利用SNP标记KZ288479.1_95621鉴别蜂群抗囊状幼虫病性状的方法

技术领域

本发明涉及一种利用SNP标记KZ288479.1_95621鉴别蜂群抗囊状幼虫病性状的方法，具体涉及一种利用SNP标记KZ288479.1_95621鉴别中华蜜蜂抗囊状幼虫病性状的方法，属生物技术领域。

背景技术

蜜蜂病毒性疾病的流行是影响养蜂业健康发展的重要问题，造成全球经济损失。蜜蜂囊状幼虫病（Sacbrood virus, SBV）是威胁中华蜜蜂（

1、遗传标记的研究进展

（1）遗传标记：是表型易于识别的等位基因或遗传物质（郭春燕，2014），遗传标记的发展经历了最初的形态学标记阶段，然后经过细胞学标记、生物化学标记、免疫学标记阶段，一直到现在被广泛使用的分子标记，大体共经过了这五个阶段。外部形态标记与解剖学形态标记都属于形态学标记，都是肉眼可以识别的外部形态特征。细胞学标记是对染色体的形态、数目等方面的分析。生物化学标记则是把生物体内的个别生物化学性状作为遗传标记，比如在蜂学领域使用较多的同工酶标记等。免疫学标记则是以白细胞抗原和红细胞抗原等免疫学的特征作为遗传标记。分子标记的发展主要经历了第一代限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphisms, RFLPs）、第二代的微卫星标记（ShortTandem Repeats, STRs）、第三代的单核苷酸多态性（SNPs）及正在起步发展的第四代基因拷贝数变异（copy number variants, CNVs）。和 SNPs 相比，目前CNVs仍处于发展阶段，虽然和 SNPs 相比没有它的检测技术没有SNPs成熟，但是 CNVs 的核苷含量更多，突变率更高，检测 CNVs 可检测出 SNPs 检测不出的重要位点，两种方法具有互补性（刘小彦等，2016；许晓芳，2012）。

（2）RFLPs 的特点与应用：RFLPs 分析技术可以不考虑显隐性以及环境的影响，被广泛应用于 DNA 多态性的研究。但是 RFLPs 多态性信息含量比较低，操作繁琐，且对于DNA 样本需求多，质量要求高（郭春燕，2014）。

（3）生化遗传标记：同工酶是生化标记的一种，由于遗传差异可以产生多种酶形式。在蜜蜂领域研究比较多的是苹果酸脱氢酶（MDH），该酶由三个等位基因编码：MDH Ⅰ、MDHⅡ和MDH Ⅲ，只有MDH Ⅱ在蜜蜂的不同级型和发育阶段表现出多态性。关迎辉等（1994）研究发现，“浙农大1号”意蜂的MDH Ⅱ杂合度比其他两种意蜂（湖北意蜂和原种意大利蜜蜂）的高，且新发现了其他两种王浆低产意蜂中所没有的aa、ab 基因型，可作为蜂王浆高产蜂种的生化遗传标记。此外，西方蜜蜂的三个蜜蜂亚种的MDH Ⅱ的基因型频率、基因频率及杂合纯合度均存在极显著差异，这一结果表明，可通过测定MDH Ⅱ的基因频率和杂合纯合度从生化遗传角度对不同蜂种进行鉴定。鲍秀良（1997）研究报道，“浙农大1号”意蜂及其他四种意蜂的MDH Ⅱ多态性呈显著性差异。综上可知，蜜蜂的苹果酸脱氢酶Ⅱ（MDH Ⅱ）有可能成为蜂王浆高产性状相关的生化水平的遗传标记。

（4）分子遗传标记：基因多态性是指在生物体中普遍存在的两种或两种以上的基因型或等位基因。“浙农大1号”、平湖和萧山浆蜂均为蜂王浆高产蜂种，张娅娟等（2001）通过对这三个蜂种的蜜蜂进行随机扩增多态DNA-PCR（RAPD-PCR）分析，得到了共同的特异性DNA片段W316bp，这一现象说明该DNA片段可能与蜂王浆高产性状相关。王尉平等（2002）采用RAPD-PCR技术同时分析了3个蜂王浆高产蜂种和王浆低产蜂种卡尼鄂拉蜂的基因多态性，结果在卡尼鄂拉蜂中没有发现W316bp，而在3种蜂王浆高产蜂种中仍检测到，进一步证明了W316bp可作为蜂王浆高产蜂种的遗传标记。戴英等（2003）不仅研究了3种蜂王浆高产蜂种，而且对本地意蜂、黑环系蜜蜂等也进行了研究，采用特征序列扩增区域（SCARs）法对W316bp进行验证，结果与前人的研究一致，表明了W316bp很可能是蜂王浆高产性状相关的一个分子标志。

