一种抗糖尿病肾病的药物及应用

技术领域

本发明涉及基因工程抗体技术领域，具体涉及一种抗糖尿病肾病的药物及应用。

背景技术

随着生活水平的提高，糖尿病已成为全球危害性最大的慢性疾病之一。糖尿病肾病(diabeticnephropathy，DN)是糖尿病常见的、严重的微血管并发症，临床上超过1/3的糖尿病患者伴发DN，并最终发展为终末期肾脏疾病(endstagerenal disease，ESRD)，成为糖尿病致死、致残的主要因素。近十几年来在我国DN发病率急剧上升，成为导致肾脏替代治疗的第二位病因，严重危害人类健康的同时造成了巨大的经济负担。

目前，DN临床治疗较为棘手，且尚缺乏特异性、针对性的治疗药物，目前多采用控制血糖、调节血脂、抗氧化、血管紧张素转化酶抑制剂和钙拮抗剂等综合治疗，但仍难以阻止肾功能的持续减退。因此，积极探索DN的作用靶点及治疗药物，对于DN防治具有十分重要的现实意义。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供抗糖尿病肾病的药物及应用，具体是通过以下技术方案得以实现的：

一种抗糖尿病肾病的药物，其是2-十二烷基-6-甲氧基-2，5-二烯-1，4-环己二酮。

进一步的，所述2-十二烷基-6-甲氧基-2，5-二烯-1，4-环己二酮，是从杨桃根中经回流提取和硅胶柱分离后得到的单体活性成分。

进一步的，所述回流提取，是乙醇加热回流提取。

进一步的，所述硅胶柱分离，是在开放硅胶柱上，用不同比例的环己烷-乙酸乙酯溶液进行洗脱。

所述的抗糖尿病肾病的药物的制备方法，具体步骤如下：

(1)取晒干的杨桃根药材，粉碎成粗粉，加8倍量乙醇-水(3：2)，浸泡30分钟，常压下直接加热回流提取3次，每次1小时，滤过，合并醇提取液，并在60℃条件下减压回收乙醇，浓缩液分别用3倍量的环己烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，分别合并萃取液；在室温下，减压浓缩、干燥，分别得环己烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取物及残留物；

(2)取环己烷萃取物，与等重量层析硅胶混匀后，装在10倍量的开放硅胶柱上，在室温条件下，用不同比例的环己烷-乙酸乙酯溶液(100:0，20:1，18:1，15:1，12:1，10:1，8:1，5:1，3:1，1:1，0:100)各洗脱4个柱体积，经TLC法检测，将相同的馏份合并，得到8个组份；

(3)选取2-十二烷基-6-甲氧基-2，5-二烯-1，4-环己二酮所在组分再与等质量层析硅胶混匀后，装在10倍量的开放硅胶柱上，在室温条件下，用不同比例的环己烷-乙酸乙酯溶液(100:0，20:1，18:1，15:1)各洗脱4个柱体积，得到4个组分，选取2-十二烷基-6-甲氧基-2，5-二烯-1，4-环己二酮所在组分，用甲醇加热反复溶解、重结晶，即得到2-十二烷基-6-甲氧基-2，5-二烯-1，4-环己二酮纯品。

进一步的，所述开放硅胶柱规格为：3×80cm，200–300目。

进一步的，所述步骤(2)，其中洗脱4个柱体积，具体为：4×0.5L。

进一步的，所述步骤(3)，其中洗脱4个柱体积，具体为：4×0.25L

所述的抗糖尿病肾病的药物在制备糖尿病药物中的应用，尤其是在之类抗糖尿病肾病的药物中的应用。

中草药在中国已经有几千年的应用历史，为中华民族强身健体、治疗疾病做出不朽的贡献，是中华民族的瑰宝。我们科研团队前期开展了大量的抗DN中草药及其活性成分的筛选研究工作。经过多年大量的筛查，我们首次从酢浆草科属植物杨桃根AverrhoacarambolaL.中分离鉴定出一种活性成份，即2-十二烷基-6-甲氧基-2,5-二烯-1,4-环己二酮(DMDD)，其在抗DN方面显示出非常好的潜在应用前景。目前，DN的发生及进展机制的仍需深入研宄，多认为是遗传、环境和自身免疫因素相互作用的结果，糖脂代谢紊乱、肾脏内肾素-血管紧张素(RAS)系统激活、炎症反应及氧化应激等因素在遗传背景下相互作用，引起肾小球系膜细胞增生、基底膜增厚，最终导致肾小球硬化。目前已明确，调控炎症“瀑布样”级联反应、IR、足细胞损伤及EMT是抗DN的重要措施，而TLR介导的MyD88依赖途径是新近发现的可诱导DN的通路，那么采用药物或生物工程技术干预TLR介导的MyD88依赖途径或将为DN的治疗提供新的思路。我们在前期工作的基础上，以干预TLR4为靶向，TLR4信号通路调控为切入点，从多层次、多角度对杨桃根DMDD抗DN进行深入探讨，力求全面揭示其抗DN的作用机制，为其治疗DN提供实验依据和理论支持。

