一种外泌体分离的快速提取试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地说，本发明涉及一种外泌体分离的快速提取试剂盒。

背景技术

外泌体是一种小膜泡，其包含复杂的RNA和蛋白质，在正常及病理状态下，多种细胞均可分泌外泌体，其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外，在电子显微镜下，可见外泌体由双层磷脂分子包裹，形态呈扁形或球形小体，有些为杯状；其在体液中的存在形式以球形结构为主，通常可在蔗糖密度梯度溶液中密度1.13～1.19g/ml的范围获得富集，目前认为外泌体可由各种类型的细胞分泌，发源于细胞内吞系统中的晚期内体。

外泌体在外周血、尿液、唾液、腹水和羊水等体液中具有很高的丰度，而不同组织来源的外泌体在组成和功能方面存在差异，同时这种差异受到细胞外基质和微环境的动态调控，肿瘤来源或肿瘤相关的外泌体是调控肿瘤发生发展的重要机制，对肿瘤外泌体的分析和检测可以辅助肿瘤的早期诊断、疗效评价和预后分析，此外，外泌体及其修饰加工产物还可以作为基因或药物的有效载体，用于肿瘤治疗。

而外泌体在进行纯化的过程中，通常采用的纯化方法为超离法、低速离心或采用高速离心交替进行纯化，而后即可分离到大小相近的囊泡颗粒，采用超离法纯化操作过程比较简单，而且获得的囊泡数量较多，进而广受欢迎，但是其过程所耗费的时间较长，且回收率不稳定，此外，采用多次交替离心的操作，很可能对获取的囊泡颗粒造成损害，从而降低其质量，并且以上两种方式，均会影响整体纯度，对细胞外泌体的后续应用及研究造成很大影响，所以有必要对现有的细胞外泌体提取方法进行改进，以解决细胞外泌体纯度低的问题。

发明内容

为了克服现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种外泌体分离的快速提取试剂盒，本发明所要解决的技术问题是：采用超离法纯化过程所耗费的时间较长，且回收率不稳定，此外，采用多次交替离心的操作，很可能对获取的囊泡颗粒造成损害，从而降低其质量，并且以上两种方式，均会影响整体纯度的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种外泌体分离的快速提取试剂盒，包括溶液a、溶液b、溶液c和纯化柱，所述溶液a的质量为2.5ml，所述溶液b的质量为2.5ml，所述溶液c的质量为10ml，所述纯化柱的数量为10个。

所述溶液a为Protein A、Protein G或Protein Ni琼脂糖悬液中的一种或两种以上，所述溶液b为TIMD4重组蛋白、TIMD3重组蛋白或Annexin V重组蛋白中的一种或两种以上，所述TIMD4重组蛋白的质量浓度为10-200ug/uL，所述TIMD3重组蛋白的质量浓度为10-200ug/uL，所述Annexin V重组蛋白的质量浓度为10-200ug/uL，所述溶液c为结合增强剂，所述结合增强剂的摩尔浓度为100-1000mol/L，所述纯化柱为羟基磷灰石纯化柱。

一种外泌体快速分离和纯化的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

S1、将需要纯化的外泌体样本使用无血清培养基培养48h，培养48h后将得到的液体进行密度梯度离心，然后再将提纯的液体通过收集管进行高纯度外泌体的收集，结束后收集2ml细胞上清液，以3000g，温度为4℃离心15min，去除细胞上清液中的残留细胞或细胞碎片，然后将离心后的上清液使用0.2μm滤器过滤，并将上清液转移至干净的10ml玻璃试管中，以去除较大的囊泡，并放置于冰上以备后续的使用。

S2、另取一支干净的10ml玻璃试管，取溶液a0.125ml、溶液b0.125ml和溶液c0.5ml，震荡5-10s，进行均匀混合，得到0.75ml的abc混合液，并向每2ml的上清液中加入0.75ml的abc混合液，然后利用柱平衡液处理羟基磷灰石纯化柱，使纯化柱上各基团处于活化状态，然后将羟基磷灰石纯化柱加入玻璃试管中。

S3、盖上管盖，置于振荡器中剧烈震荡30s，并在4℃的温度下孵育30min，使得玻璃试管中的样品形成从低到高连续分布的密度阶层，然后使用提取管吸掉上层或下层溶液，并将剩余样品转入1.5ml的离心管中，以3000-5000g离心3min，使得样品再次形成从低到高连续分布的密度阶层，并弃掉上清与下层溶液，然后将剩余样品转入0.5ml的离心管中，以3000-5000g离心3min，使得样品可以形成3层溶液，并弃掉上层与下层溶液。

