品浓度分别为100ng/ul、10ng/ul、1ng/ul、0.1ng/ul、0.01ng/ul、0.001ng/ul、0.001ng/ul、ddH

综上，本发明提供的引物和试剂盒能够特异性鉴定含有低含量细辛属植物的材料，可用于对食品、保健品、药材等进行安全检测。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国检验检疫科学研究院

<120> 一种用于细辛属植物材料快速鉴定的PCR引物、试剂盒及其应用

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<170> PatentIn version 3.5

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> Asa_F

<400> 1

tatctctttc tttttttcaa aagg 24

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> Asa_R

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atgggctttt gccaatgagc caatc 25

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 引物2-F

<400> 3

catttctatg ggaaaataga gcatcttg 28

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 引物2-R

<400> 4

cgaatccgaa gaatccgccc ggaa 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 引物3-F

<400> 5

cctaattcaa atagtttcat tagt 24

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 引物3-R

<400> 6

aattttttct ctaataagtt cc 22

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<400> 7

agaccctgtg gttacttaag gatccttttg cg 32

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 引物4-R

<400> 8

gcttggtctg attcgtccga tttt 24

<210> 9

<211> 553

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (108)..(108)

<223> y是c或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (238)..(238)

<223> k是g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (244)..(244)

<223> y是c或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (344)..(344)

<223> k是g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (400)..(400)

<223> y是c或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (481)..(481)

<223> r是a或g

<400> 9

tatctctttc tttttttcaa aagggaatca aagatttttc ttgttcctat ataattctca 60

tatatatgaa tgcgaatccg tattcgtttt tctccgtaaa caatcctytc acttacgatc 120

aacatcctct ggagcctttc ttgagcgaac acatttctat gggaaaatag agcatcttgt 180

agtagtgctt tgtaatgatt ttcagagggc cttgcggttg ttcaaggatc ctttcatkaa 240

ttayctcaga tatcaaggaa aatcaattct ggtttcaaaa gggactcatc ttatgatgaa 300

gaaatggaaa tatcaccttg tcaatttctg gcaatgtaat tttkacttgt ggtctcaacc 360

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aagtttacga aagaatcctt tggtggtcag gagtcatatg ctagataatt cgtttctaat 480

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