本发明人对杨桃根进行了长期大量的药效学研究。在此研究基础上，对杨桃根提取物2-十二烷基-6-甲氧基-2，5-二烯-1，4-环己二酮(DMDD)的研究发现，其对糖尿病肾病有明显的治疗作用。本发明有可能为糖尿病肾病患者提供新的抗糖尿病肾病药物。

结果发现：

与现有技术相比，本发明创造的技术效果体现在：

①DMDD减轻糖尿病小鼠体重下降速度。

②DMDD能降低糖尿病肾病小鼠的空腹血糖。

③DMDD降低糖尿病小鼠的血清肌酐、尿素氮以及胱抑素C，对肾功能具有保护作用。

④DMDD降低总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)，升高高密度脂蛋白(HDL)，改善糖尿病小鼠的血脂紊乱情况。

⑤DMDD降低肾脏组织TNF-a、IL-6、IL-1、MCP-1等炎症指标。

⑥DMDD能降低糖尿病肾病小鼠尿蛋白，改善糖尿病肾病。结果表明，DMDD对糖尿病肾病小鼠有治疗作用。

⑦通过本申请的提取方案得到的DMDD纯度较高活性较好。

附图说明

图1是各组小鼠体重变化情况(

图2是各组小鼠血糖变化情况(

图3是各组血清胰岛素含量及胰岛素抵抗指数、胰岛素敏感指数变化情况(

图4是DMDD对肾组织重量的影响。

图5是DMDD对尿蛋白的影响。

具体实施方式

下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。

实施例

糖尿病肾病小鼠模型：以高糖高脂饲料联合低剂量STZ诱导的野生TLR4小鼠及敲除TLR4基因(TLR4-/-)的小鼠模型，随机分为模型组，格列喹酮(10mg·kg

DMDD的制备：取晒干的杨桃根药材12kg，粉碎成粗粉，加8倍量乙醇-水(3：2)，浸泡30分钟，常压下直接加热回流提取3次(3×96L)，每次1小时，滤过，合并醇提取液，并在60℃条件下减压回收乙醇，浓缩液分别用3倍量的环己烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，分别合并萃取液；在室温下，减压浓缩、干燥，分别得环己烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取物及残留物。

取环己烷萃取物(10.3g)，与10g层析硅胶混匀后，装在10倍量的开放硅胶柱上(3×80cm，200–300目)，在室温条件下，用不同比例的环己烷-乙酸乙酯溶液(100:0，20:1，18:1，15:1，12:1，10:1，8:1，5:1，3:1，1:1，0:100)各洗脱4个柱体积(4×0.5L)，经TLC法检测，将相同的馏份合并，得到8个组份Fr.1(0-3.0L，0.1g)，Fr.2(3.0-4.6L，1.4g)，Fr.3(4.6-5.6L，0.8g)，Fr.4(5.6-6.4L，5.0g)，Fr.5(6.4-8.4L，1.4g)，Fr.6(8.4-15.0L，0.9g)，Fr.7(15.0-16.6L，0.7g)，Fr.8(16.6-17.6L，0.1g)。

Fr.4(5.0g)再与5g层析硅胶混匀后，装在10倍量的开放硅胶柱上(3×80cm，200–300目)，在室温条件下，用不同比例的环己烷-乙酸乙酯溶液(100:0，20:1，18:1，15:1)各洗脱4个柱体积(4×0.25L)，得到4个馏份Fr.41-44；Fr.44馏份中的结晶，用甲醇加热反复溶解、重结晶，即得到DMDD纯品2350mg。

1.DMDD对糖尿病小鼠体重的影响

本实验期间，正常组小鼠体重逐渐增加，糖尿病模型组小鼠体重逐渐下降；与同时期模型组小鼠比较，给予格列喹酮和DMDD治疗后，糖尿病小鼠的体重逐步增加(P<0.05)。WT型小鼠和KO型小鼠体重变化趋势大致相同，未见明显差异。结果见表1和图1.

表1 各组小鼠体重变化情况(g，

注：WT表示TLR4野生型小鼠，KO表示TLR4-/-敲除型小鼠；NC表示正常组，DN表示糖尿病模型组，G表示格列喹酮组(10mg.kg

2.DMDD对血糖的影响

与正常组小鼠比较，糖尿病小鼠血糖明显升高。阳性组小鼠予格列喹酮，DMDD各给药组予不同剂量DMDD，随着给药实验的延长，格列喹酮组和DMDD高剂量糖尿病小鼠血糖明显下降(P<0.05)。给予格列喹酮和DMDD后，同时期的WT糖尿病小鼠和KO糖尿病小鼠血糖变化趋势未见明显差异(P>0.05)。结果见表2和图2.