S4、打开离心管盖，放置10min等待自然晾干，然后加入4倍沉淀体积的1×PBS，反复吹打重悬沉淀，使其完全分散，于水平摇床上高速孵育5min，再次反复吹打重悬沉淀，使其完全分散，再次置于水平摇床上高速孵育5min，孵育完成之后以5000g离心5min，将上清液吸出来置于纯化柱中，剩余沉淀于4℃保留，将纯化柱以1000g离心5min，收集得到的过滤液，即是溶于PBS的外泌体。

作为本发明的进一步方案：所述S1中对于增殖速度较快的细胞，可以在使用无血清培养基培养之前对其进行1:2的稀释，对于大规模培养的细胞进行检测时，可以先稀释至1×10^5cells/ml。

作为本发明的进一步方案：所述S4中吸出上清液的过程中不得吸到沉淀，所述S4中最后得到的溶于PBS的外泌体可继续用于后续实验或于4℃的条件下暂存，长期保存需要在-80℃的冰箱中，三月内使用即可。

作为本发明的进一步方案：所述羟基磷灰石纯化柱中羟基磷灰石用量为10-100mg，并经柱平衡液对其进行活化，其中，柱平衡液为1-10mM NaPO，pH为6.5-7.5。

作为本发明的进一步方案：所述试剂盒可用于血液、尿液、唾液、积液等体液以及细胞培养液的外泌体提取和纯化。

作为本发明的进一步方案：所述试剂盒可用于人源、大鼠、小鼠、兔子等哺乳动物体液的外泌体提取和纯化。

本发明的有益效果在于：

本发明通过采用羟基磷灰石纯化柱可以提取过滤液，此溶液即为溶于PBS的外泌体，采用该试剂盒可以快速的从血清、血浆和细胞培养上清中提取外泌体，满足了高效提取的需求，同时本方法操作简单，无需超离或重复离心法即可完成抽提和纯化，大大缩短了纯化时间，而且回收率更为稳定，采用此方式可以从2-4ml细胞上清液中可获得200-400ng外泌体蛋白或50-200ng外泌体RNA，使得提取囊泡的富集量大，并且还可以提高提取的纯度，保障了整体的质量，使得本发明还具有成本低、便于保存和运输方便的特点，并且可以适用于血清、尿液、唾沫、积水等体液以及细胞培养液进行外泌体的抽提和纯化。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

一种外泌体分离的快速提取试剂盒，包括溶液a、溶液b、溶液c和纯化柱，溶液a的质量为2.5ml，溶液b的质量为2.5ml，溶液c的质量为10ml，纯化柱的数量为10个。

溶液a为Protein A、Protein G或Protein Ni琼脂糖悬液中的一种或两种以上，溶液b为TIMD4重组蛋白、TIMD3重组蛋白或Annexin V重组蛋白中的一种或两种以上，TIMD4重组蛋白的质量浓度为10-200ug/uL，TIMD3重组蛋白的质量浓度为10-200ug/uL，Annexin V重组蛋白的质量浓度为10-200ug/uL，溶液c为结合增强剂，结合增强剂的摩尔浓度为100-1000mol/L，纯化柱为羟基磷灰石纯化柱。

一种外泌体快速分离和纯化的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

S1、将液体通过收集管进行高纯度外泌体的收集，结束后收集2ml细胞上清液，以3000g，温度为4℃离心15min，去除细胞上清液中的残留细胞或细胞碎片，然后将离心后的上清液使用0.2μm滤器过滤，并将上清液转移至干净的10ml玻璃试管中，以去除较大的囊泡，并放置于冰上以备后续的使用。

S2、另取一支干净的10ml玻璃试管，取溶液a0.125ml、溶液b0.125ml和溶液c0.5ml，震荡5-10s，进行均匀混合，得到0.75ml的abc混合液，并向每2ml的上清液中加入0.75ml的abc混合液。

S3、盖上管盖，置于振荡器中剧烈震荡30s，并在4℃的温度下孵育30min，使得玻璃试管中的样品形成从低到高连续分布的密度阶层，然后使用提取管吸掉上层或下层溶液，并将剩余样品转入1.5ml的离心管中，以3000-5000g离心3min，使得样品再次形成从低到高连续分布的密度阶层，并弃掉上清与下层溶液，然后将剩余样品转入0.5ml的离心管中，以3000-5000g离心3min，使得样品可以形成3层溶液，并弃掉上层与下层溶液。