微卫星DNA是普遍存在于生物体基因组中简单的核苷酸重复序列，微卫星标记是一种广泛应用于动植物育种中的遗传标记。“浙农大1号”意蜂、原种意大利蜜蜂和本地意大利蜜蜂是我国饲养比较多的西方蜜蜂蜂种，具有不同的产浆能力，李建科等（2003）分析了这3种蜜蜂的10个微卫星位点，发现这些微卫星位点在每种蜜蜂中扩增出来的等位基因数均不同，呈现多态性，其中“浙农大1号”意蜂的特有等位基因最多，并根据等位基因频率的分析结果找到了7个可以作为蜂王浆高产蜂种的微卫星标记。

潘娇等（2012）采用覆盖了蜜蜂基因组的基因芯片技术对蜂王浆高产蜂种和低产蜂种进行了分析，筛选出369个差异表达基因，其中上调表达基因201个，下调表达基因168个，通过生物信息学的分析，发现这些基因可能参与了蜜蜂与分泌蜂王浆相关的生物学过程，如嗅觉系统、神经系统、运动系统以及腺体功能发育等。进一步的qPCR检测和相关性分析表明有3个基因（

以上这些关于蜜蜂蜂王浆高产性状相关的研究大多数在蜜蜂基因组测序完成之前进行的，采用的方法比较传统，筛选的范围存在一定的局限性，因而有学者提出质疑。比较可靠的是潘娇等（2012）采用基因芯片技术在蜜蜂基因组范围内筛选出来的3个分子标记，但是采用该方法检测需提取蜜蜂RNA并使用荧光定量仪器，使鉴定过程复杂、成本较高，不利于该方法的普及。

因此，采用强大成熟、更加科学的分子研究技术从基因水平对蜜蜂状进行研究，从而寻找一种操作简单、可靠性高、成本低的方法来鉴别蜜蜂的优良生产性能显得尤为重要。

2、SNP技术

单核苷酸多态性 (SNPs) 被称为第3代DNA分子标记，是指同一位点的不同等位基因之间个别核苷酸的差异，常见的是单个核苷酸的替换，且常发生在嘌呤碱基 (A与G) 和嘧啶碱基 (C与T) 之间。SNP标记可帮助区分两个个体遗传物质的差异，被认为是应用前景最好的遗传标记之一。目前，可以通过提取基因组DNA并随机打断、加上接头、上机测序、生物信息学分析等步骤可以准确获得基因组的SNP信息，筛选出与特异性状相关的SNP分子标记。

刘元珍等（2016）验证筛选出一个可以评估蜂群抗白垩病能力的SNP 分子标记SNP-3。该标记位于

综上所述，中华蜜蜂抗囊状幼虫病性状相关的SNP分子标记的研究成果和文献未见报道。

作为新一代生物技术，虽然SNP技术具有极高的实用价值、在人类疾病领域的应用已取得一定进展。本发明采用SNP技术对中华蜜蜂成年工蜂抗囊状幼虫病性状进行鉴定，据此可以准确、高效、快速地选择抗囊状幼虫病蜜蜂进行育种，为通过分子辅助选育中华蜜蜂培育抗囊状幼虫病蜂种奠定良好基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用SNP标记KZ288479.1_95621鉴别中华蜜蜂蜂群抗囊状幼虫病性状的方法，采用SNP技术对中华蜜蜂成年工蜂抗囊状幼虫病性状进行鉴定，据此以准确、高效、快速地选择抗囊状幼虫病蜜蜂进行育种，为选育中华蜜蜂培育抗囊状幼虫病蜂种奠定良好基础。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

