一种新型3D生物活性骨修复材料的制备

技术领域

本发明利用气压挤出式3D打印技术结合相分离技术制备PLA多孔支架，通过支架表面包被聚多巴胺(pDA)薄膜促使微球和支架粘附，形成新型3D生物活性骨修复材料。更具体地说，本发明涉及3D打印的PLA多孔支架打印参数筛选以及通过相分离技术观察PLA多孔支架表面形貌，从而获得可以成型、微米级的纤维状粗糙表面和纳米级微孔的PLA多孔支架。

背景技术

载药微球是一类被广泛应用的药物递送载体，通过将药物溶解或分散在微球中制成微米级的小球。载药微球的制备工艺和材料种类较多，常用的制备工艺如喷雾干燥法、乳化交联法、相分离法等等。其中利用微流控技术采用乳液法制备微球，可以得到粒径分布均匀的载药微球，该技术简单高效，材料消耗量小，粒径便于调控，受到广泛关注。微流控装置是一种利用孔径在5-500μm的微孔道，对微量液体进行操纵、控制、处理的技术，广泛应用于微电子、微制作、生物工程等领域。

骨组织工程支架要求具有一定的机械强度以抵抗周围组织的压力，聚乳酸(PLA)是骨组织工程常用的支架材料之一，具有良好的生物相容性和生物降解特性，具有和骨组织相近的机械强度、弹性模量，且具有热成型特性，以往研究利用熔融沉积3D打印技术，于200℃熔化为液态，通过逐层打印、层层叠加，形成具有连通微孔的多孔支架，有利于细胞在支架上生长的营养物质交换和新生骨组织的长入。有研究利用相分离原理采用有机溶剂四氢呋喃(THF)溶解PLA，在低温条件下利用四氢呋喃对PLA溶解性下降的特点，洗涤去除溶剂，使PLA材料表明形成纤维样微观形貌。纳米或微米级的纤维形貌有利于干细胞及成骨细胞粘附生长，但结合相分离和3D打印制备PLA多孔支架的研究鲜有报道。

3D打印技术近年来被广泛用于组织工程多孔支架的制备，3D打印技术是以三维数字模型文件为模版，通过将颗粒或液态材料打印固化，形成单层图案，依次逐层打印最后层层叠加形成三维立体实物。在早期的组织工程研究中，使用发泡法、致孔剂法对PLA进行处理使其形成多孔腔隙，但此类方法对于支架结构不可控，也无法保证孔隙的连通。3D打印方法通过打印网格状的支架，其孔隙率、孔径可控，微孔高度连通，有利于细胞的营养物质交换和新生组织的长入。以往研究多使用熔融沉积工艺的3D打印机高温熔化PLA线材进行打印，利用PLA降温固化的原理使其成型，在本研究中我们才用气压挤出式生物3D打印机，使用气压推动胶体、溶液状材料挤出，该工艺对于溶剂溶解的液态PLA材料有较好的匹配性。在以往的研究中提出，对于支架表面的微观形貌，粗糙表面及纤维状表面有利于细胞粘附和增殖，本研究采用相分离方法在-20℃环境下使材料表面形成微米级纤维状粗糙表面和纳米级微孔。

多巴胺来源于贻贝足丝蛋白，多巴胺基团对于多种表面都具有粘合性能，其粘合机制和与不同物质形成化学键有关，多巴胺的邻苯二酚基团可以与金属离子形成络合键，其酚羟基具有强极性可以与蛋白、多糖等物质形成氢键，且多巴胺氧化后生成邻位二醌容易与羟基、氨基上的活泼氢反应。聚多巴胺薄膜是基于多巴胺固有的儿茶酚基团产生氢键作用、螯合作用反应，是多巴胺溶液经浸涂法，在不同材料表面形成约100nm厚度的聚多巴胺薄膜。

发明内容

本发明利用气压挤出式3D打印技术在低温平台制备多孔支架(PLA/THF)，通过聚多巴胺粘附微球，形成新型3D生物活性骨修复材料。应用于大鼠颅骨，验证了其优越的骨缺损修复。

附图说明

图1为本发明实施例13D打印的PLA多孔支架。

图2为本发明实施例1相分离PLA的微观形貌。

图3为本发明实施例1新型3D生物活性骨修复材料。

图4为本发明实施例2Micro-CT检测图。

图5为本发明实施例2组织学染色。

具体实施方式

以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例1：多孔支架包被聚多巴胺薄膜并粘附微球

材料与实验仪器

Tris，四氢呋喃和N,N-二甲基甲酰胺购自广东光华科技股份有限公司，生物3D打印机购自德国EnvisionTEC。扫描电子显微镜购自日本Hitachi。

打印墨水配置

按下表配置不同比例的四氢呋喃THF和N,N-二甲基甲酰胺DMF作为溶剂，用于配置30％浓度PLA材料。将材料置于样品瓶中40℃磁力搅拌2h至PLA粉末充分溶解，迅速从水浴锅中取出，于通风橱内转移至打印料筒中。