表2 各组小鼠血糖变化情况(μmol/L，

注：WT表示TLR4野生型小鼠，KO表示TLR4-/-敲除型小鼠；NC表示正常组，DN表示糖尿病模型组，G表示格列喹酮组(10mg.kg

3.DMDD对糖耐量和胰岛素抵抗的影响

小鼠隔夜禁食16h后，腹腔注射予25％葡萄糖，测定予葡萄糖后0min，15min，30min，60min，120min的血糖水平，通过此实验检测各组小鼠对高糖的调节能力。实验发现，予葡萄糖后15min，30min，60min各组小鼠血糖水平均有升高的趋势，与正常组比较，模型组小鼠血糖水平明显升高(P<0.05)；与模型组比较，经格列喹酮和DMDD干预后的糖尿病小鼠血糖水平明显下降(P<0.05)。结果见表3。

腹腔注射胰岛素30min，60min后，各组小鼠血糖水平普遍下调，90min后血糖水平回升。与正常组小鼠比较，模型组小鼠血糖明显升高(P<0.05)；与模型组小鼠比较，格列喹酮组和DMDD各剂量组小鼠血糖明显下调(P<0.05)。结果见表4。

表3 各组小鼠糖耐量变化情况(μmol/L，

表4 各组小鼠胰岛素抵抗变化情况(μmol/L，

注：WT表示TLR4野生型小鼠，KO表示TLR4-/-敲除型小鼠；NC表示正常组，DN表示糖尿病模型组，G表示格列喹酮组(10mg.kg

4.DMDD对血清胰岛素含量及胰岛素抵抗指数、胰岛素敏感指数的影响

与正常组比较，模型组胰岛素含量明显增加，予格列喹酮和DMDD后，糖尿病小鼠的血清胰岛素含量明显下降，DMDD低剂量血清胰岛素含量下降趋势不明显。胰岛素抵抗指数(Insulin Resistance Index,IRI)＝空腹血糖(FBG)*血清胰岛素(FINS)/22.5；胰岛素敏感指数(Insulin Sensitivity Index,ISI)＝ln(1/FBG*FINS)

5.DMDD对肾脏指标的影响

实验发现，与正常组小鼠比较，模型组小鼠的血清胱抑素-C(Cys-C)、血清肌酐(Serum creatinine，Scr)及尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)的水平明显升高(P<0.05)，给予DMDD治疗后，与模型组比较，DMDD高剂量、中剂量组的Scr、BUN、Cys-C的含量下降(P<0.05)。说明DMDD治疗后，糖尿病小鼠的肾功能得到明显改善。结果见表5.

表5 各组小鼠血清肌酐、尿素氮、胱抑素-C变化情况(

注：WTmice表示TLR4野生型小鼠，KO mice表示TLR4-/-敲除型小鼠；NC表示正常组，DN表示糖尿病模型组，G表示格列喹酮组(10mg.kg

6.DMDD对肾组织重量的影响

实验结果发现，与正常组小鼠比较，模型组糖尿病小鼠肾组织重量明显增加(P<0.05)，而DMDD治疗后，阳性组和DMDD给药组的肾重明显减小(P<0.05)。同组别的WT和KO型小鼠肾重未见明显差异(P>0.05)。结果见图4。

8 DMDD对尿蛋白的影响

尿蛋白作为糖尿病肾病的重要指标，在DN早期主要表现为微量蛋白尿，随着DN损伤加重，蛋白尿的分泌持续性增多。本实验发现，与正常组小鼠比较，模型组小鼠尿蛋白明显增加(P<0.05)；而予格列喹酮和DMDD治疗4周的糖尿病小鼠，其尿蛋白明显减少(P<0.05)。然而，同组小鼠，WT型和KO型比较，尿蛋白量未见明显差异(P>0.05)。结果见图5。

9 各组小鼠血清TC、TG、LDL、HDL含量变化情况

本实验通过测定血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)的含量检测血脂紊乱情况。实验发现，与正常组比较，模型组的TC、TG、LDL水平明显升高(P<0.05)，与模型组比较，格列喹酮组和DMDD高剂量组和中剂量组的TC、TG、LDL指标含量明显下降(P<0.05)；与正常组比较，模型组HDL含量明显下降(P<0.05)；与模型组比较，予格列喹酮和DMDD治疗的糖尿病小鼠，HDL水平明显升高(P<0.05)。说明DMDD能较好改善血脂紊乱的现象，对糖尿病引起的血脂紊乱具有保护作用。结果见表6。

表6 各组小鼠血清TC、TG、LDL、HDL含量变化情况(

注：WT mice表示TLR4野生型小鼠，KO mice表示TLR4-/-敲除型小鼠；NC表示正常组，DN表示糖尿病模型组，G表示格列喹酮组(10mg.kg

10 DMDD对炎症指标的影响

本实验测定TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10及MCP-1等炎症指标，实验结果表明，与正常组比较，模型组小鼠炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β及MCP-1的水平均明显提高(P<0.05)，而抑炎因子IL-10明显降低(P<0.05)；予DMDD后，TNF-α、IL-6、IL-1β及MCP-1等炎症因子的水平明显下降(P<0.05)，而IL-10的含量明显升高(P<0.05)，说明DMDD具有较好的抗炎作用。结果见表。

表7 DMDD对TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10及MCP-1炎症指标的影响(

注：WT mice表示TLR4野生型小鼠，KO mice表示TLR4-/-敲除型小鼠；NC表示正常组，DN表示糖尿病模型组，G表示格列喹酮组(10mg.kg

最后，应当指出，以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。