本发明采用SNP位点KZ288479.1_95621来鉴定抗囊状幼虫病蜜蜂的方法是经过严格的筛选和验证的。以中华蜜蜂幼虫为研究对象，提取蜜蜂幼虫样本DNA，然后送至北京百迈克生物技术公司采用Illumina NOVA HisSeq X-Ten技术进行单体型测序和分子标记的开发，进一步进行全基因组关联分析（genome-wide association study，GWAS）。采集中华蜜蜂抗囊状幼虫病、感染囊状幼虫病蜜蜂幼虫样本，通过PCR和DNA测序技术对初步筛选的SNPs进行验证，筛选出KZ288479.1_95621，作为中华蜜蜂抗囊状幼虫病性状相关的分子标记。

> KZ288479.1_95621 SNP position detected on the genome of Apis ceranacerana 1>1000

TGTTATCAATTGAATTAATCAATTCATCAATTGAAATCATAAATATATTTCTTGACCTATCTATTCTATATTTCTTCTAATAATCCTTGTTCCTTTCTACCGTCATCTTTCTTACAAAAAGCTATCGATAGCATATACATTACACGCGAATTCCCTTATCTCCTGATAATTTACATCCTGCGATCAAATCAACCGGTAGTCGCACGCGAGCATGCATTTTCTCTCAACTTATCCGCGCATCACGCGTGAAACGAATCGAAAATACGTCAGTGATCTCCACGATCCCGACACATTGCACTTTCGTTCGTGTTCGAGCATCACTTTTCCAAAGAAACGCCCTCGAACGGTGAAAGCTGTGCGCGGTCCCCTCTCGATTATTTCCTCGATCATTTCCTTGAAGGCGCCGCGCGTGTGGGTGATGACTTGAGAAAAGAAAAAAGACTGGAGGGGCTTTAAAAGAAATTTAATTCTCGACTTGCCTATCGTCTTCCGCCTCTATTGTGAAACGAGGCGAATCAATGCTTCAAGATAGTGTGCATTATCAGTTTCACTGGAGTCGGATGCTTATCAAATCTGGTGGTTTATCTCGAAGTGTATATTCTTCAAACATTTCATTGCTGTTATTCGAAGTGATGCGATGTCATGTGAATCTACGTAGTTAAATTGCGCGCTTGATAGGTACGAAGAGAGAAATTCGAGAAGTTTTTTTGATATGAGCTTCGTGCAAATGCATGTTTCTGAAGAGATAAGATAAAAAATAAAGAGATGGATTGAAATAATTGACTACAATTGGTTGAGATTTGTTATTTAAAGGATTCGAAAAAGAAATATTTTTTATTTCAAGATTAAAAATAATTTGAAACTTAATATAATCATTATAGCAAATTTTAAATATATGATACATACATCAATCCTATTATATATATAATCCTAATAATATGCATTATATATATAATATTAATTAATATTAAACATAAATAATAAAAAGAGTGATTTTTTG。

本发明的利用SNP标记KZ288479.1_95621鉴别中华蜜蜂抗囊状幼虫病性状的方法，步骤如下：

（1）蜜蜂幼虫取样：从被检测的中华蜜蜂蜂群中，收集工蜂幼虫个体，随机取样，每群以100只幼虫代表整个蜂群，将蜜蜂样本放于-80℃冰箱中冷冻备用；

（2）蜜蜂幼虫DNA的提取：分别将步骤（1）中冷冻的幼虫，进行组织破碎，提取基因组DNA，并进行DNA浓度和纯度测定；

（3）合成引物：引物对Primer-F和Primer-R的序列如下：

Primer-F：5’-CCTTGTTCCTTTCTACCGTCA-3’；

Primer-R：5’-AAACATGCATTTGCACGAAG-3’；

（4）PCR检测： 以步骤（2）幼虫DNA为模版，以Primer-F和Primer-R为引物进行PCR；

反应的体系为：总体积25 μL，内含反应混合物Mix 12.5 μL，Primer-F 0.4 μL，Primer-R 0.4 μL，DNA模版 2 μL，ddH

反应的条件为：94 ℃预变性1:15 min/s；94℃变性15 s，57 ℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸5 min；

对PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将出现目的条带的PCR反应液进行测序；

（5）鉴别蜂群抗囊状幼虫病性状：将步骤（4）的测序结果用Burrows-Wheeler Alignerversion (0.7.5a-r405)等软件进行序列比对分析，根据蜂群的C等位基因频率