3D打印及相分离

预冷打印平台至4℃或-20℃，于平台上放置贴有打印贴纸的玻璃板防止结霜。

采用气压挤出式生物3D打印机进行3D打印制备多孔支架，通过打印机自带的打印路径规划程序，设置直径6mm、高度2mm的打印区域，0/90°网格打印路径，打印路径间距400μm。将打印料筒装入打印喷头，设置加热温度。待料筒升温至设定温度后进行预挤出，然后校准喷头，采用0.6bar压力、2mm/s打印速度进行打印。对打印条件、材料挤出、支架成型效果进行记录。支架打印后迅速转移至和低温平台温度一致的冰箱内冷冻。经3D打印机打印的多孔支架或挤出材料的样品经冷冻2d后，用离子水洗涤，前2h反复换水洗涤，2h-6h每半小时换水一次，6h-24h约3h换水一次。将支架及材料样品进行喷金后以20kV工作电压进行扫描电镜观察。

多孔支架包被聚多巴胺薄膜并粘附微球

配置多巴胺多巴胺溶液，称取Tris粉末6.02g，加入50mL去离子水中，充分搅拌溶解后加入2mL浓盐酸，再称量加入100mg盐酸多巴胺粉末。测定其pH值处于8.5左右。将3D打印机及相分离处理的多孔支架进行多巴胺溶液浸泡，避光于摇床内振荡过夜。取出支架放置于孔板中，将1mL微流控制备的微球用500μLPBS重悬，滴加于支架表面，无菌环境内静置24h，使微球粘附于支架的聚多巴胺薄膜上，形成新型3D生物活性骨修复材料。后以20kV工作电压进行扫描电镜观察。

结果分析

PLA多孔支架打印参数筛选

利用THF和DMF作为溶剂配置30％PLA的打印墨水，更高的DMF比例会降低THF挥发速度，保证打印喷头不会堵塞，但是过高的DMF比例会导致打印结构塌陷.我们将下表不同THF：DMF比例的打印墨水进行筛选，PLA-4:1、PLA-3:1、PLA-2:1可以形成三维立体结构，其中THF：DMF＝3：1的PLA-3:1组，更有利于材料的连续挤出和支架成型。

PLA多孔支架表面形貌

不同THF和DMF配比作为溶剂溶解的PLA经过3D打印喷头挤出或打印成型后的样品图1，可见支架孔壁厚度为382.54±20.37μm，孔径为408.54±42.37μm。通过SEM观察其表面微观形貌，结果如图2，可见相分离作用使PLA材料表面产生了微米级的纤维状粗糙表面和纳米级的微孔，其中PLA-2:1和PLA-3:1组的微孔结构较明显，PLA-1:1和PLA-2:1由于挤出后材料流动性强，未形成明显的纤维状粗糙表面和微孔，PLA-5:1和PLA组材料凝固快难以挤出，表面形成了纤维状粗糙表面和少量微孔。

综合打印参数筛选和相分离处理的材料表面形貌，THF：DMF＝3：1配比的PLA-3:1组，料筒经30℃预热，打印于-20℃低温平台，可形成微米级的纤维状粗糙表面和纳米级的微孔。

多孔支架通过聚多巴胺粘附微球

如图3经聚多巴胺(pDA)包被的PLA表面形成了一层薄膜，可以粘附滴附于支架表面的PGExo微球，微球的底部可见与pDA发生粘接。

实施例2：SD大鼠颅骨缺损修复

材料和动物：SD大鼠和新型3D生物活性骨修复材料

动物实验模型建模

构建SD大鼠颅骨6mm直径圆形缺损动物实验模型。10周龄SD雄性大鼠，共18只。实验分组为：空白对照组：不植入支架；植入组：导入新型3D生物活性骨修复材料。

颅骨缺损植入修复

将新型3D生物活性骨修复材料植入缺损部位。

体内成骨效果评价

通过Micro-CT、番红固绿组织学染色评价仿生骨支架的体内成骨能力。

结果分析

影像学检测

Micro-CT检测结果如图4，空白对照组未见明显新骨组织的生长，植入组植入后8周，可见新骨组织几乎长满支架孔隙。

组织学染色

如图5，植入4w，植入组有软骨组织周围包绕着骨组织，骨组织形成旺盛。植入8w，植入组软骨已大量矿化，未见红染软骨，骨发生效率更高。