S4、打开离心管盖，放置10min等待自然晾干，然后加入4倍沉淀体积的1×PBS，反复吹打重悬沉淀，使其完全分散，于水平摇床上高速孵育5min，再次反复吹打重悬沉淀，使其完全分散，再次置于水平摇床上高速孵育5min，孵育完成之后以5000g离心5min，将上清液吸出来置于纯化柱中，剩余沉淀于4℃保留，将纯化柱以1000g离心5min，收集得到的过滤液，即是溶于PBS的外泌体。

S1中对于增殖速度较快的细胞，可以在使用无血清培养基培养之前对其进行1:2的稀释，对于大规模培养的细胞进行检测时，可以先稀释至1×10^5cells/ml。

S4中吸出上清液的过程中不得吸到沉淀，S4中最后得到的溶于PBS的外泌体可继续用于后续实验或于4℃的条件下暂存，长期保存需要在-80℃的冰箱中，三月内使用即可。

羟基磷灰石纯化柱中羟基磷灰石用量为10-100mg，并经柱平衡液对其进行活化，其中，柱平衡液为1-10mM NaPO，pH为6.5-7.5。

试剂盒可用于血液、尿液、唾液、积液等体液以及细胞培养液的外泌体提取和纯化。

试剂盒可用于人源、大鼠、小鼠、兔子等哺乳动物体液的外泌体提取和纯化。

实施例2：

一种外泌体分离的快速提取试剂盒，包括溶液a、溶液b、溶液c和纯化柱，溶液a的质量为2.5ml，溶液b的质量为2.5ml，溶液c的质量为10ml，纯化柱的数量为10个。

溶液a为Protein A、Protein G或Protein Ni琼脂糖悬液中的一种或两种以上，溶液b为TIMD4重组蛋白、TIMD3重组蛋白或Annexin V重组蛋白中的一种或两种以上，TIMD4重组蛋白的质量浓度为10-200ug/uL，TIMD3重组蛋白的质量浓度为10-200ug/uL，Annexin V重组蛋白的质量浓度为10-200ug/uL，溶液c为结合增强剂，结合增强剂的摩尔浓度为100-1000mol/L，纯化柱为羟基磷灰石纯化柱。

一种外泌体快速分离和纯化的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

S1、将需要纯化的外泌体样本使用无血清培养基培养48h，培养48h后将得到的液体进行密度梯度离心，然后再将提纯的液体通过收集管进行高纯度外泌体的收集，结束后收集2ml细胞上清液，以3000g，温度为4℃离心15min，去除细胞上清液中的残留细胞或细胞碎片，然后将离心后的上清液使用0.2μm滤器过滤，并将上清液转移至干净的10ml玻璃试管中，以去除较大的囊泡，并放置于冰上以备后续的使用。

S2、另取一支干净的10ml玻璃试管，取溶液a0.125ml、溶液b0.125ml和溶液c0.5ml，震荡5-10s，进行均匀混合，然后利用柱平衡液处理羟基磷灰石纯化柱，使纯化柱上各基团处于活化状态，然后将羟基磷灰石纯化柱加入玻璃试管中。

S3、盖上管盖，置于振荡器中剧烈震荡30s，并在4℃的温度下孵育30min，使得玻璃试管中的样品形成从低到高连续分布的密度阶层，然后使用提取管吸掉上层或下层溶液，并将剩余样品转入1.5ml的离心管中，以3000-5000g离心3min，使得样品再次形成从低到高连续分布的密度阶层，并弃掉上清与下层溶液，然后将剩余样品转入0.5ml的离心管中，以3000-5000g离心3min，使得样品可以形成3层溶液，并弃掉上层与下层溶液。

S4、打开离心管盖，放置10min等待自然晾干，然后加入4倍沉淀体积的1×PBS，反复吹打重悬沉淀，使其完全分散，将上清液吸出来置于纯化柱中，剩余沉淀于4℃保留，将纯化柱以1000g离心5min，收集得到的过滤液，即是溶于PBS的外泌体。