本发明的优点及有益效果：

1、中华蜜蜂的抗囊状幼虫病能力会受到基因型的影响，而且存在抗囊状幼虫病蜂群中特定等位基因显著高于易感的蜂群。该SNP标记等位基因C基因频率

2、根据统计指标判断蜂群的抗囊状幼虫病能力：蜂群中随机采集的蜜蜂幼虫个体在该SNP位点

3、使用本发明方法目前主要在实验室从分子水平掌握蜜蜂的抗囊状幼虫病机制，检测与抗囊状幼虫病性状相关的分子遗传标记，并结合分子遗传标记辅助蜜蜂品种选育技术，不但能保证选择的准确性，还可以加快蜜蜂品种选育速度，大大提高了选育抗囊状幼虫病蜂种的成功率，可以安全、有效、快速地进行抗囊状幼虫病蜂种的鉴别。

附图说明

附图为蜜蜂抗囊状幼虫病相关的SNP标记KZ288479.1_95621的基因型判断参考峰图。其中：

图1中方框标注的SNP标记基因型为纯合CC，主要存在于抗囊状幼虫病蜂群中；

图2中方框标注的SNP标记基因型为纯合TT，主要存在易感蜂群中；

图3中方框标注的SNP标记基因型为杂合CT，在抗囊状幼虫病、易感蜂群中均有出现。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的阐述。

实施例1

本发明采用的主要试剂如下（所有化学试剂均为分析纯）：

无水乙醇，异丙醇，氯仿，超纯水，全式金Trans DNA Marker I，全式金2×EasyTaq PCRSuperMix，全式金琼脂糖，全式金Gelstain，生工50×TAE电泳缓冲液，核糖核酸快速提取试剂盒SK8222，上下游引物由合成，核酸酶A。

本发明所使用的仪器主要如下：

Axygen 1.5 mL离心管，Axygen PCR管，微波炉，电子天平，震荡器，小型离心机，水浴锅，微量移液枪，电泳仪，ABI公司96孔PCR仪，上海培清科技有限公司凝胶成像分析仪，高速离心机，低温冰箱，高压灭菌锅，NanoDrop 2000等。

一种利用SNP标记KZ288479.1_95621鉴别中华蜜蜂抗囊状幼虫病性状的方法，包括以下步骤：

（1）蜜蜂取样：抗囊状幼虫病蜜蜂幼虫和感染囊状幼虫病蜜蜂幼虫各取100只，收集工蜂幼虫个体，将每个个体分别放在一个离心管中，于-80℃冷冻保存备用；

（2）蜜蜂样本DNA的提取（使用生工公司的动物基因组快速提取试剂盒，SK8222）

（3）合成引物：引物对Primer-F和Primer-R的序列如下

Primer-F：5’-CCTTGTTCCTTTCTACCGTCA-3’，

Primer-R：5’-AAACATGCATTTGCACGAAG-3’。

将其稀释至10 μmol/μL，用后-20℃保存。

（4）PCR检测： 以步骤（2）的每个蜜蜂个体的DNA为模版，以Primer-F和Primer-R为引物进行PCR，对PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将出现目的条带的PCR反应液进行测序。

PCR反应体系(25 μL):

Mix: 12.5 μL

Primer-F: 0.4 μL

Primer-R: 0.4 μL

Template: 2 μL

ddH

反应条件：

（5）SNP标记的筛选和对获得的测序结果分析：

下面是PCR产物的DNA序列，该SNP（KZ288479.1_95621）标记在序列中的位置标记为

5’-CGTCACGCTATCGATAGCATATACATTACACGCGAATTCCCTTATCTCCTGATAATTTACATCCTGCGATCAAATCAACCGGTAGTCGCACGCGAGCATGCATTTTCTCTCAACTTATCCGCGCATCACGCGTGAAACGAATCGAAAATACGTCAGTGATCTCCACGATCCCGACACATTGCACTTTCGTTCGTGTTCGAGCATCACTTTTCCAAAGAAACGCCCTCGAACGGTGAAAGCTGTGCGCGGTCCCCTCTCGATTATTTCCTCGATCATTTCCTTGAAGGCGCCGCGCGTGTGGGTGATGACTTGAGAAAAGAAAAAAGACTGGAGGGGCTTTAAAAGAAATTTAATTCTCGACTTGCCTATCGTCTTCCGCCTCTATC/