S1中对于增殖速度较快的细胞，可以在使用无血清培养基培养之前对其进行1:2的稀释，对于大规模培养的细胞进行检测时，可以先稀释至1×10^5cells/ml。

S4中吸出上清液的过程中不得吸到沉淀，S4中最后得到的溶于PBS的外泌体可继续用于后续实验或于4℃的条件下暂存，长期保存需要在-80℃的冰箱中，三月内使用即可。

羟基磷灰石纯化柱中羟基磷灰石用量为10-100mg，并经柱平衡液对其进行活化，其中，柱平衡液为1-10mM NaPO，pH为6.5-7.5。

试剂盒可用于血液、尿液、唾液、积液等体液以及细胞培养液的外泌体提取和纯化。

试剂盒可用于人源、大鼠、小鼠、兔子等哺乳动物体液的外泌体提取和纯化。

实施例3：

一种外泌体分离的快速提取试剂盒，包括溶液a、溶液b、溶液c和纯化柱，溶液a的质量为2.5ml，溶液b的质量为2.5ml，溶液c的质量为10ml，纯化柱的数量为10个。

溶液a为Protein A、Protein G或Protein Ni琼脂糖悬液中的一种或两种以上，溶液b为TIMD4重组蛋白、TIMD3重组蛋白或Annexin V重组蛋白中的一种或两种以上，TIMD4重组蛋白的质量浓度为10-200ug/uL，TIMD3重组蛋白的质量浓度为10-200ug/uL，Annexin V重组蛋白的质量浓度为10-200ug/uL，溶液c为结合增强剂，结合增强剂的摩尔浓度为100-1000mol/L，纯化柱为羟基磷灰石纯化柱。

一种外泌体快速分离和纯化的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

S1、将需要纯化的外泌体样本使用无血清培养基培养48h，培养48h后将得到的液体进行密度梯度离心，然后再将提纯的液体通过收集管进行高纯度外泌体的收集，结束后收集2ml细胞上清液，以3000g，温度为4℃离心15min，去除细胞上清液中的残留细胞或细胞碎片，然后将离心后的上清液使用0.2μm滤器过滤，并将上清液转移至干净的10ml玻璃试管中，以去除较大的囊泡，并放置于冰上以备后续的使用。

S2、另取一支干净的10ml玻璃试管，取溶液a0.125ml、溶液b0.125ml和溶液c0.5ml，震荡5-10s，进行均匀混合，得到0.75ml的abc混合液，并向每2ml的上清液中加入0.75ml的abc混合液，然后利用柱平衡液处理羟基磷灰石纯化柱，使纯化柱上各基团处于活化状态，然后将羟基磷灰石纯化柱加入玻璃试管中。

S3、盖上管盖，置于振荡器中剧烈震荡30s，并在4℃的温度下孵育30min，使得玻璃试管中的样品形成从低到高连续分布的密度阶层，然后使用提取管吸掉上层或下层溶液，并将剩余样品转入1.5ml的离心管中，以3000-5000g离心3min，使得样品再次形成从低到高连续分布的密度阶层，并弃掉上清与下层溶液，然后将剩余样品转入0.5ml的离心管中，以3000-5000g离心3min，使得样品可以形成3层溶液，并弃掉上层与下层溶液。

S4、打开离心管盖，放置10min等待自然晾干，然后加入4倍沉淀体积的1×PBS，反复吹打重悬沉淀，使其完全分散，于水平摇床上高速孵育5min，再次反复吹打重悬沉淀，使其完全分散，再次置于水平摇床上高速孵育5min，孵育完成之后以5000g离心5min，剩余沉淀于4℃保留，所得出即是溶于PBS的外泌体。

S1中对于增殖速度较快的细胞，可以在使用无血清培养基培养之前对其进行1:2的稀释，对于大规模培养的细胞进行检测时，可以先稀释至1×10^5cells/ml。

S4中吸出上清液的过程中不得吸到沉淀，S4中最后得到的溶于PBS的外泌体可继续用于后续实验或于4℃的条件下暂存，长期保存需要在-80℃的冰箱中，三月内使用即可。

羟基磷灰石纯化柱中羟基磷灰石用量为10-100mg，并经柱平衡液对其进行活化，其中，柱平衡液为1-10mM NaPO，pH为6.5-7.5。

试剂盒可用于血液、尿液、唾液、积液等体液以及细胞培养液的外泌体提取和纯化。

试剂盒可用于人源、大鼠、小鼠、兔子等哺乳动物体液的外泌体提取和纯化。

对比例1：

采用现有的外泌体分离试剂盒进行纯化分离。

根据实施例1-3得出下表：

最后应说明的几点是：虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明的基础上，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。