查看PCR产物测序峰图，定位该SNP标记在峰图中的位置，基因型峰图标准如图1、图2和图3标记位置，判断每个样本该标记是纯合CC、杂合TT或纯合CT三种类型中的哪种基因型并统计。

（6）利用SNP标记KZ288479.1_95621鉴别中华蜜蜂抗囊状幼虫病性状：将步骤（4）的PCR测序结果用Alignment软件进行序列比对、统计该标记峰图类型，计算出基因型和基因频率，如表1所示。根据分析结果，如果鉴定中华蜜蜂的C等位基因频率显著大于T等位基因频率，可判断中华蜜蜂为抗囊状幼虫病能力强的性状。

表1 不同基因型对中华蜜蜂抗囊状幼虫病能力的影响及基因频率分布情况

表1通过χ

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 利用SNP标记KZ288479.1_95621鉴别蜂群抗囊状幼虫病性状的方法

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tccttcggcc tccagaaa 18

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgaatgtgga tctcttcgtg t 21

<210> 3

<211> 611

<212> DNA

<213> Sample sequenced and SNP validation

<400> 3

cgtcacgcta tcgatagcat atacattaca cgcgaattcc cttatctcct gataatttac 60

atcctgcgat caaatcaacc ggtagtcgca cgcgagcatg cattttctct caacttatcc 120

gcgcatcacg cgtgaaacga atcgaaaata cgtcagtgat ctccacgatc ccgacacatt 180

gcactttcgt tcgtgttcga gcatcacttt tccaaagaaa cgccctcgaa cggtgaaagc 240

tgtgcgcggt cccctctcga ttatttcctc gatcatttcc ttgaaggcgc cgcgcgtgtg 300

ggtgatgact tgagaaaaga aaaaagactg gaggggcttt aaaagaaatt taattctcga 360

cttgcctatc gtcttccgcc tctatccgtg aaacgaggcg aatcaatgct tcaagatagt 420

gtgcattatc agtttcactg gagtcggatg cttatcaaat ctggtggttt atctcgaagt 480

gtatattctt caaacatttc attgctgtta ttcgaagtga tgcgatgtca tgtgaatcta 540

cgtagttaaa ttgcgcgctt gataggtacg aagagagaaa ttcgagaggt ttttttgata 600

tgagcttcgt g 611

<210> 4

<211> 1000

<212> DNA

<213> KZ288479.1_95621 SNP position detected on the genome of Apis ceranacerana 1>1000

<400> 4

tgttatcaat tgaattaatc aattcatcaa ttgaaatcat aaatatattt cttgacctat 60

ctattctata tttcttctaa taatccttgt tcctttctac cgtcatcttt cttacaaaaa 120

gctatcgata gcatatacat tacacgcgaa ttcccttatc tcctgataat ttacatcctg 180

cgatcaaatc aaccggtagt cgcacgcgag catgcatttt ctctcaactt atccgcgcat 240

cacgcgtgaa acgaatcgaa aatacgtcag tgatctccac gatcccgaca cattgcactt 300

tcgttcgtgt tcgagcatca cttttccaaa gaaacgccct cgaacggtga aagctgtgcg 360

cggtcccctc tcgattattt cctcgatcat ttccttgaag gcgccgcgcg tgtgggtgat 420

gacttgagaa aagaaaaaag actggagggg ctttaaaaga aatttaattc tcgacttgcc 480

tatcgtcttc cgcctctatt gtgaaacgag gcgaatcaat gcttcaagat agtgtgcatt 540

atcagtttca ctggagtcgg atgcttatca aatctggtgg tttatctcga agtgtatatt 600

cttcaaacat ttcattgctg ttattcgaag tgatgcgatg tcatgtgaat ctacgtagtt 660

aaattgcgcg cttgataggt acgaagagag aaattcgaga agtttttttg atatgagctt 720

cgtgcaaatg catgtttctg aagagataag ataaaaaata aagagatgga ttgaaataat 780

tgactacaat tggttgagat ttgttattta aaggattcga aaaagaaata ttttttattt 840

caagattaaa aataatttga aacttaatat aatcattata gcaaatttta aatatatgat 900

acatacatca atcctattat atatataatc ctaataatat gcattatata tataatatta 960

attaatatta aacataaata ataaaaagag tgattttttg 1000